Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Het algemene doel van deze procedure is het cryopreserveren en herstellen van IPS-cellen in kweekcondities met of zonder feederlaag. Dit wordt bereikt door eerst de IPC's te verpakken zoals u dat normaal gesproken zou doen. De tweede stap van de procedure is het overbrengen van de cellen naar een serumvrij vriesmedium.

De derde stap van de procedure is het cryopreserveren volgens de gebruikelijke methode. De laatste stap van de procedure is het ontdooien van de cellen en het starten van het onderhoud. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een succesvolle invriezing en ontdooiing van IPS-cellen in serumvrij vriesmedium aantonen door middel van een gezonde morfologie en herstel na het ontdooien.

Hallo, ik ben Kate Wagner van de GCO-locatie bij Life Technologies. Een visuele demonstratie van dit protocol is cruciaal, omdat IPC's zeer gevoelig kunnen zijn voor invriezen en de temperatuur. Wat dit protocol eenvoudiger maakt, is dat knockout-serumvervanging gedurende de gehele workflow kan worden gebruikt.

Vandaag omvat de KSR-productfamilie een volledige lijst van media en reagentia voor feeder-gebaseerde, feeder-vrije en xeno-vrije kweek van uw embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. KSR kan worden gebruikt voor derivatie, groei, cryopreservatie, expansie en de eerste beginstappen van differentiatie. De volgende video laat u zien hoe u cellen ontdooit en invriest met behulp van KSR in een feeder-vrije omgeving.

Om deze procedure te starten, wordt eerst een passende hoeveelheid volledig feeder-vrij medium op 37 °C verwarmd in een waterbad. Aspireer het gebruikte medium uit het kweekvat, in dit geval een schaal van 60 millimeter. Spoel de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen vervolgens twee keer met DPBS.

Voeg vervolgens één milliliter dispa toe aan de schaal. Incubeer de schaal gedurende drie minuten bij 37 °C. Aspireer daarna de dispa-oplossing en was de cellen voorzichtig met DPBS.

Voeg vervolgens compleet feeder-vrij medium toe om de schaal te bedekken en gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig los te schrapen en over te dragen naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter. Spoel de schaal met compleet feeder-vrij medium en spuit voorzichtig alle cellen weg die nog niet zijn losgekoppeld. Breng de spoeloplossing over naar dezelfde 15 milliliter buis waarin de cellen zich bevinden.

Spoel de schaal nogmaals met medium en verzamel deze spoeloplossing met de cellen; pellet de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na centrifugatie voorzichtig het supernatant en gooi dit weg zonder het celpellet te verstoren. Tik zachtjes tegen de buis om het celpellet volledig los te maken van de bodem van de buis.

Voeg vervolgens één milliliter vriesmedium A toe met een serologische pipet van vijf milliliter en resuspendeer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren. Nadat de klonten uniform zijn gesuspendeerd, voegt u één milliliter vriesmedium B druppelgewijs toe aan de buis, terwijl u de cel-suspensie voorzichtig draait om te mengen. Verdeel één milliliter cel-suspensie over elke cryovial en vries de cellen gedurende één nacht bij minus 80 °C in een isopropanolkamer.

Overdraag de volgende dag de vials met cellen naar een tank met vloeibare stikstof voor langetermijnopslag. Ontdooi de bevroren vial met cellen snel door deze gedurende ongeveer drie tot vier minuten in een waterbad van 37 °C te plaatsen, totdat er slechts een klein bevroren stukje in de vial overblijft. Spuit na het verwijderen van de vial uit het waterbad 70% isopropanol om deze te decomprimeren, en gebruik vervolgens een pipet van 5 mL om de volledige inhoud van de vial aseptisch over te brengen naar een conische buis van 15 mL.

De volgende stap kan het moeilijkste aspect van de procedure zijn. Het feeder-vrije medium moet langzaam en voorzichtig aan de cellen worden toegevoegd. Om osmotische shock te verminderen, voegt u langzaam vier milliliter compleet feeder-vrij medium druppelsgewijs toe aan de cellen in de 15 milliliter conische buis.

Beweeg de buis tijdens het toevoegen van het medium voorzichtig heen en weer om de cellen te mengen. Dit vermindert de osmotische shock voor de cellen. Complete feeder-vrij medium kan worden vervangen door knockout serum replacement met geconditioneerd medium of knockout serum replacement medium voor gebruik met feeders; raadpleeg de tekst van het protocol voor instructies over de bereiding van de media.

Zodra alle vier milliliter medium is toegevoegd, worden de cellen gedurende vijf minuten gecentrifugeerd bij 1000 RPM bij kamertemperatuur. Na centrifugatie wordt het supernatant voorzichtig geaspireerd en weggegooid zonder het celpellet te verstoren. Resuspendeer het celpellet voorzichtig in vier milliliter compleet feeder-vrij medium.

Voeg de celstuspensie met een pipette van vijf milliliter voorzichtig druppelsgewijs toe aan een met gelt trucks gecoate kweekschaal van 60 millimeter. Plaats de kweekschaal in een incubator van 36 tot 38 graden Celsius met een bevochtigde atmosfeer van vier tot 6% koolstofdioxide in lucht. Draai de schaal voorzichtig in een noord-zuid- en oost-westpatroon om de cellen gelijkmatig te verspreiden.

24 uur na het ontdooien. Vervang het medium in de schaal door vers medium. Vervang het verbruikte medium daarna dagelijks totdat de cellen ongeveer 70 tot 80% confluent zijn.

Deze contrastafbeelding toont menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen die zijn gekweekt op met gelt TRX gecoate kweekschaaltjes met gebruik van compleet serumvervangend, feeder-vrij medium. De iPSC's vertonen een morfologie die vergelijkbaar is met menselijke embryonale stamcellen, gekenmerkt door grote kernen en weinig cytoplasma. Een voorbeeld van cellen na ontdooiing en knockout serumvervanging.

Feeder-vrij medium op gelt TrackX wordt hier getoond. Bij het volgen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle celkoloniën dezelfde grootte moeten behouden. Bij cryopreservering verbetert dit het herstel van de cellen.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.