Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Het algemene doel van deze procedure is om de microcirculatie in de muizenhersenen te bestuderen door middel van intravitale microscopie, waardoor dynamische veranderingen in hemodynamische en inflammatoire markers in de pile microcirculatie over langere perioden kunnen worden gevolgd. Deze techniek is ontwikkeld bij het La Jolla Bioengineering Institute, waar het voor vele soorten studies werd gebruikt. Bijvoorbeeld, het opvolgen van hemodynamische veranderingen tijdens het verloop van plasmodium burgi onca infectie, en op het moment van expressie van cerebrale malaria.

Dit wordt bereikt door eerst een chronische craniale venster twee weken voorafgaand aan de intravitale microscopiestudies te implanteren. De tweede stap van de procedure is om de algemene morfologie van het craniale venster vast te leggen met behulp van een hoog oplossende digitale afbeelding bij lage vergroting. De derde stap van de procedure is om intravitale microscopiebeelden te verkrijgen met behulp van conventionele en fluorescente verlichting, en specifieke studielocaties te selecteren voor online metingen van vaatdiameter en RBC-snelheid.

De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van intravitale analyse van leukocyten en plaatjeskleefheid in de pile-vaten via fluorescente gelabelde specifieke antilichamen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die in vivo microcirculatoire veranderingen in cerebrale weerspiegelingsmodellen van fysiologische pathofysiologische of zieke toestanden laten zien door middel van intravitale microscopie in de hersenen om hemodynamische veranderingen geassocieerd met deze toestanden vast te stellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat we de hersenen in zijn fysiologische omgeving observeren zonder hem bloot te stellen aan externe agentia of kunstmatig medium intravitale microscopie in vergelijking met beeld magnetische resonantie en angiografie heeft een ruimtelijke en temporele resolutie en stellen ons in staat om van microscopisch naar microscopisch niveau te kijken.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de fysiologie en pathofysiologie van de hersenmicrocirculatie te beantwoorden, zoals hemodynamische en inflammatoire veranderingen tijdens acute en chronische ziekte Twee tot drie weken vóór intravitale microscopie. Een craniotomie wordt uitgevoerd bij muizen van acht tot 10 weken oud, waarbij een titaniumstaaf niet in het hoofd van het dier wordt geplaatst. Het chronische craniale venster is een stabiele voorbereiding, waardoor onderzoek van de pile microcirculatie zelfs maanden na implantatie op de dag van het experiment mogelijk is.

Controleer eerst de lichaamstemperatuur van het dier voordat u het dier in een stereotaxisch frame plaatst dat eerder geïnfuseerd was met fluorescerend gelabelde erytrocyten via de staarvene van de muis. Dit maakt erytrocyttracking mogelijk, die later zal worden gedemonstreerd. Vervolgens verdooft u de muis licht met isof fluorine.

4%voor inductie, een tot 2%voor onderhoud. Plaats vervolgens het dier in een buikligging in een stereotaxisch frame op een verwarmingskussen. Bevestig het hoofd voorzichtig met behulp van de oorbeugels en pas het niveau aan met behulp van de rechter- en linkerhendels.

Maak voorzichtig de deksel op het craniale venster schoon met een wattenstaafje dat is bevochtigd met mineraalolië. Gebruik vervolgens een stereomicroscoop verbonden met een digitale camera om een ​​paar panoramische foto's van de vaten onder het venster te maken. Selecteer na het overbrengen van de panoramische foto's naar een computer de beste om te worden afgedrukt, geïdentificeerd en gedateerd.

Deze foto wordt gebruikt als kaart voor metingen van vaatdiameter en rode bloedcelsnelheden, die als volgende zullen worden gedemonstreerd om intra vitaal microscopie te beginnen. Breng de muis over naar een aangepaste intravitale microscoopstand. Plaats een druppel water op het craniale venster door gebruik te maken van de kuil gevormd door de tandheelkundige acryl.

Er wordt gebruik gemaakt van een 20 x water-immersieobjectief met een numerieke opening van 0,5. Beelden worden opgenomen met behulp van twee camera's, een digitale laaglicht, hoge snelheidscamera verbonden met een computer en monitor, en een laaglicht analoog camera verbonden met een VCR-band, een tijdstempel en een kleurenmonitor. Voordat u vaten selecteert voor meting, controleert u de vaten om de kwaliteit van de voorbereiding te evalueren en als er bloed in alle vaten stroomt, selecteert u de vaten die moeten worden gemeten. Ze moeten locaties en arteriën van verschillende diameters omvatten en verschillende locaties binnen het gebied bedekken dat door het venster wordt blootgesteld.

In ons experiment selecteren we 12 vaten voor meting terwijl u verschillende velden binnen het craniale venster bekijkt. Om de vaten te selecteren, annoteert u de precieze locatie van elke plek die moet worden gemeten in de foto van het PY-vat dat eerder voor elke plek is genomen voor elke plek. De vaatdiameter wordt gemeten met behulp van een apparaat voor beeldvervorming. Zodra de plek is geselecteerd, wordt het beeld van het vat in de verticale positie uitgelijnd en wordt het beeld gescheurd tot het tegenovergestelde.

De uitersten worden uitgelijnd en de lezing wordt gedocumenteerd. Voor erytrocyttracking wordt elke plek gedurende minimaal 30 seconden door de digitale camera opgenomen en worden de videobeelden met 150 frames per seconde opgenomen. Deze snelheid is ingesteld om één tot zes beelden van een cel op één videoframe te verkrijgen voor bepaling van snelheden tot zes millimeter per seconde.

Zodra de gegevensverzameling is voltooid, haalt u de muis uit het stereotaxisch frame en brengt u hem terug in zijn kooi om te herstellen van de anesthesie met behulp van geschikte software. De verkregen videobeelden worden gedigitaliseerd en XY. Coördinaatgegevens voor elk celbeeld worden verkregen. Celposities worden handmatig bepaald in plaats van door beeldanalyse.

Aangezien het oog van een getrainde waarnemer een goede schatting geeft van de locatie van het centrum van een cel, die in het algemeen overeenkomt met de locatie van maximale waargenomen fluorescentie. Voor de meeste celafstemmingen worden posities en snelheden bepaald voor 15 cellen in elk vat. Een gemiddelde om gemiddelde RBC-snelheid te verkrijgen zodra vaatdiameter en RBC-snelheid metingen beschikbaar zijn.

Berekening van de bloedstroom in elk vat kan worden gemaakt door de formule Q gelijk aan D