Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de microcirculatie in de hersenen van de muis middels intravitale microscopie, wat het mogelijk maakt om dynamische veranderingen in hemodynamische en inflammatoire markers in de microcirculatie van de pile over langere perioden te volgen. Deze techniek is ontwikkeld bij het La Jolla Bioengineering Institute, waar deze voor vele soorten studies is gebruikt. Bijvoorbeeld voor de follow-up van hemodynamische veranderingen tijdens het verloop van een Plasmodium burgi onca-infectie en op het moment van expressie van cerebrale malaria.

Dit wordt bereikt door eerst twee weken vóór de intravitale microscopiestudies een chronisch craniaal venster te implanteren. De tweede stap van de procedure is het vastleggen van de algemene morfologie van het craniaal venster met een digitale afbeelding met een hoge resolutie bij een lage vergroting. De derde stap van de procedure is het verkrijgen van intravitale microscopiebeelden met behulp van conventionele en fluorescente verlichting, en het selecteren van specifieke studieplaatsen voor online metingen van de vatdiameter en de RBC-snelheid.

De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van een intravitale analyse van de adhesie van leukocyten en bloedplaatjes in de pilaire vaten via fluorescentielabel specifieke antilichamen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die in vivo microcirculatoire veranderingen in cerebrale spiegelmodellen van fysiologische, pathofysiologische of ziekelijke condities aantonen via intravitale hersenmicroscopie, om hemodynamische veranderingen te vaststellen die geassocieerd zijn met deze condities. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de hersenen observeren in hun fysiologische omgeving zonder ze bloot te stellen aan externe agentia of een kunstmatig medium; intravitale microscopie heeft, vergeleken met magnetic resonance imaging en angiografie, een ruimtelijke en temporele resolutie die ons in staat stelt om van het microscopische niveau naar het microscopische niveau te kijken.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de fysiologie en pathofysiologie van de hersenmicrocirculatie, zoals hemodynamische en inflammatoire veranderingen tijdens acute en chronische ziekten. Twee tot drie weken voorafgaand aan de intravitale microscopie wordt een craniotomie uitgevoerd bij muizen van acht tot 10 weken oud, zoals eerder gedemonstreerd, met uitzondering van het feit dat er geen titanium staaf in de kop van het dier wordt geplaatst. Het chronische craniale venster is een stabiele preparatie, waardoor onderzoek van de microcirculatie in de hersenen mogelijk blijft, zelfs maanden na implantatie op de dag van het experiment.

Controleer eerst de lichaamstemperatuur van het dier voordat u het dier in een stereotaxisch frame plaatst en infuseer vooraf bereide fluorescentielabelled erytrocyten via de staartvene van de muis. Dit maakt het volgen van erytrocyten mogelijk, wat later zal worden gedemonstreerd. Anestheseer de muis vervolgens licht met isofluoraan.

4% voor inductie, 1 tot 2% voor instandhouding. Plaats het dier vervolgens in buikligging in een stereotaxisch frame op een warmtemat. Fixeer de kop zorgvuldig met de oorstaven en stel het niveau af met de rechter- en linkerhendel.

Reinig het dekglas op het craniële venster voorzichtig met een wattenstaafje dat is bevochtigd met minerale olie. Maak vervolgens, met behulp van een stereomicroscoop die is aangesloten op een digitale camera, enkele panoramische foto's van de vaten onder het venster. Selecteer na het overzetten van de panoramische foto's naar een computer de beste foto om te worden afgedrukt, geïdentificeerd en gedateerd.

Deze foto zal worden gebruikt als kaart voor metingen van de vatdiameter en de snelheden van rode bloedcellen, wat vervolgens wordt gedemonstreerd om te beginnen met intravitale microscopie. Verplaats de muis naar een aangepaste opstelplaats van de intravitale microscoop. Plaats een druppel water op het craniële venster, waarbij gebruik wordt gemaakt van de uitsparing gevormd door de tandheelkundige acrylaat.

Er wordt een 20 x waterimmersie-objectief gebruikt met een numerieke apertuur van 0,5. Beelden worden vastgelegd met twee camera's: een digitale camera voor weinig licht met een hoge snelheid die is aangesloten op een computer en monitor, en een analoge camera voor weinig licht die is aangesloten op een VCR-bandrecorder, een tijdstempel en een kleurenmonitor. Controleer voorafgaand aan de selectie van vaten voor meting de vaten om de kwaliteit van de preparatie te evalueren; indien er in alle vaten bloed stroomt, kunnen de te meten vaten worden geselecteerd. Deze moeten venen en arteriën van verschillende diameters omvatten en verschillende locaties beslaan binnen het door het venster blootgestelde gebied.

In ons experiment selecteren we 12 vaten voor meting terwijl u verschillende velden binnen het craniële venster bekijkt. Om de vaten te selecteren, annoteert u de precieze locatie van elk te meten punt op de eerder gemaakte foto van de PY-vasculatuur; voor elk punt wordt de vatdiameter gemeten met behulp van een image shear-apparaat. Zodra het punt is geselecteerd, wordt het beeld van het vat in de verticale positie uitgelijnd en wordt het beeld geschoven tot aan de tegenovergestelde zijde.

De uitersten zijn uitgelijnd en de aflezing is gedocumenteerd. Voor het volgen van erytrocyten wordt elke plek gedurende ten minste 30 seconden vastgelegd door de digitale camera, waarbij de videobeelden worden opgenomen met 150 frames per seconde. Deze snelheid is ingesteld om één tot zes beelden van een cel per videoframe te verkrijgen voor de bepaling van snelheden tot zes millimeters per seconde.

Zodra de gegevensverzameling is voltooid, wordt de muis uit het stereotaxische frame gehaald en teruggeplaatst in de kooi om met behulp van geschikte software te herstellen van de anesthesie. De verkregen videobeelden worden gedigitaliseerd en de XY-coördinaatgegevens voor elk celbeeld worden bepaald. De celposities worden handmatig vastgesteld in plaats van via beeldanalyse.

Aangezien het oog van een getrainde waarnemer een goede schatting geeft van de locatie van het centrum van een cel, wat over het algemeen overeenkomt met de locatie van de waargenomen maximale fluorescentie. Voor de meeste celoriëntaties worden de positie en snelheid bepaald voor 15 cellen in elk vat. Er wordt een gemiddelde berekend om de gemiddelde RBC-snelheid te verkrijgen zodra de metingen van de vatdiameter en de RBC-snelheid beschikbaar zijn.

De berekening van de bloedstroom in elk vat kan worden uitgevoerd met de formule Q is gelijk aan D gedeeld door twee in het kwadraat vermenigvuldigd met PI vermenigvuldigd met V, waarbij Q staat voor de bloedstroom, V voor de RBC-snelheid en D voor de vatdiameter voor perfusiebeoordeling en analyse van leukocytenadhesie in capillaire vaten. Intravitale microscopie wordt uitgevoerd op een dier dat is geïnfuseerd met een mengsel van FSE-gelabeld albumine en antilichamen tegen de pan-leukocytenmarker CD 45 gelabeld met Texas Red. Het fluorescent gelabelde albumine maakt een verbeterde visualisatie van het vasculaire netwerk mogelijk, inclusief penetrerende vaten, en is bijzonder nuttig bij ziektebeelden zoals cerebrale malaria om niet-geperfuseerde of ondergeperfuseerde vaten op te sporen.

De fluorescentielabelled anti-CD 45-antilichamen maken het eenvoudig om het rollen en de adhesie van leukocyten aan de vaten te identificeren en te kwantificeren. De kwantificering van de leukocytenadhesie gebeurt door het aantal leukocyten in een vatlengte van 100 micron te tellen. Rollen wordt gekwantificeerd door het aantal leukocyten te tellen dat zich voortbeweegt met een snelheid die significant lager is dan de bloedsnelheid in dezelfde lengte van 100 micron gedurende 30 seconden. Getoond.

Hier is een voorbeeld van microvasculaire metingen van de snelheid van rode bloedcellen door middel van celtracking via hogesnelheidsfluorescentie. De videoplaatjes A tot en met F zijn sequentiebeelden van de microcirculatie. Elk plaatje representeert de positie van een enkele stromende rode bloedcel, die frame voor frame is vastgelegd door de hogesnelheidscamera.

Deze grafiek van een representatief experiment toont de veranderingen in de bloedstroom van de stapel in de loop van de tijd. Bij muizen geïnfecteerd met plasmodium, burgi en onca, terwijl bij controlemuizen de bloedstroom van de stapel relatief stabiel blijft over de tijd. PBA-geïnfecteerde muizen vertonen een duidelijke afname van de bloedstroom op het moment van de ontwikkeling van cerebrale malaria.

Op dag zes onthult kleuring met anti-CD 45, Texas red fluorescentie-antilichamen een groot aantal leukocyten dat hecht aan de longvaten van een muis die is geïnfecteerd met Plasmodium berghei anka. Deze procedure heeft een breed scala aan toepassingen naast de specifieke taak die hier vandaag wordt getoond. Elke optische techniek die in vivo kan worden gebruikt, kan aan dit model worden aangepast, waardoor parameters zoals weefsel, zuurstofgehalte in weefsel, pH, reactieve zuurstofsoorten en de interactie van het endotheel met leukocyten in dit model kunnen worden bestudeerd.