인간의 간세포 암 세포주 인 HepG2와 3 차원 간 모델 다시 채워에서 바이러스 성 벡터의 연구

이 절차의 전반적인 목표는 바이러스와 바이러스 벡터를 연구하기 위한 3차원 간 모델을 개발하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 마우스 또는 쥐 모델의 설치류 세포와 생리학적으로 다른 인간 세포를 사용하여 혈관화된 3차원 시스템에서 생물학적 과정을 연구할 수 있습니다. 또한 살아있는 동물을 대상으로 한 실험을 피하고 장기적으로 동물 성분을 완전히 대체하기 위한 목적으로 동물 복지를 개선하기 위한 조치입니다.

유전자 전달을 위한 바이러스 벡터를 연구하기 위해 이 방법을 개발했지만, 감염성 필수 바이러스 연구 및 암 연구와 같은 기타 연구 분야에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Viola Rohrs입니다. 동물 복지를 위해 본 연구에는 다른 동물 실험을 위해 희생된 잉여 동물만 사용되었으며, 즉,

간 골격을 얻기 위해 추가 동물이 필요하지 않았습니다. 먼저 간세포주 G2 간세포주를 확장하십시오. 10%의 태아 송아지 혈청과 2밀리몰의 굴라민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 배지 30ml에 담긴 T175 병에 1,500만 개의 세포를 파종합니다. 배양 4일 후 배양 조건에서 트립신 용액을 5분 동안 노출시켜 세포를 풀어낸 다음 수확합니다.

그런 다음 300Gs에서 3분 동안 셀을 스핀다운합니다. 그런 다음 4ml의 PBS에 다시 현탁시키고 세포 수를 얻습니다. 각 병은 약 4,500만 개의 세포를 산출해야 합니다.

쥐의 간 ECM을 재세포화하기 위해서는 6억 개의 세포가 필요합니다. ECM을 재세포화하려면 먼저 간 풍부 챔버, 풍부 시스템, 배지 저장소 및 버블 트랩을 포함하는 생물 반응기 시스템을 설정합니다. 재세포화 절차에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다.

하나는 풍력 시스템에 기포가 갇히지 않도록 하는 것입니다. 두 번째는 전체 시스템을 멸균 상태로 유지해야 한다는 것입니다. 먼저 생물 반응기 시스템의 이러한 구성 요소를 섭씨 121도에서 15분 동안 살균합니다.

둘째, 튜브와 멸균된 풍부 챔버를 배지로 채웁니다. 그런 다음 탈세포화된 쥐 간 골격을 간 풍혈실에 넣습니다. 다음 단계는 튜브 클립을 사용하여 캐끰된 문맥을 풍력 시스템에 연결하는 것입니다.

이제 생물 반응기 시스템을 인큐베이터에 넣고 연동 펌프에 연결하십시오. 다음으로, 5일에 걸쳐 150ml의 보충 배지로 골격을 평형을 이룹니다. 유량을 분당 1.25밀리리터로 설정합니다.

5일 후, 펌프에서 바이오리액터 시스템을 분리하고 멸균 후드로 옮깁니다. 미디어 회로에서 간 골격을 분리합니다. 그런 다음 3억 개의 G2 간염 세포가 들어 있는 배지 5ml를 주사기에 넣고 기포 형성을 피하면서 문맥을 통해 세포를 주입합니다.

그런 다음 펌프를 가동하지 않고 한 시간 동안 세포가 ECM을 다시 채우도록 합니다. 한 시간 후 분당 1.25밀리리터로 펌프를 시동합니다. 10분 후 압력을 분당 2.5밀리리터로 높입니다.

20분 더 후 펌프를 분당 3.75밀리리터의 작동 속도로 설정합니다. 최대 펌프 속도로 30분 후 펌프를 끄고 3억 개의 셀을 더 추가한 다음 한 시간 동안 셀이 ECM을 채우도록 합니다. 한 시간 후 이전과 같이 펌프 속도를 점진적으로 조정하여 순환을 점차적으로 증가시킵니다.

이제 배양액이 2주에 걸쳐 간을 재세포화하도록 합니다. 격일로 50ml의 배지를 교체하고 사용된 배지 샘플에서 생리학적 매개변수를 측정합니다. AAV 벡터의 생산은 텍스트 프로토콜에 요약된 많은 단계를 포함하는 복잡한 절차입니다.

비디오의 이 섹션에서는 몇 가지 중요한 단계를 보여줍니다. 먼저 AAV 벡터를 생성, 정제 및 정량화합니다. 롤러 병에서 AAV 벡터를 간략하게 생성하고 요오딕산올 구배 원심분리로 정제합니다.

PD10 겔 여과 컬럼 위에서 여과하여 잔류 요오드딕산올을 제거합니다. 그런 다음 게놈 AAV DNA를 표준으로 사용하여 QPCR에 의해 AAV 벡터 농도를 측정합니다. 모델당 총 27조 개의 AAV 벡터가 필요합니다.

이제 간 모델을 형질전환해 보겠습니다. 먼저, 5밀리리터의 PBS에 포함된 27조 개의 벡터를 주사기에 로드합니다. 페놀 레드는 밀리리터당 5마이크로그램으로 첨가될 수 있습니다.

그런 다음 매체 회로에서 간을 분리하고 벡터를 시스템에 주입합니다. 주입이 완료되면 펌핑하지 않고 1시간 동안 시스템을 배양합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 점차적으로 흐름을 높입니다.

나중에, 형질도입된 간을 6일에 걸쳐 배양할 때, 격일로 50ml의 배지를 교체한다. 메스를 사용하여 각 간엽에서 두께가 약 50cm이고 길이가 1.5-2cm인 샘플을 슬라이스합니다. 4%의 파라포름알데히드와 4%자당으로 조각을 섭씨 4도에서 90분 동안 배양합니다.

그런 다음 세척 당 1 분 동안 PBS로 샘플을 세 번 세척하십시오. 섭씨 4도에서 8% 자당에서 밤새 샘플을 배양하여 세척을 따릅니다. 다음날, 일부 고정 매체가 포함된 cryomolds에 샘플을 로드합니다.

기포가 유입되지 않도록 하십시오. 일단 적재되면, 정착 매체로 표본을 완전히 덮고 영의 80 섭씨 온도에 두십시오. 일단 얼면 cryotome을 사용하여 샘플에서 10미크론 극저온 절편을 준비합니다.

재세포화를 확인하기 위해 필요에 따라 샘플을 염색합니다. 유전자 발현 분석을 위해 4mm 생검 펀치를 사용하여 샘플을 채취합니다. 재세포화를 평가하기 위해 냉동 절편을 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색했습니다.

재세포화되었으나 형질도입되지 않은 2개의 형질도입된 간과 1개의 대조 간에서 나온 엽은 모두 G2 간염 세포로 재증식되었습니다. RNA 발현 및 벡터 역가는 각 간 모델에서 28개의 펀치 생검으로부터 정량화되었습니다. 두 개의 형질도입된 간 모델에서 세포당 55개 및 90개의 벡터 게놈을 측정했는데, 이는 유전자 침묵을 유도하기에 충분한 벡터입니다.

예상대로 대조군에서 게놈이 측정되지 않았습니다. EmGFP 발현은 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 분석하였다. 대부분의 생검에서 EmGFP의 mRNA 발현과 EmGFP의 단백질 발현이 나타났습니다.

동결절편의 면역 검사는 모델이 성공적으로 재세포화되는 모든 곳에서 EmGFP 발현도 볼 수 있음을 보여주었습니다. 이는 AAV 유전자 발현이 양호하다는 것을 나타냅니다. 다음으로 인간 사이클로필린 B의 AAV 매개 녹다운을 정량적 RT-PCR로 분석했습니다.

인간 사이클로필린 B의 평균 녹다운은 두 개의 형질도입된 간의 모든 엽에서 70%에서 90% 사이였다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 혈관화된 3차원 장기 시스템에서 바이러스와 바이러스 벡터의 분포를 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이러한 연구는 유전자 전달을 위한 현재의 기술을 개선하고 새로운 항바이러스 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다.