Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium
15 juli 2010
Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor cryopreserving menselijke iPS cellen in KnockOut SR cryopreservatie medium en het herstellen van deze cellen in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium of feeder-based KnockOut SR medium.
Het algemene doel van deze procedure is om IPS-cellen te cryopreserveren en te herstellen in feeder-gebaseerde of feeder-vrije kweekcondities. Dit wordt bereikt door eerst uw IPC's te verpakken zoals u dat normaal zou doen. De tweede stap van de procedure is om de cellen over te brengen naar serumvrij bevriezingsmedium.
De derde stap van de procedure is om te cryopreserveren zoals u dat normaal zou doen. De laatste stap van de procedure is om de cellen te ontdooien en met onderhoud te beginnen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een succesvolle bevriezing en ontdooiing van IPS-cellen in serumvrij bevriezingsmedium aantonen door gezonde morfologie en herstel na het ontdooien.
Hallo, ik ben Kate Wagner op de GCO-site bij Life Technologies. Visuele demonstratie van dit protocol is cruciaal omdat IPC's erg gevoelig kunnen zijn voor bevriezing en T fine. Wat dit protocol gemakkelijker maakt, is dat knockout serum vervanging kan worden gebruikt gedurende uw hele workflow.
Tegenwoordig omvat de KSR-familie van producten een volledige lijst van media en reagentia voor feeder-gebaseerde voeding, voeding vrij en xeno-vrije kweek van uw embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. KSR kan worden gebruikt voor derivatiegroei, cryo-preservering, expansie en de eerste aanvankelijke stappen van differentiatie. De volgende video laat u zien hoe u zichzelf kunt ontdooien en bevriezen met behulp van KSR in een Peter-vrije machine.
Om deze procedure te beginnen. Verwarm eerst een geschikte hoeveelheid volledige feeder-vrije medium tot 37 graden Celsius in een waterbad, aspireer het gebruikte medium uit de kweekbak, wat een 60 millimeter schotel is. In dit geval, spoel de humane geïnduceerde pluripotente stamcellen twee keer met DPBS.
Voeg vervolgens een milliliter dispa toe aan de schotel. Incubeer de schotel gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius. Daarna aspireer de dispa-oplossing en was de cellen voorzichtig met DPBS.
Voeg vervolgens compleet feeder-vrij medium toe om de schotel te bedekken en gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig te schrapen. Breng de cellen over naar een steriele 15 milliliter centrifugeerbuis. Spoel de schotel met compleet voedingsvrij medium en spuit voorzichtig alle cellen weg die niet los zijn geraakt. Breng de spoelvloeistof over naar dezelfde 15 milliliter buis met de cellen erin.
Spoel de schotel een tweede keer met medium en trek die spoelvloeistof met de cellenpellet door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie aspireer en gooi voorzichtig het supernatant weg zonder de celpellet te verstoren. Draai voorzichtig aan de buis om de celpellet volledig los te maken van de bodem van de buis.
Voeg vervolgens een milliliter bevriezingsmedium A toe, gebruik een vijf milliliter serologische pipet, en resuspendeer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetten. Na uniforme suspensie van klontjes, voeg een milliliter bevriezingsmedium B toe aan de buis druppelsgewijs terwijl u voorzichtig de celsuspensie ronddraait om te mengen. Verdeel een milliliter celsuspensie in elke cryo-vijl, bevries de cellen bij min 80 graden Celsius gedurende een nacht in een isopropanol-kamer.
De volgende dag brengt u de cellenvialen over naar een vloeibare stikstoftank voor langdurige opslag. Ontdooi snel de bevroren cellenvialen door deze ongeveer drie tot vier minuten in een waterbad van 37 graden Celsius te plaatsen tot er nog slechts een kleine bevroren klomp in de viaal overblijft. Nadat u de viaal uit het waterbad hebt verwijderd, besproeit u deze met 70% isopropanol om het te decontamineren, en gebruikt u een vijf milliliter pipet om de volledige inhoud van de viaal aseptisch over te brengen in een 15 milliliter conische buis.
De volgende stap is misschien het moeilijkste aspect van de procedure. Het feeder-vrije medium moet langzaam en voorzichtig aan de cellen worden toegevoegd. Om osmotische shock te verminderen, voegt u langzaam vier milliliter compleet feeder-vrij medium druppelsgewijs toe aan de cellen in de 15 milliliter conische buis.
Tijdens het toevoegen van het medium, beweeg de buis voorzichtig heen en weer om de cellen te mengen. Dit zal de osmotische shock voor de cellen verminderen. Compleet feeder-vrij medium kan worden vervangen door knockout serum vervanging met meth geconditioneerd medium of knockout serum vervanging medium voor gebruik met feeders, raadpleeg de protocoltekst voor instructies voor media-voorbereiding.
Zodra alle vier milliliter medium is toegevoegd, centrifugeert u de cellen gedurende vijf minuten bij 1000 RPM bij kamertemperatuur. Na centrifugatie aspireer en gooi voorzichtig het supernatant weg zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in vier milliliter compleet feeder-vrij medium.
Gebruik een vijf milliliter pipet om de celsuspensie voorzichtig druppelsgewijs toe te voegen aan een gelt trucks gecoate 60 millimeter kweekbak. Plaats de kweekbak in een incubator van 36 tot 38 graden Celsius met een bevochtigde atmosfeer van vier tot 6% koolstofdioxide in lucht. Draai voorzichtig de schotel in een noord-zuid, oost-west patroon om de cellen gelijkmatig te verdelen.
24 uur na het ontdooien. Vervang het medium in de schotel met vers medium. Vervang het gebruikte medium daarna dagelijks tot de cellen ongeveer 70 tot 80% conflueert zijn.
Deze contrastafbeelding toont humane geïnduceerde pluripotente stamcellen die zijn gekweekt op gelt TRX gecoate kweekbakken met compleet serum vervanging, feeder-vrij medium. De IPC's vertonen een morfologie die lijkt op humane embryonale stamcellen, gekenmerkt door grote kernen en schaars cytoplasma. Een voorbeeld van cellen na het ontdooien en knockout serum vervanging.
Feeder-vrij medium op gelt TrackX wordt hier getoond. Bij het volgen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om al uw celkolonies even groot te houden. Bij cryopreservering verbetert dit de celherstel.
Dus dat is het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Overzicht
Dit protocol beschrijft de procedure voor het cryobewaren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) met behulp van KnockOut SR cryobewaringsmedium en het herstel ervan in het complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium of feeder-gebaseerd KnockOut SR medium. De methode benadrukt het belang van visuele demonstratie vanwege de gevoeligheid van iPS-cellen tijdens het invriezen en ontdooien.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Stamceldonderzoek
- Cryobewaartechnieken
Achtergrond
- Menselijk iPS-cellen zijn gevoelig voor invriezen en ontdooien.
- KnockOut SR producten vergemakkelijken verschillende stadia van stamcelkweek.
- Goede cryobewaring is cruciaal voor het behoud van cellevensvatbaarheid.
- Feeder-vrije en feeder-gebaseerde kweekomstandigheden kunnen worden gebruikt voor iPS-cellen.
Doel van het onderzoek
- Een betrouwbaar protocol te bieden voor het cryobewaren van iPS-cellen.
- Om een succesvolle herstel van cellen na het ontdooien te garanderen.
- Om het gebruik van KSR-producten gedurende het hele proces te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van iPS-cellen voor cryobewaring.
- Gebruik van serumvrij bevriezingsmedium voor celbehoud.
- Cryobewaring bij -80 graden Celsius gevolgd door opslag in vloeibare stikstof.
- Ontdooien en hersuspensie van cellen in compleet feeder-vrij medium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bevriezing en ontdooiing van iPS-cellen aangetoond door gezonde morfologie.
- Cellen behielden levensvatbaarheid en groei in zowel feeder-vrije als feeder-gebaseerde omstandigheden.
- Protocoleffectiviteit bevestigd door visuele beoordeling van celherstel.
- Uniforme celkoloniegrootte verbeterde herstelpercentages.
Conclusies
- Het protocol biedt een systematische aanpak voor het cryobewaren van iPS-cellen.
- KnockOut SR producten zijn effectief voor het behoud van celgezondheid tijdens het proces.
- Visuele demonstraties verbeteren het begrip en de uitvoering van het protocol.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reliable cryopreservation and recovery of human iPS cells using feeder-free, defined media directly addresses scalability and standardization challenges in early discovery and translational research. This protocol enables consistent pluripotent cell banking, supporting robust assay development and downstream applications in drug discovery portfolios. Feeder-free workflows reduce biological variability, enhancing predictive confidence and portfolio triage at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent banking of pluripotent cells for repeated hypothesis testing and pathway interrogation.
- Reduces biological variability by eliminating feeder layers, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by maintaining cell health and pluripotency post-thaw.
- Supports predictive confidence in early-stage screening and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, feeder-free system for preparing validated iPS cells for high-throughput assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based assays by using defined media components.
- Enables reliable compound evaluation by ensuring healthy, undifferentiated cell recovery.
- Supports platform reuse and assay standardization across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Maintains disease-relevant cell models for translational biomarker studies when using patient-derived iPS cells.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust cell recovery and expansion.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable cell sources.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation and recovery protocol fits from early discovery through preclinical research, enabling seamless transitions between banking, expansion, and assay deployment stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by providing healthy, pluripotent cells on demand.
- Screening: Delivers assay-ready iPS cells with reproducible morphology and viability for quantitative readouts.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell health and recovery, supporting cross-condition comparisons.
- Translational Research: Maintains continuity for disease modeling and biomarker alignment when using patient-derived lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, feeder-free workflow for pluripotent cell management across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation and recovery, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell handling and feeder-free culture techniques.
- Needs access to defined media, cryopreservation equipment, and controlled thawing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell colony size and handling procedures for optimal recovery.
- Adaptation may be needed for different iPS cell lines or disease models.
- Careful osmotic shock management is critical for maintaining cell viability post-thaw.
