Name: Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer intravitale microscopie van de hersenen van muizen om hemodynamische en inflammatoire veranderingen in de piale microcirculatie te volgen. Deze methode biedt inzicht in cerebrale microcirculatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies R01-HL87290, R01-HL87290-S1 en de R01-AI082610 van de National Institutes of Health om LJMC.

1. Craniotomie Een craniotomie in 8-tot-10-week oude muizen moet worden uitgevoerd op voorhand zoals eerder beschreven een, behalve dat een titanium staaf niet is geplaatst in de kop van het dier. De chronische craniale venster is een stabiele voorbereiding waarmee het onderzoek van de pial microcirculatie, zelfs maanden na de implantatie. Meestal voeren we onze studies 2-3 weken na de craniale venster implantatie. 2. Intravitale microscopie <ol><li> Twee-drie weken na craniotomie, lichaamstemperatuur wordt gecontroleerd en vervolgens de muis is licht verdoofd met isofluraan (4% voor inductie, 1-2% voor onderhoud). Lichte anesthesie wordt gebruikt om de dieren stress en ongemak te voorkomen dat tijdens de experimentele procedure. </li><li> Dieren worden vervolgens geplaatst in buikligging op een stereotaxische frame en het hoofd zorgvuldig beveiligd met behulp van oor bars. Het niveau wordt aangepast met behulp van de rechter en linker hendels. Kerntemperatuur van het lichaam wordt onderhouden met behulp van een verwarmingselement. Omdat muizen met cerebrale malaria te ontwikkelen hypothermie, de temperatuur instellingen moeten worden aangepast voor elk dier. </li><li> Het deksel slip op de craniale venster is voorzichtig schoongemaakt met een wattenstaafje bevochtigd met minerale olie en een panoramisch beeld van de schepen onder het raam wordt genomen met de hulp van een stereomicroscoop en een digitale camera (Nikon Coolpix 995, Japan). Het beeld wordt afgedrukt, geïdentificeerd en gedateerd en zal worden gebruikt als een kaart voor de metingen van het schip diameter en rode bloedcellen (RBC) snelheden. </li><li> De muis is dan overgebracht naar een intravitale microscoop stadium (op maat Leica-McBain, San Diego, CA). Een druppel water is geplaatst op de schedel raam te profiteren van de put wordt gevormd door de tandheelkundige acryl, is focus aangepast. De metingen worden uitgevoerd met behulp van een 20X (LUMPFL-WIR, numerieke apertuur 0,6, Olympus) water immersie objectief. Dezelfde schepen zijn zo volgde dat directe vergelijkingen om hun baseline niveaus kunnen worden uitgevoerd waardoor meer robuuste statistiek voor kleine steekproef populaties. Beelden worden opgenomen met een digitale weinig licht high speed camera (Hamamatsu C9300-221, Japan), of weinig licht analoge camera (Cohu 4815, San Diego, CA) aangesloten op een videorecorder tape (JVC, Japan), de tijd gestempeld (MicroImage Video systemen, Boyertown, PA) en een kleur monitor (PELCO, Clovis, CA). De tape is goed geïdentificeerd voordat u de opname start, en de tijd die stempel staat de identificatie van de evenementen door het documenteren van de termijn gedurende welke dergelijke evenementen werden gehercodeerd. </li><li> Een eerste controle van de schepen wordt verwezen naar de kwaliteit van het preparaat te evalueren en als het bloed stroomt in alle schepen. Vervolgens wordt de selectie van de schepen te meten gemaakt en het moet venulen en arteriolen van verschillende diameters (in onze muis pial voorbereidingen, de meeste schepen liggen tussen de 20 en 80μm) en bestrijken verschillende locaties binnen het gebied blootgesteld door het raam. Arteriolen en venulen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden door het controleren van de richting van de bloedstroom in de vertakkingen van het schip (of het distribueert of verzamelt het bloed). In onze studies, worden metingen gedaan in 12 schepen. Precieze locatie van elke plek om te worden gemeten is geannoteerd in het beeld van de pial vasculatuur. </li><li> Voor elke plek, is het schip diameter gemeten met behulp van een afbeelding schaar apparaat (Image Shear, Vista Electronics, San Diego, CA) 2. Eenmaal ter plaatse is geselecteerd, wordt het beeld van het schip uitgelijnd in verticale positie en het beeld wordt geschoren tot de plaats van extremen zijn uitgelijnd en de lezing is gedocumenteerd. Deze waarde kan worden vertaald in micrometers door vorige kalibratie voor elke specifieke vergroting van een Reticle Calibration objectmicrometer (Edmund Optics Inc, Barrington, NJ). </li><li> Elke plek wordt opgenomen gedurende ten minste 30 seconden voor erytrocyten tracking. Voor het volgen wordt een monster van bloed verzameld, en erytrocyten zijn fluorescent gelabelde met de carbocyanine kleurstof Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) en toegediend door middel van de staartader om een verkrijgen van in-vivo concentratie van ~ 0,4-0,5% 3. Bij dieren die besmet zijn met Plasmodium berghei ANKA (PBA) die het groen fluorescerend eiwit (GFP-PBA, een donatie van de Malaria Research en referentiereagens Resource Center MR4, Manassas, VA, neergelegd door CJ Janse en AP Waters), geen infuus van gelabelde cel nodig is. De videobeelden worden opgenomen met 150 frames per seconde. Dit tarief is ingesteld om een ​​tot zes afbeeldingen van een cel te verkrijgen over een video frame voor de bepaling van snelheden tot 8 mm / s. De video beelden worden gedigitaliseerd met een personal computer met behulp van Adobe Premier 4.0-software, en de XY-coördinaten gegevens voor elke cel beeld worden verkregen met behulp van SigmaScan Pro 4.0 software (SPSS Chicago, IL) 4. Cel posities worden handmatig in plaats bepaald door beeldanalyse, gezien het feit dat het oog van een getrainde waarnemer werd aangetoond dat een goede inschatting van de locatie van het centrum van een cel, die gevenh in het algemeen overeenkomt met de locatie van de maximale fluorescentie waargenomen voor de meeste mobiele oriëntaties. Meerdere bepalingen van de positie en snelheid zijn gemaakt voor elke cel en gemiddeld te betekenen RBC snelheid te verkrijgen. </li><li> Toen RBC snelheidsmetingen offline worden uitgevoerd, is de totale observatietijd voor elke muis niet hoger dan 10-15 minuten het minimaliseren van de Cardiodepressieve effecten van de anesthesie. </li><li> Zodra schip diameter en RBC snelheid metingen beschikbaar zijn, de berekening van de bloedstroom in elk vat kan worden gemaakt met behulp van de formule: Q = V x π (D / 2) 2, waarbij Q = de bloedstroom, V = RBC snelheid en D = schip diameter. </li><li> Deze procedures kunnen worden herhaald in de tijd. Bijvoorbeeld, in het muismodel van cerebrale malaria, voeren we dagelijks metingen te beginnen op dag 4 van de infectie. De verkregen waarden elke dag voor elke muis zijn genormaliseerd ten opzichte van dag 0 (pre-infectie), die wordt beschouwd als 100% te zijn. </li><li> Naast de bloedvaten en de doorbloeding metingen, kunnen extra evaluaties worden uitgevoerd, bijvoorbeeld een betere beoordeling van de perfusie en de analyse van de leukocyten en / of bloedplaatjes rollen en de naleving in pial schepen. Deze metingen worden uitgevoerd met behulp van fluorescent gelabelde markers. In het geval van malaria, kunnen we ook ontdekken circuleren of aanhanger parasieten door middel van het gebruik van de PBA stam die GFP uitdrukt. </li><li> Voor perfusie assessment gebruiken we een oplossing van FITC-gelabelde albumine (Sigma, St. Louis, MO 50μg/mouse), en om de naleving van leukocyten pial schepen we gebruik van antilichamen tegen het pan-leukocyten marker CD45 gelabeld met Texas Red (TXR) kwantificeren ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Voor deze, 25μL van de albumine-FITC (2mg/mL) en 20μL van de anti-CD45-PE antilichamen (200μg/mL) zijn gemengd en geïnjecteerd in de voorverwarmde staartader. De muis kan dan direct worden afgebeeld, maar als lekkage metingen zullen nemen albumine-FITC mag circuleren gedurende 15 minuten. Groene fluorescentie (518nm) uitgezonden door albumine-FITC en GFP (PBA-GFP pRBC) is vastgelegd met en ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), en anti-CD45-TXR fluorescentie (615nm) is verlaten en vastgelegd met een Vivid Standaard: XF42. </li><li> De fluorescent gelabelde albumine maakt een betere visualisatie van de vasculaire netwerk, inclusief doordringende schepen, en het is vooral nuttig bij de ziekte van staten zoals cerebrale malaria om te controleren op niet-doorbloed of onder-geperfuseerd schepen. Het kan ook gebruikt worden om vasculaire lekkage 5 te meten. </li><li> De fluorescent gelabelde anti-CD45 antilichamen maken het gemakkelijk te identificeren en te kwantificeren leukocyten rollen en adhesie aan pial schepen. Om te voorkomen dat bias in de kwantificering, we kwantificeren rollen en de hechting op dezelfde plekken vooraf gedefinieerde om de bloedstroom te meten. Kwantificering van leukocyt-adhesie wordt gemaakt door het tellen van het aantal leukocyten in een 100 urn-schip lengte. Rolling wordt gekwantificeerd door het tellen van het aantal leukocyten reist met een snelheid beduidend langzamer dan het bloed snelheid van 100 urn in dezelfde lengte, gedurende 30 seconden. </li></ol> 3. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. (Stap 2.6) Foto&#39;s van de muis pial vasculaire netwerk toegankelijk via het craniale raam. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. (Stappen 3,1-3,5) Schematische weergave van de set-up voor de intravitale microscopie van de muis pial microcirculatie. 1: intravitale microscoop; 2: 20x water immersie objectief, 3: lichtbron; 4a: digitale weinig licht high-speed camera, 4b: analoge camera; 5: muis in de stereotaxisch frame; 6: computer monitor; 7: analoge Shearer monitoren laten zien hoe het beeld scheren (pijl) wordt gedaan om vat diameter te meten. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. (Stap 3.6 tot 3,8) Microvasculaire rode bloedcellen snelheid van metingen door het volgen van de cel met hoge snelheid fluorescentie-video-opnamen. Foto A tot F zijn sequentie beelden van een pial schip, met een enkele beweging RBC het oversteken van de microscopische veld dat is afgebakend door de camera. Handmatig bepalen van het frame per frame posities van 15 of meer cellen kruising het veld, met zijn pre-gekalibreerde afstand, maakt de berekening van de gemiddelde snelheid van RBC in elk vat met behulp van een Excel-spreadsheet. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. (Stap 3.9) Gegevens van een representatief experiment met de veranderingen in de pial bloedstroom in de tijd Plasmodium berghei ANKA (PBA) geïnfecteerde muizen (n = 5) en bij niet-geïnfecteerde controle muizen (n = 5). Terwijl in controle muizen de pial bloedstroom is relatief stabiel in de tijd, PBA-geïnfecteerde muizen tonen een duidelijke vermindering van de bloedstroomten tijde van de cerebrale malaria ontwikkeling (dag 6). De gegevens zijn het gemiddelde ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. (Stap 4,3) Een groot aantal leukocyten aanhanger van pial schepen van een muis die besmet zijn met Plasmodium berghei ANKA, zoals onthuld door kleuring met anti-CD45-Texas Red fluorescerende antilichamen.

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

De intravitale microscopie hier beschreven methode biedt een unieke en krachtige tool voor gedetailleerde observatie van de pial microcirculatie in de muis. Het staat de afzonderlijke vermelding van de individuele arteriolen en venulen en het meten van veranderingen van een aantal parameters zoals schip diameters, RBC snelheden, de doorbloeding, hechting aan en rollen van leukocyten, bloedplaatjes en andere bloed-elementen, vasculaire lekkage, weefsel pH en pO2 en mogelijk nog vele andere toepassingen. De in vivo</e...

<table><tbody><tr><td>Isofluraan</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Carbocyanine-kleurstof Dil </td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-TxR Ab</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

intravitale microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten cranial window

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Dit experimenteel model werd ontworpen om de muis te pial microcirculatie te beoordelen tijdens acute en chronische, fysiologische en pathofysiologische hemodynamische, inflammatoire en metabolische voorwaarden, met behulp van in vivo fluorescentie microscopie. Een gesloten craniale raam is geplaatst over het linker parietooccipitalis cortex van de muizen. De lokale microcirculatie wordt opgenomen in real time door het venster met behulp van epi en fluorescentie verlichting, en metingen van de schepen diameters en rode bloedcellen (RBC) snelheden worden uitgevoerd. RBC snelheid is gemeten met behulp van real-time cross-correlatie-en / of fluorescent gelabelde erytrocyten. Leukocyten en bloedplaatjes naleving van pial schepen en beoordeling van de perfusie en vasculaire lekkage worden gemaakt met behulp van fluorescentie-label markers zoals albumine-FITC en anti-CD45-antilichamen TXR. Microcirculatie kan herhaaldelijk worden opgenomen video over meerdere dagen. We gebruiken voor de eerste keer dat de venster sluiten hersenen intravitale microscopie aan de pial microcirculatie om dynamische veranderingen volgen in de loop van Plasmodium berghei ANKA infectie bij muizen en laten zien dat de expressie van CM wordt geassocieerd met microcirculatie stoornissen gekenmerkt door vaatvernauwing, sterke afname in het bloed studie flow en uiteindelijk vasculaire instorten.

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Dit experimentele model is ontworpen om de piale microcirculatie bij muizen te beoordelen tijdens acute en chronische, fysiologische en pathofysiologische hemodynamische...

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de microcirculatie in de hersenen van de muis middels intravitale microscopie, wat het mogelijk maakt om dynamische veranderingen in hemodynamische en inflammatoire markers in de microcirculatie van de pile over langere perioden te volgen. Deze techniek is ontwikkeld bij het La Jolla Bioengineering Institute, waar deze voor vele soorten studies is gebruikt. Bijvoorbeeld voor de follow-up van hemodynamische veranderingen tijdens het verloop van een Plasmodium burgi onca-infectie en op het moment van expressie van cerebrale malaria.Dit wordt bereikt door eerst twee weken vóór de intravitale microscopiestudies een chronisch craniaal venster te implanteren. De tweede stap van de procedure is het vastleggen van de algemene morfologie van het craniaal venster met een digitale afbeelding met een hoge resolutie bij een lage vergroting. De derde stap van de procedure is het verkrijgen van intravitale microscopiebeelden met behulp van conventionele en fluorescente verlichting, en het selecteren van specifieke studieplaatsen voor online metingen van de vatdiameter en de RBC-snelheid.De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van een intravitale analyse van de adhesie van leukocyten en bloedplaatjes in de pilaire vaten via fluorescentielabel specifieke antilichamen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die in vivo microcirculatoire veranderingen in cerebrale spiegelmodellen van fysiologische, pathofysiologische of ziekelijke condities aantonen via intravitale hersenmicroscopie, om hemodynamische veranderingen te vaststellen die geassocieerd zijn met deze condities. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de hersenen observeren in hun fysiologische omgeving zonder ze bloot te stellen aan externe agentia of een kunstmatig medium; intravitale microscopie heeft, vergeleken met magnetic resonance imaging en angiografie, een ruimtelijke en temporele resolutie die ons in staat stelt om van het microscopische niveau naar het microscopische niveau te kijken.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de fysiologie en pathofysiologie van de hersenmicrocirculatie, zoals hemodynamische en inflammatoire veranderingen tijdens acute en chronische ziekten. Twee tot drie weken voorafgaand aan de intravitale microscopie wordt een craniotomie uitgevoerd bij muizen van acht tot 10 weken oud, zoals eerder gedemonstreerd, met uitzondering van het feit dat er geen titanium staaf in de kop van het dier wordt geplaatst. Het chronische craniale venster is een stabiele preparatie, waardoor onderzoek van de microcirculatie in de hersenen mogelijk blijft, zelfs maanden na implantatie op de dag van het experiment.Controleer eerst de lichaamstemperatuur van het dier voordat u het dier in een stereotaxisch frame plaatst en infuseer vooraf bereide fluorescentielabelled erytrocyten via de staartvene van de muis. Dit maakt het volgen van erytrocyten mogelijk, wat later zal worden gedemonstreerd. Anestheseer de muis vervolgens licht met isofluoraan.4% voor inductie, 1 tot 2% voor instandhouding. Plaats het dier vervolgens in buikligging in een stereotaxisch frame op een warmtemat. Fixeer de kop zorgvuldig met de oorstaven en stel het niveau af met de rechter- en linkerhendel.Reinig het dekglas op het craniële venster voorzichtig met een wattenstaafje dat is bevochtigd met minerale olie. Maak vervolgens, met behulp van een stereomicroscoop die is aangesloten op een digitale camera, enkele panoramische foto's van de vaten onder het venster. Selecteer na het overzetten van de panoramische foto's naar een computer de beste foto om te worden afgedrukt, geïdentificeerd en gedateerd.Deze foto zal worden gebruikt als kaart voor metingen van de vatdiameter en de snelheden van rode bloedcellen, wat vervolgens wordt gedemonstreerd om te beginnen met intravitale microscopie. Verplaats de muis naar een aangepaste opstelplaats van de intravitale microscoop. Plaats een druppel water op het craniële venster, waarbij gebruik wordt gemaakt van de uitsparing gevormd door de tandheelkundige acrylaat.Er wordt een 20 x waterimmersie-objectief gebruikt met een numerieke apertuur van 0,5. Beelden worden vastgelegd met twee camera's: een digitale camera voor weinig licht met een hoge snelheid die is aangesloten op een computer en monitor, en een analoge camera voor weinig licht die is aangesloten op een VCR-bandrecorder, een tijdstempel en een kleurenmonitor. Controleer voorafgaand aan de selectie van vaten voor meting de vaten om de kwaliteit van de preparatie te evalueren; indien er in alle vaten bloed stroomt, kunnen de te meten vaten worden geselecteerd. Deze moeten venen en arteriën van verschillende diameters omvatten en verschillende locaties beslaan binnen het door het venster blootgestelde gebied.In ons experiment selecteren we 12 vaten voor meting terwijl u verschillende velden binnen het craniële venster bekijkt. Om de vaten te selecteren, annoteert u de precieze locatie van elk te meten punt op de eerder gemaakte foto van de PY-vasculatuur; voor elk punt wordt de vatdiameter gemeten met behulp van een image shear-apparaat. Zodra het punt is geselecteerd, wordt het beeld van het vat in de verticale positie uitgelijnd en wordt het beeld geschoven tot aan de tegenovergestelde zijde.De uitersten zijn uitgelijnd en de aflezing is gedocumenteerd. Voor het volgen van erytrocyten wordt elke plek gedurende ten minste 30 seconden vastgelegd door de digitale camera, waarbij de videobeelden worden opgenomen met 150 frames per seconde. Deze snelheid is ingesteld om één tot zes beelden van een cel per videoframe te verkrijgen voor de bepaling van snelheden tot zes millimeters per seconde.Zodra de gegevensverzameling is voltooid, wordt de muis uit het stereotaxische frame gehaald en teruggeplaatst in de kooi om met behulp van geschikte software te herstellen van de anesthesie. De verkregen videobeelden worden gedigitaliseerd en de XY-coördinaatgegevens voor elk celbeeld worden bepaald. De celposities worden handmatig vastgesteld in plaats van via beeldanalyse.Aangezien het oog van een getrainde waarnemer een goede schatting geeft van de locatie van het centrum van een cel, wat over het algemeen overeenkomt met de locatie van de waargenomen maximale fluorescentie. Voor de meeste celoriëntaties worden de positie en snelheid bepaald voor 15 cellen in elk vat. Er wordt een gemiddelde berekend om de gemiddelde RBC-snelheid te verkrijgen zodra de metingen van de vatdiameter en de RBC-snelheid beschikbaar zijn.De berekening van de bloedstroom in elk vat kan worden uitgevoerd met de formule Q is gelijk aan D gedeeld door twee in het kwadraat vermenigvuldigd met PI vermenigvuldigd met V, waarbij Q staat voor de bloedstroom, V voor de RBC-snelheid en D voor de vatdiameter voor perfusiebeoordeling en analyse van leukocytenadhesie in capillaire vaten. Intravitale microscopie wordt uitgevoerd op een dier dat is geïnfuseerd met een mengsel van FSE-gelabeld albumine en antilichamen tegen de pan-leukocytenmarker CD 45 gelabeld met Texas Red. Het fluorescent gelabelde albumine maakt een verbeterde visualisatie van het vasculaire netwerk mogelijk, inclusief penetrerende vaten, en is bijzonder nuttig bij ziektebeelden zoals cerebrale malaria om niet-geperfuseerde of ondergeperfuseerde vaten op te sporen.De fluorescentielabelled anti-CD 45-antilichamen maken het eenvoudig om het rollen en de adhesie van leukocyten aan de vaten te identificeren en te kwantificeren. De kwantificering van de leukocytenadhesie gebeurt door het aantal leukocyten in een vatlengte van 100 micron te tellen. Rollen wordt gekwantificeerd door het aantal leukocyten te tellen dat zich voortbeweegt met een snelheid die significant lager is dan de bloedsnelheid in dezelfde lengte van 100 micron gedurende 30 seconden. Getoond.Hier is een voorbeeld van microvasculaire metingen van de snelheid van rode bloedcellen door middel van celtracking via hogesnelheidsfluorescentie. De videoplaatjes A tot en met F zijn sequentiebeelden van de microcirculatie. Elk plaatje representeert de positie van een enkele stromende rode bloedcel, die frame voor frame is vastgelegd door de hogesnelheidscamera.Deze grafiek van een representatief experiment toont de veranderingen in de bloedstroom van de stapel in de loop van de tijd. Bij muizen geïnfecteerd met plasmodium, burgi en onca, terwijl bij controlemuizen de bloedstroom van de stapel relatief stabiel blijft over de tijd. PBA-geïnfecteerde muizen vertonen een duidelijke afname van de bloedstroom op het moment van de ontwikkeling van cerebrale malaria.Op dag zes onthult kleuring met anti-CD 45, Texas red fluorescentie-antilichamen een groot aantal leukocyten dat hecht aan de longvaten van een muis die is geïnfecteerd met Plasmodium berghei anka. Deze procedure heeft een breed scala aan toepassingen naast de specifieke taak die hier vandaag wordt getoond. Elke optische techniek die in vivo kan worden gebruikt, kan aan dit model worden aangepast, waardoor parameters zoals weefsel, zuurstofgehalte in weefsel, pH, reactieve zuurstofsoorten en de interactie van het endotheel met leukocyten in dit model kunnen worden bestudeerd.

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Corticale doorbloeding dynamiek kan worden bestudeerd in vivo door beeldvorming fluorescente kleurstoffen dextran geïnjecteerd in de staartader van knaagdieren met twee-foton microscopie. Deze video laat zien hoe u foto doorbloeding dynamiek in neocortex van muizen door middel van een met glas overdekt craniale venster voorbereiding.

Een methode voor 2-Photon Imaging van de bloedstroom in de neocortex door middel van een Cranial Window

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

In this video, we perform intravital imaging of pre-injected cancer cells in a mouse model via an implanted cranial window. This high-resolution time-lapse imaging technique enables the study of dynamic behavior of cancer cells in the live mouse.

Cranial Window-based Intravital Imaging in a Mouse Model: An Imaging Technique to Study the Behavior of Pre-injected Cancer Cells in the Brain of a Murine Model

Source: Sweeney, A. M., et al. In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the process of visualizing cerebrospinal fluid (CSF) flow in a mouse brain using fluorescence imaging. A fluorescent tracer is injected into the cisterna magna (CM), allowing its movement with CSF to be tracked through the subarachnoid and perivascular spaces. Time-lapse imaging captures the tracer's journey,...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport in a Mouse Brain Using Fluorescence Macroscopy

Chirurgische occlusie van een distale middelste cerebrale slagader tak (MCAo) is een veel gebruikte model in de experimentele beroerte onderzoek. Dit manuscript beschrijft de basistechniek vaste MCAo, gecombineerd met het inbrengen van een laterale craniale venster, dat de mogelijkheid voor longitudinaal intravitale microscopie bij muizen heeft.

Laterale Chronische Cranial Window Voorbereiding Maakt In Vivo Observatie Na distale midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Dit manuscript beschrijft een procedure om de herinrichting van de cerebrovasculature volgen tijdens amyloïde plaque accumulatie in vivo met behulp van longitudinale twee-foton microscopie. Een uitgedunde schedel bereiden voor de visualisatie van fluorescente kleurstoffen om de progressie van cerebrovasculaire schade te beoordelen in een muizenmodel van de ziekte van Alzheimer.

lengte-<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van de Cerebrovasculature: Relevantie voor CNS ziekten

Transcraniële optische beeldvorming maakt het mogelijk om het transport van cerebrospinale vloeistof in de cortex van levende muizen door middel van een intacte schedel te Imaging.

In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Deze studie demonstreert de toediening van een repetitief traumatisch hersenletsel aan muizen en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende intravitale beeldvorming van een tot expressie gebracht neuron EGFP met behulp van twee-fotonmicroscopie.

Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

Leer intravitale microscopie van de hersenen van muizen om hemodynamische en inflammatoire veranderingen in de piale microcirculatie te volgen. Deze methode biedt inzicht in cerebrale microcirculatie.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Meer video's verkennen