Fluorescentie is een fenomeen dat plaatsvindt wanneer een substantie licht absorbeert op een bepaalde golflengte en licht uitzendt op een andere golflengte. Fluorescentie treedt op wanneer een elektron, dat is opgewonden tot een hogere en onstabielere energietoestand, zich ontspant naar zijn grondtoestand en een foton van licht afgeeft. Het licht dat verantwoordelijk is voor de excitatie, of het elektron naar een hogere energietoestand te bewegen, heeft een kortere golflengte en hogere energie dan de fluorescentie-emissie, die een langere golflengte, lagere energie en een andere kleur heeft.
Fluorescentiemicroscopie combineert de vergrotingseigenschappen van de lichtmicroscoop met fluorescentietechnologie die het mogelijk maakt om excitatie en detectie van emissie van fluoroforen - fluorescerende chemische verbindingen - uit te voeren. Met fluorescentiemicroscopie kunnen wetenschappers de locatie van specifieke celtypen binnen weefsels of moleculen binnen cellen observeren.
De belangrijkste componenten van de fluorescentiemicroscoop overlappen grotendeels met de traditionele lichtmicroscoop. De twee belangrijkste verschillen zijn echter het type lichtbron en het gebruik van de gespecialiseerde filterelementen.
Fluorescentiemicroscopie vereist een zeer krachtige lichtbron zoals een xenon- of kwikbooglamp zoals degene die hier getoond wordt. Het licht dat wordt uitgezonden door de kwikbooglamp is 10-100 keer helderder dan de meeste gloeilampen en biedt licht in een breed scala aan golflengten, van ultraviolet tot infrarood. Deze krachtige lichtbron is het gevaarlijkste onderdeel van de fluorescentiemicroscoopopstelling, omdat direct kijken naar ongefilterd licht ernstige schade aan je netvlies kan veroorzaken en onjuist omgaan met de lampen kan ervoor zorgen dat ze exploderen.
Het principe achter fluorescentiemicroscopie is eenvoudig. Terwijl het licht de booglamp verlaat, wordt het geleid door een exciterfilter, dat de excitatiegolflengte selecteert.
Dit licht wordt gereflecteerd naar de monster door een speciale spiegel, een dichromatische spiegel, die ontworpen is om alleen licht bij de excitatiegolflengte te reflecteren. Het gereflecteerde licht passeert het objectief waar het op het fluorescerende monster wordt gefocust. De emissie van het monster wordt op zijn beurt teruggeleid door het objectief - waar de beeldvergroting plaatsvindt - en nu door de dichromatische spiegel.
Dit licht wordt gefilterd door de barrièrefilter, die de emissiegolflengte selecteert en belastend licht van de booglamp of andere bronnen die worden gereflecteerd door de microscopeonderdelen, weerkaatst. Ten slotte wordt de gefilterde fluorescentie-emissie naar een detector gestuurd waar het beeld kan worden gedigitaliseerd, of het wordt naar het oculaire gestuurd voor optische weergave.
De exciterfilter, dichromatische spiegel en barrièrefilter kunnen samen worden samengesteld in een onderdeel dat bekend staat als de filtercube. Verschillende filtercubes kunnen worden veranderd tijdens het bekijken van het monster om de excitatiegolflengte te veranderen, en een reeks diafragma's kan worden gebruikt om de intensiteit van de excitatie te wijzigen.
Wanneer het gaat om het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie, kan de fluorofoor net zo belangrijk zijn als de microscoop zelf, en het type fluorofoor dat wordt afgebeeld bepaalt de gebruikte excitatiegolflengte en de gedetecteerde emissiegolflengte. De excitatiegolflengten bevatten een klein bereik van energieën die door de fluorofoor kunnen worden geabsorbeerd en ervoor kunnen zorgen dat deze overgaat in een opgewonden toestand. Eenmaal opgewonden, is een breed scala aan emissie, of overgangen terug naar de lagere energietoestand, mogelijk wat resulteert in een emissiespectrum.
Het verschil tussen het piek van de absorptie, of excitatiecurve en het piek van de emissiecurve wordt bekend als Stoke's Shift. Hoe groter de afstand in deze verschuiving, hoe gemakkelijker het is om de twee verschillende golflengten te scheiden. Bovendien moet elk overlappend spectrum worden verwijderd door de componenten van de filtercube voor een verminderde achtergrond en verbeterde beeldkwaliteit.
Blootstelling van de fluorofoor aan langdurige excitatie zal ervoor zorgen dat het fotobleekt, wat een verzwakking of verlies van fluorescentie is. Om fotobleking te verminderen, kunt u een anti-vervaagmiddel voor montage toevoegen aan de dia en de randen verzegelen met nagellak. De dia moet ook in het donker worden bewaard wanneer deze niet wordt afgebeeld.
Om te beginnen met fluorescentiebeeldvorming, zet u de xenon- of kwiklichtbron aan en laat deze 15 minuten opwarmen om een constante verlichting te bereiken.
Plaats vervolgens uw monster op de tafel en bevestig het op zijn plaats. Zet vervolgens de witte lichtbron van uw microscoop aan. Focus op uw monster met behulp van het objectief met de laagste vermogensinstelling door de grove en fijne focusknoppen aan te passen. Gebruik vervolgens de knoppen voor tafelaanpassing om uw gebied van belang te vinden.
Schakel vervolgens de witte lichtbron uit, evenals alle onnodige ruimtelichten om de achtergrond te verminderen.
Selecteer de juiste filtercube voor de kleurstof die u afbeeldt en open de sluiter om uw monster te verlichten.
Ten slotte maakt u fijne focusaanpassingen en leidt u het uitgangslicht naar de beeldvormingscamera. U zult waarschijnlijk aanpassingen moeten maken aan de belichtingstijd voor elke verschillende fluorofoor of fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt. Het is echter belangrijk om de belichtingstijd constant te houden bij het vergelijken van functies met dezelfde kleurstof op verschillende monsters.
Om meerdere kleurstoffen op hetzelfde monster af te beelden, verandert u de filtercube om overeen te komen met elke fluorofoor en neemt u de nieuwe afbeelding op.
Nadat elke kleurstof in het monster is afgebeeld, kunnen individuele afbeeldingen worden gecombineerd en samengevoegd.
Veel verschillende soorten experimenten kunnen gebruikmaken van fluorescentiemicroscopie en betrekken verschillende soorten fluoroforen. Een van de meest voorkomende toepassingen van fluorescentiemicroscopie is het afbeelden van ei
Fluorescentiemicroscopie is een zeer krachtig analytisch hulpmiddel dat de vergrotingseigenschappen van lichtmicroscopie combineert met de visualisati…
Fluorescentie is een fenomeen dat plaatsvindt wanneer een substantie licht absorbeert op een bepaalde golflengte en licht uitzendt op een andere golflengte. Fluorescentie treedt op wanneer een elektron, dat is opgewonden tot een hogere en onstabielere energietoestand, zich ontspant naar zijn grondtoestand en een foton van licht afgeeft. Het licht dat verantwoordelijk is voor de excitatie, of het elektron naar een hogere energietoestand te bewegen, heeft een kortere golflengte en hogere energie dan de fluorescentie-emissie, die een langere golflengte, lagere energie en een andere kleur heeft.
Fluorescentiemicroscopie combineert de vergrotingseigenschappen van de lichtmicroscoop met fluorescentietechnologie die het mogelijk maakt om excitatie en detectie van emissie van fluoroforen - fluorescerende chemische verbindingen - uit te voeren. Met fluorescentiemicroscopie kunnen wetenschappers de locatie van specifieke celtypen binnen weefsels of moleculen binnen cellen observeren.
De belangrijkste componenten van de fluorescentiemicroscoop overlappen grotendeels met de traditionele lichtmicroscoop. De twee belangrijkste verschillen zijn echter het type lichtbron en het gebruik van de gespecialiseerde filterelementen.
Fluorescentiemicroscopie vereist een zeer krachtige lichtbron zoals een xenon- of kwikbooglamp zoals degene die hier getoond wordt. Het licht dat wordt uitgezonden door de kwikbooglamp is 10-100 keer helderder dan de meeste gloeilampen en biedt licht in een breed scala aan golflengten, van ultraviolet tot infrarood. Deze krachtige lichtbron is het gevaarlijkste onderdeel van de fluorescentiemicroscoopopstelling, omdat direct kijken naar ongefilterd licht ernstige schade aan je netvlies kan veroorzaken en onjuist omgaan met de lampen kan ervoor zorgen dat ze exploderen.
Het principe achter fluorescentiemicroscopie is eenvoudig. Terwijl het licht de booglamp verlaat, wordt het geleid door een exciterfilter, dat de excitatiegolflengte selecteert.
Dit licht wordt gereflecteerd naar de monster door een speciale spiegel, een dichromatische spiegel, die ontworpen is om alleen licht bij de excitatiegolflengte te reflecteren. Het gereflecteerde licht passeert het objectief waar het op het fluorescerende monster wordt gefocust. De emissie van het monster wordt op zijn beurt teruggeleid door het objectief - waar de beeldvergroting plaatsvindt - en nu door de dichromatische spiegel.
Dit licht wordt gefilterd door de barrièrefilter, die de emissiegolflengte selecteert en belastend licht van de booglamp of andere bronnen die worden gereflecteerd door de microscopeonderdelen, weerkaatst. Ten slotte wordt de gefilterde fluorescentie-emissie naar een detector gestuurd waar het beeld kan worden gedigitaliseerd, of het wordt naar het oculaire gestuurd voor optische weergave.
De exciterfilter, dichromatische spiegel en barrièrefilter kunnen samen worden samengesteld in een onderdeel dat bekend staat als de filtercube. Verschillende filtercubes kunnen worden veranderd tijdens het bekijken van het monster om de excitatiegolflengte te veranderen, en een reeks diafragma's kan worden gebruikt om de intensiteit van de excitatie te wijzigen.
Wanneer het gaat om het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie, kan de fluorofoor net zo belangrijk zijn als de microscoop zelf, en het type fluorofoor dat wordt afgebeeld bepaalt de gebruikte excitatiegolflengte en de gedetecteerde emissiegolflengte. De excitatiegolflengten bevatten een klein bereik van energieën die door de fluorofoor kunnen worden geabsorbeerd en ervoor kunnen zorgen dat deze overgaat in een opgewonden toestand. Eenmaal opgewonden, is een breed scala aan emissie, of overgangen terug naar de lagere energietoestand, mogelijk wat resulteert in een emissiespectrum.
Het verschil tussen het piek van de absorptie, of excitatiecurve en het piek van de emissiecurve wordt bekend als Stoke's Shift. Hoe groter de afstand in deze verschuiving, hoe gemakkelijker het is om de twee verschillende golflengten te scheiden. Bovendien moet elk overlappend spectrum worden verwijderd door de componenten van de filtercube voor een verminderde achtergrond en verbeterde beeldkwaliteit.
Blootstelling van de fluorofoor aan langdurige excitatie zal ervoor zorgen dat het fotobleekt, wat een verzwakking of verlies van fluorescentie is. Om fotobleking te verminderen, kunt u een anti-vervaagmiddel voor montage toevoegen aan de dia en de randen verzegelen met nagellak. De dia moet ook in het donker worden bewaard wanneer deze niet wordt afgebeeld.
Om te beginnen met fluorescentiebeeldvorming, zet u de xenon- of kwiklichtbron aan en laat deze 15 minuten opwarmen om een constante verlichting te bereiken.
Plaats vervolgens uw monster op de tafel en bevestig het op zijn plaats. Zet vervolgens de witte lichtbron van uw microscoop aan. Focus op uw monster met behulp van het objectief met de laagste vermogensinstelling door de grove en fijne focusknoppen aan te passen. Gebruik vervolgens de knoppen voor tafelaanpassing om uw gebied van belang te vinden.
Schakel vervolgens de witte lichtbron uit, evenals alle onnodige ruimtelichten om de achtergrond te verminderen.
Selecteer de juiste filtercube voor de kleurstof die u afbeeldt en open de sluiter om uw monster te verlichten.
Ten slotte maakt u fijne focusaanpassingen en leidt u het uitgangslicht naar de beeldvormingscamera. U zult waarschijnlijk aanpassingen moeten maken aan de belichtingstijd voor elke verschillende fluorofoor of fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt. Het is echter belangrijk om de belichtingstijd constant te houden bij het vergelijken van functies met dezelfde kleurstof op verschillende monsters.
Om meerdere kleurstoffen op hetzelfde monster af te beelden, verandert u de filtercube om overeen te komen met elke fluorofoor en neemt u de nieuwe afbeelding op.
Nadat elke kleurstof in het monster is afgebeeld, kunnen individuele afbeeldingen worden gecombineerd en samengevoegd.
Veel verschillende soorten experimenten kunnen gebruikmaken van fluorescentiemicroscopie en betrekken verschillende soorten fluoroforen. Een van de meest voorkomende toepassingen van fluorescentiemicroscopie is het afbeelden van ei
Fluorescentie is een fenomeen dat plaatsvindt wanneer een substantie licht absorbeert op een bepaalde golflengte en licht uitzendt op een andere golflengte. Fluorescentie treedt op wanneer een elektron, dat is opgewonden tot een hogere en onstabielere energietoestand, zich ontspant naar zijn grondtoestand en een foton van licht afgeeft. Het licht dat verantwoordelijk is voor de excitatie, of het elektron naar een hogere energietoestand te bewegen, heeft een kortere golflengte en hogere energie dan de fluorescentie-emissie, die een langere golflengte, lagere energie en een andere kleur heeft.
Fluorescentiemicroscopie combineert de vergrotingseigenschappen van de lichtmicroscoop met fluorescentietechnologie die het mogelijk maakt om excitatie en detectie van emissie van fluoroforen - fluorescerende chemische verbindingen - uit te voeren. Met fluorescentiemicroscopie kunnen wetenschappers de locatie van specifieke celtypen binnen weefsels of moleculen binnen cellen observeren.
De belangrijkste componenten van de fluorescentiemicroscoop overlappen grotendeels met de traditionele lichtmicroscoop. De twee belangrijkste verschillen zijn echter het type lichtbron en het gebruik van de gespecialiseerde filterelementen.
Fluorescentiemicroscopie vereist een zeer krachtige lichtbron zoals een xenon- of kwikbooglamp zoals degene die hier getoond wordt. Het licht dat wordt uitgezonden door de kwikbooglamp is 10-100 keer helderder dan de meeste gloeilampen en biedt licht in een breed scala aan golflengten, van ultraviolet tot infrarood. Deze krachtige lichtbron is het gevaarlijkste onderdeel van de fluorescentiemicroscoopopstelling, omdat direct kijken naar ongefilterd licht ernstige schade aan je netvlies kan veroorzaken en onjuist omgaan met de lampen kan ervoor zorgen dat ze exploderen.
Het principe achter fluorescentiemicroscopie is eenvoudig. Terwijl het licht de booglamp verlaat, wordt het geleid door een exciterfilter, dat de excitatiegolflengte selecteert.
Dit licht wordt gereflecteerd naar de monster door een speciale spiegel, een dichromatische spiegel, die ontworpen is om alleen licht bij de excitatiegolflengte te reflecteren. Het gereflecteerde licht passeert het objectief waar het op het fluorescerende monster wordt gefocust. De emissie van het monster wordt op zijn beurt teruggeleid door het objectief - waar de beeldvergroting plaatsvindt - en nu door de dichromatische spiegel.
Dit licht wordt gefilterd door de barrièrefilter, die de emissiegolflengte selecteert en belastend licht van de booglamp of andere bronnen die worden gereflecteerd door de microscopeonderdelen, weerkaatst. Ten slotte wordt de gefilterde fluorescentie-emissie naar een detector gestuurd waar het beeld kan worden gedigitaliseerd, of het wordt naar het oculaire gestuurd voor optische weergave.
De exciterfilter, dichromatische spiegel en barrièrefilter kunnen samen worden samengesteld in een onderdeel dat bekend staat als de filtercube. Verschillende filtercubes kunnen worden veranderd tijdens het bekijken van het monster om de excitatiegolflengte te veranderen, en een reeks diafragma's kan worden gebruikt om de intensiteit van de excitatie te wijzigen.
Wanneer het gaat om het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie, kan de fluorofoor net zo belangrijk zijn als de microscoop zelf, en het type fluorofoor dat wordt afgebeeld bepaalt de gebruikte excitatiegolflengte en de gedetecteerde emissiegolflengte. De excitatiegolflengten bevatten een klein bereik van energieën die door de fluorofoor kunnen worden geabsorbeerd en ervoor kunnen zorgen dat deze overgaat in een opgewonden toestand. Eenmaal opgewonden, is een breed scala aan emissie, of overgangen terug naar de lagere energietoestand, mogelijk wat resulteert in een emissiespectrum.
Het verschil tussen het piek van de absorptie, of excitatiecurve en het piek van de emissiecurve wordt bekend als Stoke's Shift. Hoe groter de afstand in deze verschuiving, hoe gemakkelijker het is om de twee verschillende golflengten te scheiden. Bovendien moet elk overlappend spectrum worden verwijderd door de componenten van de filtercube voor een verminderde achtergrond en verbeterde beeldkwaliteit.
Blootstelling van de fluorofoor aan langdurige excitatie zal ervoor zorgen dat het fotobleekt, wat een verzwakking of verlies van fluorescentie is. Om fotobleking te verminderen, kunt u een anti-vervaagmiddel voor montage toevoegen aan de dia en de randen verzegelen met nagellak. De dia moet ook in het donker worden bewaard wanneer deze niet wordt afgebeeld.
Om te beginnen met fluorescentiebeeldvorming, zet u de xenon- of kwiklichtbron aan en laat deze 15 minuten opwarmen om een constante verlichting te bereiken.
Plaats vervolgens uw monster op de tafel en bevestig het op zijn plaats. Zet vervolgens de witte lichtbron van uw microscoop aan. Focus op uw monster met behulp van het objectief met de laagste vermogensinstelling door de grove en fijne focusknoppen aan te passen. Gebruik vervolgens de knoppen voor tafelaanpassing om uw gebied van belang te vinden.
Schakel vervolgens de witte lichtbron uit, evenals alle onnodige ruimtelichten om de achtergrond te verminderen.
Selecteer de juiste filtercube voor de kleurstof die u afbeeldt en open de sluiter om uw monster te verlichten.
Ten slotte maakt u fijne focusaanpassingen en leidt u het uitgangslicht naar de beeldvormingscamera. U zult waarschijnlijk aanpassingen moeten maken aan de belichtingstijd voor elke verschillende fluorofoor of fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt. Het is echter belangrijk om de belichtingstijd constant te houden bij het vergelijken van functies met dezelfde kleurstof op verschillende monsters.
Om meerdere kleurstoffen op hetzelfde monster af te beelden, verandert u de filtercube om overeen te komen met elke fluorofoor en neemt u de nieuwe afbeelding op.
Nadat elke kleurstof in het monster is afgebeeld, kunnen individuele afbeeldingen worden gecombineerd en samengevoegd.
Veel verschillende soorten experimenten kunnen gebruikmaken van fluorescentiemicroscopie en betrekken verschillende soorten fluoroforen. Een van de meest voorkomende toepassingen van fluorescentiemicroscopie is het afbeelden van ei
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is fluorescence and how does it occur at the molecular level?
Fluorescence occurs when a fluorophore absorbs light at a specific wavelength, exciting an electron to a higher energy state. As the electron relaxes back to its ground state, it emits a photon of light at a longer wavelength and lower energy than the absorbed light. This emission enables visualization of fluorescently labeled structures in microscopy applications.
Q2: How does fluorescence microscopy differ from light microscopy?
Fluorescence microscopy combines magnification with fluorescence detection, requiring specialized components beyond traditional light microscopy. Key differences include a powerful xenon or mercury arc lamp that is 10-100 times brighter than incandescent sources, specialized exciter and barrier filters, and a dichroic mirror to separate excitation and emission wavelengths. These additions enable detection of fluorescently labeled molecules within cells and tissues.
Q3: What is Stokes Shift and why does it matter in fluorescence microscopy?
Stokes Shift is the difference between the peak absorption wavelength and the peak emission wavelength of a fluorophore. A larger Stokes Shift makes it easier to separate excitation and emission wavelengths using filters, reducing background noise and improving image quality. This separation is critical for obtaining clear fluorescent images without contaminating light from the microscope components.
Q4: What causes photobleaching and how can you prevent it?
Photobleaching occurs when prolonged excitation weakens or eliminates a fluorophore's ability to fluoresce. To reduce photobleaching, add anti-fade mounting medium to slides and seal edges with nail polish. Additionally, keep slides in the dark when not being imaged to minimize unnecessary light exposure and preserve fluorescence intensity for accurate imaging.
Q5: What are the main components of a fluorescence microscope and their functions?
The exciter filter selects the excitation wavelength, the dichroic mirror reflects excitation light toward the sample while allowing emission light to pass through, and the barrier filter selects emission wavelength while blocking contaminating light. These three components can be assembled into a filter cube, which can be changed during imaging to accommodate different fluorophores and their specific wavelength requirements.
Q6: How do you prepare and image a fluorescence microscopy sample?
Allow the xenon or mercury light source to warm up for 15 minutes to reach constant illumination. Place the sample on the stage and focus using the lowest objective. Turn off room lights to reduce background, select the appropriate filter cube for your fluorophore, and open the shutter to illuminate the sample. Adjust exposure time as needed, keeping it constant when comparing samples with the same dye.
Q7: What are common methods for labeling samples in fluorescence microscopy?
Common labeling methods include conjugating fluorescent compounds to antibodies that target specific proteins, integrating fluorescent protein genes like GFP into organism DNA for expression in specific cell types, and labeling macromolecular assemblies such as the F-actin cytoskeletal network. Each method enables visualization of different cellular structures and molecular components for research and diagnostic applications.
Chapters in this video
0:00
Introduction to Fluorescence Microscopy
1:19
Principles and Components of the Fluorescent Microscope
2:21
Basic Principles of Fluorescence Microscopy
5:25
Fluorescence Microscopy Imaging
6:59
Applications
8:45
Summary
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved