약물 치료 후 간세포암 오르가노이드의 생성 및 단세포 전사체 분석

우리는 HCC 오가노이드가 약물 치료에 어떻게 반응하는지, 그리고 그들의 번역 연구가 실제로 어떻게 변화하는지에 초점을 맞추고 있습니다. 이 프로토콜은 HCC 오가노이드에 유용하며, 다른 종양 오가노이드 시스템에도 적용할 수 있습니다. 우선, 간세포암 또는 HCC 환자 유래 오가노이드를 확립하고 치료적 교란을 준비합니다.

제조사 지침에 따라 렌바티닙 스톡 용액을 디메틸 황산화물(DMSO)에 준비하세요. 사용 직전에 미리 정의된 작업 농도로 육수 용액을 예열된 배양지에 희석하세요. 모든 웰에서 최종 부피가 균등하도록 충분한 용액을 준비하여 각 웰에서 동일한 DMSO 농도를 유지하도록 하세요.

다음으로, 각 웰 벽을 따라 20마이크로몰라 크기의 렌바티닙 함유 배지를 추가하여 매트릭스 돔을 방해하지 않도록 합니다. 최종 DMSO 농도가 동일한 차량 대조군을 포함하세요. 표준 배양 조건에서 미리 정해진 처리 기간 동안 오가노이드를 배양합니다.

72시간을 초과하는 처리의 경우, 약물 함유 배지를 48시간에서 72시간마다 교체하여 모든 웰에서 일관된 교체 일정을 보장합니다. 치료 전에 명야 기초 영상을 기록하세요. 동일한 현미경 설정, 배율, 시야 위치를 사용하여 치료 중 일정한 간격으로 이미지를 획득합니다.

형태학 기반 치료 반응 평가를 위해서는 모든 이미지에 동일한 노출 설정, 확대율 및 분석 임계치를 사용하세요. 각 시점에서 우물 또는 필드별 총 오르가노이드 면적을 계산하고 기준선으로 정규화하여 오가노이드 면적 성장 곡선을 측정합니다. 평균 오가노이드 직경을 측정하려면, 개별 온전한 오가노이드의 직경을 측정하고 우물당 평균 값을 계산합니다.

다음으로, 형태학적으로 식별 가능한 온전한 오가노이드를 세어 잔해나 붕괴된 조각은 제외하여 생존한 오르가노이드 수를 결정합니다. 제조사 지침에 따라 추가 대량 생존 평가가 필요한 경우 치료 종점에서 3차원 발광 생존 가능성 검사를 수행하십시오. 그 다음, 시간에 따른 오르가노이드 면적 성장 곡선을 그립니다.

차량 처리군과 렌바티닙 처리군 간 평균 오가노이드 직경을 비교하라. 또한, 처리 그룹 간 생존 오가노이드 수를 비교하세요. 일관된 영상 일정, 포함 기준 및 분석 매개변수를 사용하여 재현성을 보장하세요.

3D 형태가 온전하고, 단일 세포 포획에 충분한 물질을 보유하며, 눈에 띄는 오염이 없는 오가노이드 웰을 선택하세요. 동일한 현미경 설정, 배율 및 필드 선택 기준을 사용하여 해리 이전에 각 선정된 대상의 밝은 필드 이미지를 기록합니다. 대조군과 처리군 간에 일치하는 시점에 오가노이드를 채취하며, 모든 샘플에서 동일한 도금 밀도, 처리 일정, 중간 교체 조건을 유지합니다.

각 웰에서 배양지를 완전히 흡입하세요. 각 웰을 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척해 잔여 매질과 이물질을 제거하세요. 각 웰에 얼음 냉각 세포 회수 용액 1밀리리터를 추가하고, 얼음 위에서 20분에서 30분간 배양합니다.

배양 기간 동안 5분에서 7분마다 부드럽게 피펫을 사용해 매트릭스 용해를 촉진합니다. 넓은 보어나 절단된 피펫 팁을 사용해 미리 냉각된 튜브로 용해된 물질을 옮겨 가루 응력을 최소화합니다. 기질이 거의 용해되고 최소 정도의 가시 겔 잔기가 남은 후에만 효소 해리를 진행하세요.

회수한 오가노이드 현탁액을 300G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다. 펠릿을 건드리지 않고 상원액을 조심스럽게 제거하세요. 펠릿을 재조합 세포 해리 효소 1밀리리터에 다시 담고, 37도 섭씨에서 5분에서 10분간 배큐합니다.

넓은 구경의 P1000 팁을 사용해 2분에서 3분마다 8번에서 10번 부드럽게 피펫을 사용해 해리를 촉진합니다. 대부분의 오가노이드 조각이 단일 세포로 분산되어 소규모 잔여 클러스터만 남으면 소화를 멈춥니다. 다음으로, 2% 태아 소 혈청이 함유된 얼음 차가운 PBS 4밀리리터를 추가해 소화를 멈추게 합니다.

그 다음 40마이크로미터 셀 체를 통해 현탁액을 걸러냅니다. 잔여 효소, 응집체, 이물질을 제거하기 위해 PBS로 한 번 세척하세요. 트리판 블루 배제법으로 세포 수를 세세요.

세포 생존율이 85% 이상임을 확인한 후, 최종 세포 농도를 마이크로리터당 700에서 1,200 세포로 조정합니다. 과도한 이물질, 풍부한 죽은 세포, 큰 가시적 응집체 또는 불완전한 해리가 있는 샘플은 제외합니다. 골재가 있으면 적재 전에 다시 여과하세요.

해리 효소, 소화 시간, 피펫팅 빈도, 여과 방법, 세포 농도, 로딩 전략 등 동일한 조건에서 공정 제어 및 처리된 샘플을 수행했습니다. 마지막으로 단일 세포 라이브러리 증폭 후 단일 세포 시퀀싱을 수행합니다. 오르가노이드는 회복 후 1일째부터 6일째까지 표준 3차원 배양 조건 하에서 생존하고 증식했다.

첫째 날에는 오가노이드가 작고 조밀한 구조로 나타났으나, 6일째에는 크기가 커지고 형태가 명확해졌다. 렌바티닙 처리된 오가노이드는 DMSO 처리된 대조군에 비해 크기가 작고 형태가 변했습니다. 정량적 분석 결과, 렌바티닙 치료 후 DMSO 대조군에 비해 평균 오가노이드 직경이 감소한 것으로 나타났습니다.

이 프로토콜은 치료 후 세포 상태, 세포 구성 및 유전자 발현의 변화를 연구할 수 있게 합니다. 가장 큰 도전은 세포 생존력을 보존하는 것이며, 모든 그룹에서 단순한 처리 과정을 일관되게 유지하는 것입니다. 이 절차를 따라 세포 하위 분석이 수행될 수 있으며, 여기에는 군집화, 차별 유전자 실험 분석, 경로 풍부도 분석, 재고 추론 등이 포함됩니다.