Name: Electron Cryotomography van bacteriële cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Verken elektronencryotomografie om de ultrastructuur van bacteriële cellen in hun natuurlijke toestand te visualiseren. Deze methode combineert plunge freezing en high-pressure freezing voor hoogwaardige 3D-reconstructies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health Grants R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 en P01 GM066521 te GJJ evenals de Howard Hughes Medical Institute, het Beckman Institute aan Caltech, en geschenken aan Caltech van de Gordon en Betty Moore Foundation en Agouron Institute. MSL wordt ondersteund door NIH subsidie ​​2R37-A1041239-06A1 naar Pamela S. Björkman. Leica Microsystems Inc welwillend ter beschikking gesteld video-inhoud van de cryosection collectie. De vertegenwoordiger resultaten van Treponema primitia werden verzameld en verwerkt door Gavin E. Murphy, en gepubliceerd in Molecular Microbiology met de titel &quot;Nieuwe ultrastructures van Treponema primitia en hun implicaties voor beweeglijkheid&quot;. (Murphy, G. et al.., Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

We tonen in deze video artikel hoe u ECT van de bacteriële cellen te doen. Beperkt door ruimte en tijd, we laten alleen de algemeen protocol. Meer details zijn te vinden in kranten, online of andere informatie verstrekt door de fabrikanten van de apparatuur en software-ontwikkelaars, en van ECT onderzoeksgroepen. Afhankelijk van de verschillende bacteriële soorten onderzocht, de gebruikte apparatuur en de structurele interesse in de cellen, het protocol en de experimentele parameters moeten worden getest en geoptimaliseerd.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>0,1% oplossing</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goudcolloïdale oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Nr 1 filterpapier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Dextraan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%, MW 39000</td></tr><tr><td>Messing-koepelvormig planchet</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal-Tec HPm 010 hogedrukvriezer</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultramicrotoom UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond cryo trim 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Static line II ionisator</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX100 Dry shipper</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSH-laadstation</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E/B omgekeerde microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Aangepast</td></tr><tr><td>Cryo LM-tafel</td><td>FEI</td><td></td><td>Aangepast</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Met UltraCam van Gatan</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electron cryotomography van bacteriële cellen

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Hoewel veel is al bekend is over de basis-metabolisme van bacteriële cellen, vele fundamentele vragen zijn nog steeds verrassend onbeantwoord, zoals bijvoorbeeld hoe zij genereren en onderhouden van specifieke cel vormen, tot stand polariteit, te scheiden van hun genoom, en te delen. Om deze fenomenen te begrijpen, zijn beeldvormende technieken nodig die het overbruggen van de kloof tussen resolutie fluorescentie microscopie en licht hogere resolutie methoden, zoals X-ray kristallografie en NMR spectroscopie. Electron cryotomography (ECT) is een opkomende technologie die niet alleen deze, waardoor de ultrastructuur van cellen worden gevisualiseerd in een near-native staat, in drie dimensies (3D), met &quot;macromoleculaire&quot; resolutie (~ 4 Nm). 1, 2 In ECT, cellen worden afgebeeld in een glasachtig, &quot;bevroren gehydrateerd&quot; staat in een cryo transmissie-elektronenmicroscoop (cryoTEM) bij lage temperatuur (&lt;-180 ° C). Voor slanke cellen (tot ~ 500 nm in dikte 3), intacte cellen zijn duik-bevroren binnen media in EM roosters in cryogens zoals ethaan of ethaan / propaan mengsels. Dikkere cellen en biofilms kunnen ook worden afgebeeld in een glasachtig staat door eerst &quot;hoge druk invriezen &#39;en dan&#39; cryo-snijden&quot; ze. Een reeks van twee-dimensionale projectie beelden worden vervolgens verzameld door het monster als het is incrementeel gekanteld langs een of twee assen. Een drie-dimensionale reconstructie, of &quot;tomogram&quot; kan dan worden berekend op basis van de beelden. Terwijl de ECT vereist dure instrumentatie, in de afgelopen jaren, is het gebruikt in een paar laboratoria aan de structuren van verschillende externe aanhangsels onthullen, de structuren van verschillende cel enveloppen, de posities en structuren van cytoskeletale filamenten, en de locaties en architecturen van grote macromoleculaire assemblages zoals flagellaire motoren, interne compartimenten en chemoreceptor arrays. 1, 2 In deze video artikel zullen we zien hoe om de afbeelding cellen met ECT, waaronder de processen van monstervoorbereiding, het verzamelen van gegevens, tomogram wederopbouw, en de interpretatie van de resultaten door middel van segmentatie en in sommige gevallen correlatie met lichtmicroscopie.

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om &quot;macromoleculaire&quot; (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

Hoewel er al veel bekend is over het basismetabolisme van bacteriële cellen, blijven veel fundamentele vragen nog verrassend onbeantwoord, inclusief voor ...

In deze video worden 3D-beelden van bacteriële cellen in een bijna natuurlijke staat met moleculaire resolutie gegenereerd door middel van cryo-elektronentomografie. Dit wordt bereikt door eerst intacte cellen snel te bevriezen (plunge freezing), of alternatief door cellen via hogedrukvriezen en cryosectie van de celpellets te verwerken. Er wordt een reeks van M projectiebeelden verzameld die worden gebruikt om een 3D-reconstructie, of tomogram, te genereren, welke vervolgens wordt gesegmenteerd en verder computationeel geanalyseerd.Hallo, ik ben Grant Jensen van de Division of Biology aan Caltech, en dit is Sonya Chen, die onze presentatie heeft georganiseerd. Vandaag gaan we laten zien hoe u elektron cryotomografie van bacteriële cellen uitvoert. Normaal gesproken zou één persoon de volledige procedure uitvoeren, maar omdat onze protocollen zijn ontwikkeld op basis van gedeelde ervaringen, betrekken we iedereen die momenteel in het laboratorium werkt.Naast Sonya en mij in de video, ziet u Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, mark Rodinsky en Jen. Zij en andere lableden, waaronder Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova en Dylan Morris, hebben de schermopnamen geproduceerd en geholpen bij het opstellen van het bijbehorende geschreven protocol. Ariana zal beginnen door te laten zien hoe we bacteriële cellen plunge-freezen.Voor dunne bacteriële cellen wordt een suspensie van intacte cellen via plunge freezing op een EM-grid gefixeerd. Hier wordt het proces gedemonstreerd met behulp van een commerciële automatische plunge freezer. Begin met het controleren van de bacteriële culturen om er zeker van te zijn dat ze vrij zijn van contaminanten en de juiste confluentie of concentratie hebben. Behandel het koolstofgecoate EM-grid gedurende twee tot vier minuten met een glow discharge. Meng vervolgens 100 µL colloïdaal goudoplossing met 25 µL van een 5% BSA-oplossing.Centrifugeer het mengsel bij 18, 000 G gedurende 15 minuten. Verwijder na de centrifugatie het supernatant en resuspendeer de goudpellet. Plaats het EM-grid in de Vitra bot bij 100% luchtvochtigheid in 20 µL celoplossing.Breng vervolgens vier microliters van het cellengemengsel aan op het glow-discharge behandelde EM-rooster. Het rooster wordt automatisch aan beide zijden met filterpapier gedroogd om overtollig vloeistof te verwijderen, waarna het snel wordt in het vloeibare mengsel van ethaan en propaan geplongeerd, dat is gekoeld met vloeibare stikstof. Verwijder het rooster voorzichtig uit het ethaan-propaanmengsel en plaats het snel in een roosterbewaarbox die onder vloeibare stikstof wordt gehouden. Voor dikkere cellen voorkomt high-pressure freezing ijskristallisatie.Vervolgende cryosectie maakt de monsters dun genoeg voor em. De beeldvorming begint door 15 milliliters cellen drie minuten lang te centrifugeren bij 1000 RPM. Verwijder na centrifugatie het supernatant en meng 0,5 milliliters van de resterende cultuurpellet met 0,5 milliliters cryoprotectant van 20% dextrine.Centrifuge vervolgens opnieuw bij 13, 000 RPM gedurende 15 seconden. Nadat de cellen zijn gepelletteerd, wordt het supernatant verwijderd en wordt er 0,1 milliliter van de pelletpasta gepipetteerd in een hitte-afgedichte micropipetpunt, waarin reeds 0,2 milliliters van 20% dextrine cryoprotectant aanwezig is. Centrifugeer het mengsel in de micropipetpunt bij 13, 000 RPM gedurende 30 seconden.Verwijder na het centrifugeren het supernatant. Er is een compact pellet van 5 tot 10 µL zichtbaar bij de afgesloten tip. Breng de pasta over naar één helft van een Teflon-gecoate koperen koepelvormige planchet die reeds is gemonteerd in de houderarm van de hogedrukvriezer, en sluit deze vervolgens af met de platte koperen tegenkap.Plaats vervolgens onmiddellijk de armassemblage in de klaargezette hogedrukvriezer. Bij een druk van 2100 bar wordt de gecombineerde messing plancheteenheid met de cellen snel gekoeld door een straal vloeibare stikstof onder hoge druk. Nadat de cellen zijn afgekoeld, wordt de armassemblage snel verwijderd en direct in een bad met vloeibare stikstof geplongeerd om te voorkomen dat de planchette opwarmt.Breng vervolgens de planchet over naar een vooraf gekoelde, bankschroefachtige klem van een cryomicrotoom die stevig is gemonteerd in de cryomicrotoomkamer, om de goed bevroren koepel van cellen bloot te stellen voor het maken van coupes. De twee messing planchets worden voorzichtig gescheiden onder vloeibare stikstof. Een perfect bevroren koepel van cellen zal een glasachtig uiterlijk hebben en vrij zijn van scheuren en ijsnucleatie-fissuren.Vorm met de cryomicrotoom het buitenste koepelgebied tot minder dan 0,2 vierkante millimeter met het diamanten triminstrument bij een snelle sectiesnelheid; behoud een diepte van ongeveer 200 micrometer met antistatische spray gericht op het laaghoekige mes en de koperen steungrid). Breng het diamanten mes in nauwe nabijheid voorzichtig naar het gepolijste blokoppervlak met een snijsnelheid van ongeveer 0,4 millimeter per seconde en een smal snijvenster. Begin met het snijden van plakjes met een dikte van 50 tot 350 nanometer.Hanteer een fijne wimperapplicator om de vroege secties op te vangen, waarbij u deze van de scherpe rand van het diamantmes onder lage hoek afschuift, om zo de linten secties over de koperen gridondersteuning te geleiden en te ondersteunen. Zodra het grid is geladen, gebruikt u een gekoelde, gepolijste zilveren probe om de linten stevig aan te drukken. Bewaar de grids in griddoosjes in een met vloeibare stikstof gekoelde dry shipper tot de microscoop gereed is.De bacteriële cellen op het raster kunnen worden afgebeeld met een cryo-lichtmicroscoop. Hiervoor wordt een aangepaste Nikon omgekeerde microscoop, TIB met een gemodificeerde FEI cryo-stage gebruikt. Laad de rasters in cartridges op het cryostation en klem ze vast met de koperen klemringen, plaats vervolgens de cartridge in een buis met vloeibare stikstof voor transport.Laad tot twee cartridges in de vooraf gekoelde cryo-stage en verplaats het raster naar het kijkvenster. Laat vervolgens de condensorlens zakken en focus de objectieflens op het raster. Zoek de cellen en maak afbeeldingen.Voor gecorreleerde LM- en EM-studies. Het raster wordt gescand rondom het gebied van de cellen om de cellen later in de EM te kunnen lokaliseren. Plaats na het afbeelden van het raster de houder terug in de buis en bewaar de buis in vloeibare stikstof totdat deze gereed is voor EM-beeldvorming om een 3D TOM van de bacteriële cel te verkrijgen.Een reeks projectiebeelden wordt gemaakt terwijl het monster stapsgewijs wordt gekanteld langs één of twee assen in de cryo-TEM; hier wordt de procedure gedemonstreerd met behulp van legon met een cryo T-E-M-F-E-I-T-F 30 polar, waarbij tot zes cartridges in een multi-selectiehouder op het cryostation worden geladen. Sluit deze vervolgens aan op de TF 30 Polar, selecteer één cartridge en plaats deze in de EM-kolom. Start legend in de clientsoftware op de EM-computer.Voer de beeldcondities in voor de legenda van de sessie. Selecteer doelen op beelden beginnend bij de laagste vergroting en stuur deze naar de volgende stap met een hogere vergroting. Plaats vervolgens alle doelen in de wachtrij voor de verzameling van tilt-series en dien ze allemaal in voor de uiteindelijke tomografie-stap.Verwrijf een reeks beelden. Het monster wordt stapsgewijs gekanteld langs één of twee assen in de cryo-TEM. Nadat het experiment is voltooid, downloadt u de volledige kantelreeks naar een lokaal werkstation voor reconstructie.Tomo-grammen van de bacteriële cellen worden berekend met behulp van gespecialiseerde software. Het programma Raptor wordt gebruikt om tomogrammen automatisch te reconstrueren, en e tomo kan worden gebruikt om dit semi-automatisch te doen. Inspecteer de tilt-serie met de 3D mod viewer van Im MOD en verwijder alle series die vanwege tracking- of andere fouten waarschijnlijk geen bruikbare resultaten zullen opleveren.Een goede tommo raptor wordt gedistribueerd uitgevoerd over de Linux-machines in het laboratorium met behulp van de basisinstellingen. Het genereren van de tomogram duurt 20 minuten tot twee uur, afhankelijk van de bestandsgrootte. Wanneer Raptor faalt of wanneer een onderzoeker wil controleren of de reconstructie optimaal is, kan EMO worden gebruikt om de beelden zorgvuldig handmatig uit te lijnen.Volg de stappen van elk tabblad in de e tomo GUI om het tomogram uit de tilt-serie te reconstrueren. We maken gebruik van een webgebaseerde interne database om de tomografische gegevens te organiseren, op te slaan, te zoeken en te distribueren. De hoofdpagina voor browsen bevat een miniatuurafbeelding en een uitgelichte video in de stijl van YouTube.Voor elke tomo Graham. Nadat de Tommo Grahams zijn verkregen, kunnen individuele kenmerken worden gesegmenteerd om hun vormen te helpen visualiseren. In 3D is segmentatie het proces waarbij elke voxel van het 3D-beeld wordt toegewezen aan een specifieke regio of materiaal.Hier wordt mirror-software gebruikt om een oppervlaktemodel te genereren waarin elke regio met een andere kleur wordt weergegeven en bekeken in 3D-films en animaties van de tomo. Grafieken kunnen worden gemaakt om projecten samen te vatten en bevindingen in 3D-graphics te illustreren. Voor de weergave kan software zoals Amira of Kymera worden gebruikt om de individuele stilstaande beelden van de film en commerciële weergaven te renderen.Videobewerkingssoftware zoals Adobe Premier kan worden gebruikt om de commerciële softwarevideo te bewerken. Maya wordt gebruikt om de animatie te genereren. Het kan de oppervlakken van Amira overnemen om keyframes te construeren en deze tot een video te renderen.Hier wordt een representatieve tiltserie van data van volledige cellen getoond voor de Spiro Treponema Promesa, gevolgd door een weergave per slice van het gereconstrueerde Tom Agram. Segmentatie van de T Promesa-cel maakt onderscheid tussen het buitenmembraan, het binnenmembraan en oppervlaktestructuren, waaronder oppervlaktekommen en de oppervlakte-hook arcade. De bacterie bevat flagella enculaire motoren, een periplasmatische kegel en pillai.Dit mechanische model laat zien hoe de spirocheet treponema Promesa zwemt; een binnenste cilinder of kern is omsloten door een buitenste schede. De flagellen bewegen als verfrollers tussen de binnenste cilinder en de buitenste schede. Terwijl de flagellen draaien, roteert de binnenste cilinder in tegengestelde richting binnen de buitenste schede.In een niet-viskeuze omgeving roteert de cel nutteloos, maar in viskeuze omgevingen zoals die waarin T Promesa in de natuur wordt aangetroffen, bieden externe vezels of andere objecten weerstand tegen de rotatie van de buitenste schede, waardoor de rotatie van de binnenste cilinder wordt versneld en er materialen beschikbaar komen waartegen de cel kan duwen terwijl hij zich naar voren boort. Hier worden daadwerkelijke T promeus-cellen getoond zoals waargenomen via een lichtmicroscoop. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe elektron cryo-tomografie van bacteriële cellen wordt uitgevoerd.Natuurlijk zijn we ons ervan bewust dat dit type werk aanzienlijke investeringen vereist. De cryo-elektronenmicroscopen en de fluorescentiemicroscopen zijn geavanceerd en kostbaar, en ze moeten ook correct worden geïnstalleerd. Zo bestaat de fundering van deze ruimte uit een mechanisch geïsoleerde betonnen plaat van enkele voet dik, die rust op speciaal verdichte grond.Het airconditioningsysteem is eveneens op maat ontworpen met grote kanalen en flauwe bochten om een constante temperatuur te handhaven zonder tocht of turbulentie. De gordijnen die u ziet, zijn geplaatst om akoestisch geluid te verminderen. Ten slotte verifiëren we dat deze ruimte vrij is van storende elektromagnetische velden.Hoewel de handelingen die we u op de microscoop hebben getoond inmiddels grotendeels geautomatiseerd zijn, treden er nog vaak problemen op die een deskundige diagnose vereisen. Desondanks hopen we dat het bekijken van deze video u heeft geholpen om de procedures en de instrumentatie die bij dit type werk komen kijken, beter te begrijpen. Bedankt voor uw aandacht.

electron-cryotomography-of-bacterial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Chetrit, D., et al. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (2020)The video describes how to prepare Legionella pneumophila samples for cryo-electron tomography by combining bacterial culture, gold nanoparticle marking, and vitrification techniques. The process preserves native cellular structures and enables high-resolution imaging of membrane-associated secretion...

Preparation of Legionella pneumophila for Cryogenic Electron Tomography

Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

We presenteren een protocol over hoe om te verzamelen en te verwerken elektronen cryo-tomogrammen van hele mitochondriën. De techniek biedt gedetailleerd inzicht in de structuur, functie en organisatie van grote membraan eiwitcomplexen in de moedertaal van biologische membranen.

Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.

Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. Synchrone teelt, toezicht door fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie worden gebruikt. Een protocol voor deze methodologieën wordt gepresenteerd, en toekomstige toepassingen en ontwikkelingen worden besproken.

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Het doel van dit protocol is om celadhesie en -groei te richten op gerichte gebieden van rasters voor cryo-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door een aangroeiwerende laag aan te brengen die wordt opgeblazen in door de gebruiker gespecificeerde patronen, gevolgd door afzetting van extracellulaire matrixeiwitten in de patroongebieden voorafgaand aan het zaaien van cellen.

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Dit protocol standaardiseert cryo-elektrontomografie (cryo-ET) voor dik weefsel door hogedrukbevriezing (HPF) te integreren met de wafelmethode, cryogene focus ion beam (cryo-FIB) lift-out en dosissymmetrische, parallelle acquisitie, waardoor uniform dunne lamellen en gevitrificeerde monsters worden opgeleverd voor reproduceerbare in situ-analyse in de hippocampus van de muis.

Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

Verken elektronencryotomografie om de ultrastructuur van bacteriële cellen in hun natuurlijke toestand te visualiseren. Deze methode combineert plunge freezing en high-pressure freezing voor hoogwaardige 3D-reconstructies.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

Meer video's verkennen