Name: Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer cryopreservering en herstel van menselijke iPS-cellen met KnockOut SR-vrije medium. Dit protocol toont succesvol invriezen en ontdooien met behoud van viabiliteit en gezonde morfologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opmerking: Om steriele cultuur voorwaarden te handhaven, zijn alle procedures in dit protocol uitgevoerd met steriele laboratorium-praktijken en uitgevoerd onder een laminaire stroming kap. Voorafgaand aan de start, zorg ervoor dat elk medium is evenwicht gebracht tot 37 ° C en adequaat vergast. Voorbereiden Geltrex-coated Cultuur Gerechten Let op: zie bijlage voor het gebruik van gecoate CELLstart cultuur gerechten. <ol><li> Dooi een tube van Geltrex (1 ml) langzaam bij 2-8 ° C en verdund 1:100 in 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Meng de oplossing. Opmerking: Sommige iPS cellijnen kan een andere Geltrex verwatering voor een optimale groei nodig hebben. Zie bijlage voor alternatieve verdunningen. </li><li> Het gehele oppervlak van elke cultuur schotel met de Geltrex oplossing (1 ml voor een 35-mm schaal, 1,5 ml voor een 60-mm schotel). </li><li> Seal ieder gerecht met Parafilm om het drogen te voorkomen en incubeer de gerechten gedurende 1 uur bij 37 ° C. NB: Op dit punt kunt u de Geltrex gecoate cultuur gerechten bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. Seal ieder gerecht met Parafilm om de Geltrex niet uitdrogen. </li><li> Voorafgaand aan het gebruiken, de overdracht van de Geltrex-gecoate gerechten tot een laminaire stroming kap en laat ze op kamertemperatuur (ongeveer 1 uur). </li></ol> Voorbereiden Compleet KnockOut SR Feeder-vrij medium <ol><li> Voor te bereiden 1 ml van 10 ug / ml Basic FGF-oplossing aseptisch meng de hieronder genoemde componenten. Aliquot de oplossing en bewaar bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden. <table border="0"><tbody><tr><td> Basic FGF </td><td> 10 pg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 pi </td></tr></tbody></table> Opmerking: BSA kan worden vervangen door HSA of Knockout SR bij dezelfde concentratie. </li><li> Ter voorbereiding op 50 ml van 2 mg / ml Dispase oplossing aseptisch meng de hieronder genoemde componenten. Filter steriliseren de oplossing en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Ter voorbereiding op 100 ml van complete KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF) aseptisch combineren van de componenten die in de tabel hieronder. <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Concentratie voorraad </td><td> Uiteindelijke concentratie </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Cat. Nr. +12.660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Cat. nr. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> SR KnockOut (Cat. Nr. 10,828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (Cat. Nr. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. geen. PHG0024). </td><td> 10 ug / mL </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 pi </td></tr></tbody></table> U mag de KSR-FF medium bij 2-8 ° C gedurende maximaal een week. </li><li> Vlak voor de complete medium pre-equilibreren de temperatuur en gassen, aseptische wijze de vereiste hoeveelheid 2 mercaptoethanol (55 mM voorraad concentratie) voor een 0,1 mM eindconcentratie. Bijvoorbeeld, om 100 ml KSR-F voor te bereidenF-medium toe te voegen 182 pi van 55 mM 2-mercapto-ethanol (1:550 verdunning) Als alternatief kan de 2-mercapto-ethanol worden toegevoegd aan het 1X voltooide medium en bewaard bij 2-8 ° C gedurende maximaal een week. </li></ol> Voorbereiden Invriezen / Cryopreservatie Medium De cryopreservatie medium bestaat uit twee media; Invriezen Medium A en Freezing Medium B. Ze worden toegevoegd aan de cellen op verschillende tijden en moeten gescheiden blijven. Ze zijn elk 50% van het totale volume van Cryopreservatie Medium nodig. Het totale volume van de benodigde Cryopreservatie Medium is 1 ml voor elke flacon te worden bevroren. Een 90% confluent 60mm gerecht van hESC kan gebruikt worden om de bank twee flesjes van hESC in cryopreservatie media. Bereid voldoende volume van elke bevriezen Medium met een extra 2-5 ml tot overmaat te verzekeren. <table border="1"><tbody><tr><td> Invriezen Medium A (50% van de uiteindelijke volume): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> Invriezen Medium B (50% van de uiteindelijke volume): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% DMSO </td></tr></tbody></table> Voorbeeld: Als u bevriezing 20 flacons van cellen, moet je 20 ml van Cryopreservatie Medium. Voeg 4 ml voor teveel voor een totaal van 24ml Cryopreservatie Medium. Dat betekent dat je nodig hebt 12ml van Freezing Medium A (50% van 24ml) en 12ml van Freezing Medium B (50% van 24ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Invriezen Medium A (12 ml): </td><td> 6 mL DMEM/F12 </td><td> 6 mL KSR </td></tr><tr><td> Invriezen Medium B (12 ml): </td><td> 9,6 ml DMEM/F12 </td><td> 2,4 ml DMSO </td></tr></tbody></table> De uiteindelijke samenstelling van het Cryopreservatie Medium is 65% DMEM/F12, 25% KSR, en 10% DMSO. Cryopreserving iPSCs <ol><li> Pre-warm van het vereiste volume Dispase in een 37 ° C waterbad. Zie tabel 1 hieronder voor meer informatie over de vereiste volumes. </li><li> Pre-evenwicht van het vereiste volume KSR-FF in een 37 ° C waterbad for15 min. Raadpleeg tabel 1below voor details over de vereiste volumes. </li><li> Zuig het bestede medium van de cultuur schip met behulp van een pipet, en tweemaal spoelen van de cellen met D-PBS. </li><li> Voorzichtig toe te voegen voorverwarmde Dispase oplossing voor de cultuur vat (bijv. 1 ml Dispase oplossing per 60-mm cultuur schotel). Swirl de cultuur schip voor het coaten van de hele cel oppervlak. </li><li> Incubeer de cultuur vat bij 37 ° C gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder het schip uit de incubator, zuigen de Dispase oplossing, en voorzichtig wassen van de cellen met D-PBS. </li><li> Zachtjes schrapen van de cellen van het oppervlak van de cultuur schotel met behulp van een cel schraper, en breng de cellen om een ​​steriele 15 ml centrifugebuis. </li><li> Twee keer Spoel de cultuur schotel met KSR-FF, zacht &quot;spuiten uit&quot; alle cellen die niet los. Het zwembad van het spoelen medium met de cellen in de 15 ml buis. </li><li> Centrifugeer de buis op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om pellet de cellen. </li><li> Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de celpellet en gooi hem weg. </li><li> Bereid een voldoende hoeveelheid cryovials. Zodra de cellen in contact komen met DMSO, moeten ze hoeveelheden verdeeld en bevroren binnen 2-3 minuten. </li><li> Tik zachtjes tegen de buis, om ten volle de cel pellet los van de buis bodem en de cellen opnieuw te schorten in Freezing Medium A. [door zachtjes en neer te pipetteren met behulp van een 5-mL serologische pipet]. Na de uniforme suspensie van bosjes, voeg gelijk volume van Freezing Medium B om het, in een druppelsgewijs manier, terwijl voorzichtig schudden de celsuspensie te mengen. NB: Op dit punt, cellen in contact met DMSO, en het werk moet efficiënt uitgevoerd worden. Eenmaal cellen in contact komen met DMSO, moeten ze hoeveelheden verdeeld en bevroren binnen 2-3 minuten. </li><li> Aliquot 1 ml van de celsuspensie in elk cryovial. </li><li> Plaats snel de flacons in een Mr Frosty [snel bevriezen] en overbrengen naar -80 ° C gedurende de nacht. </li><li> Na een nacht opslag bij -80 ° C en breng de cellen een vloeibare stikstof tank voor lange termijn opslag. </li></ol> IPSC flacon ontdooien en cel herstel Let op: KSR-FF kan worden vervangen door KSR-bevattende MEF-geconditioneerde medium, of KSR medium voor gebruik met feeders. Zie bijlage voor instructies voor media voorbereiding. Pre-warm 10mL van KSR-FF medium in een 50 ml buis. <ol><li> Equilibreren de juiste hoeveelheid Geltrex-coating gerechten op kamertemperatuur en zuig alle vloeistof uit de gerechten net voor plating ur cellen. </li><li> Verwijder voorzichtig de hESC (of IPSC) flesje van vloeibare stikstof Storage Tank. </li><li> Snel ontdooien bevroren flacon van cellen in een 37 ° C waterbad, totdat slechts een klein stuk bevroren blijft in de flacon. </li><li> Spray flacon met 70% isopropanol om het te ontsmetten en te dragen aan de steriele weefselkweek kap. </li><li> Aseptisch overbrengen van de volledige inhoud van de flacon op in een 15 ml conische buis met behulp van een 5 ml pipet. </li><li> Spoel de flacon met 1 ml van KSR-FF en voeg dit aan de 15 ml centrifugebuis. </li><li> Langzaam, voeg 4 mL van KSR-FF druppelsgewijs naar cellen in de 15 ml conische buis. Bij het toevoegen van het medium, zachtjes gaan de buis heen en weer om de cellen te mengen. (Dit vermindert de osmotische schok voor de cellen). </li><li> Centrifugeer de 15 ml buis met de celsuspensie bij 1000 tpm (200 x g) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zorgvuldig aspireren Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet cel. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in voorverwarmde KSR-FF (bijv. 4mL/60 mm gerecht) met behulp van een 5 ml pipet en voorzichtig de cellen omhoog pipet en neer totdat celpellet volledig is verspreid. Een levensvatbaarheid van meer dan 70% wordt verwacht, maar als de levensvatbaarheid is minder dan 70%, kan het langer duren voor de cellen tot confluentie bereiken. </li><li> Met dezelfde pipet de celsuspensie druppelsgewijs naar Geltrex-gecoate cultuur schotel pre-op kamertemperatuur. </li><li> Zet de schotel in een cultuur van 37 ° C incubator met een vochtige atmosfeer van 4 tot 6% CO 2 in de lucht. Zorgvuldig swirl schip in een noord naar zuid, van oost naar west patroon gelijkmatig te verdelen de cellen. </li><li> Voorzichtig 24 uur na de dooi en vervolgens dagelijks naar cel vuil te verwijderen en in de frisse voedingsstoffen totdat de schotel is ongeveer 70-80% confluent. Fluid-verandering van de cultuur schotel Voor verdere cultuur en de passage van de iPS cellen, verwijzen wij naar onze protocol met de titel &quot;Feeder-Free Cultuur en passage van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium&quot; </li></ol> Verwachte resultaten De cellen moeten ongeveer 70-80% samenvloeiende voorafgaand aan de cryopreservatie worden. Dispase spijsvertering resulteert in curling up en vouwen van de kolonies langs de kolonie marges. Na het oogsten van de cellen die zijn bevroren als kleine groepjes in cryopreservatie media. Zodra de flacon is ontdooid, cellen herstellen en hechten aan de pre-gecoate schaal als kleine bosjes. Ze groeien snel leidt tot een confluente schotel in 5-6 dagen. Tabel 1 - Aanbevolen Volumes <table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> 35mm Dish </td><td> 60mm Dish </td><td> 100mm Dish </td></tr><tr><td> Compleet KnockOut SR medium </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Geltrex Solution </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr><td> D-PBS voor het spoelen </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">Klik hier om de bijlage te zien</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

De auteurs van dit artikel zijn werkzaam bij Life Technologies, dat reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>Opmerking: zie bijlage voor het gebruik van alternatieve DMEM-producten GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, menselijk recombinant eiwit, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Opmerking: zie bijlage voor alternatieve verpakkingsgroottes van bFGF.</td></tr><tr><td>2-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Opmerking: zie bijlage voor alternatieve subcultuurmethoden</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) zonder calcium en magnesium</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Steriele weefselkweekkast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator ingesteld op 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad ingesteld op 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele serologische pipetten (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifugebuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm weefselkweek-behandelde schaaltjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opslagtank voor vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol vriescontainers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL cryovials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving en herstellen van de mens ips cellen met behulp van complete knockout serum vervangende feeder-vrij medium

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

De ontdekking in 2006 dat de mens en muis fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd om iPS cellen 1-3 met kwaliteiten opvallend vergelijkbaar met embryonale stamcellen te genereren heeft een belangrijke nieuwe bron van pluripotente cellen voor drug discovery, celtherapie en fundamenteel onderzoek. GIBCO media en reagentia zijn in de voorhoede van de pluripotente stamcel-onderzoek voor jaren. Knockout DMEM aangevuld met Knockout Serum Vervanging is in de media van de keuze voor embryonale stamcellen de groei en nu iPS celcultuur 3-9. Deze gouden standaard media systeem kan nu worden gebruikt voor feeder-vrije cultuur met de toevoeging van Knockout SR Growth Factor Cocktail. Traditionele menselijke ES en iPS celcultuurmethoden vereisen het gebruik van muis of mens fibroblast feeder lagen, of feeder-geconditioneerd medium. Deze cultuur methoden zijn arbeidsintensief, moeilijk op schaal en het is moeilijk te onderhouden HIPS cellen ongedifferentieerd te wijten aan de undefined voorwaarden. Invitrogen heeft ontwikkeld Knockout SR Growth Factor Cocktail, zodat u gemakkelijk de overgang van uw heupen en hES celculturen aan feeder-vrij met behoud van uw gebruik van Knockout SR.

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor cryopreserving menselijke iPS cellen in KnockOut SR cryopreservatie medium en het herstellen van deze cellen in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium of feeder-based KnockOut SR medium.

Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

De ontdekking in 2006 dat fibroblasten van mensen en muizen konden worden gereprogrammeerd om iPS-cellen 1-3 te genereren met eigenschappen die opmerkelijk veel lijken op die van embryonale stam...

Het algemene doel van deze procedure is het cryopreserveren en herstellen van IPS-cellen in kweekcondities met of zonder feederlaag. Dit wordt bereikt door eerst de IPC's te verpakken zoals u dat normaal gesproken zou doen. De tweede stap van de procedure is het overbrengen van de cellen naar een serumvrij vriesmedium.De derde stap van de procedure is het cryopreserveren volgens de gebruikelijke methode. De laatste stap van de procedure is het ontdooien van de cellen en het starten van het onderhoud. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een succesvolle invriezing en ontdooiing van IPS-cellen in serumvrij vriesmedium aantonen door middel van een gezonde morfologie en herstel na het ontdooien.Hallo, ik ben Kate Wagner van de GCO-locatie bij Life Technologies. Een visuele demonstratie van dit protocol is cruciaal, omdat IPC's zeer gevoelig kunnen zijn voor invriezen en de temperatuur. Wat dit protocol eenvoudiger maakt, is dat knockout-serumvervanging gedurende de gehele workflow kan worden gebruikt.Vandaag omvat de KSR-productfamilie een volledige lijst van media en reagentia voor feeder-gebaseerde, feeder-vrije en xeno-vrije kweek van uw embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. KSR kan worden gebruikt voor derivatie, groei, cryopreservatie, expansie en de eerste beginstappen van differentiatie. De volgende video laat u zien hoe u cellen ontdooit en invriest met behulp van KSR in een feeder-vrije omgeving.Om deze procedure te starten, wordt eerst een passende hoeveelheid volledig feeder-vrij medium op 37 °C verwarmd in een waterbad. Aspireer het gebruikte medium uit het kweekvat, in dit geval een schaal van 60 millimeter. Spoel de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen vervolgens twee keer met DPBS.Voeg vervolgens één milliliter dispa toe aan de schaal. Incubeer de schaal gedurende drie minuten bij 37 °C. Aspireer daarna de dispa-oplossing en was de cellen voorzichtig met DPBS.Voeg vervolgens compleet feeder-vrij medium toe om de schaal te bedekken en gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig los te schrapen en over te dragen naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter. Spoel de schaal met compleet feeder-vrij medium en spuit voorzichtig alle cellen weg die nog niet zijn losgekoppeld. Breng de spoeloplossing over naar dezelfde 15 milliliter buis waarin de cellen zich bevinden.Spoel de schaal nogmaals met medium en verzamel deze spoeloplossing met de cellen; pellet de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na centrifugatie voorzichtig het supernatant en gooi dit weg zonder het celpellet te verstoren. Tik zachtjes tegen de buis om het celpellet volledig los te maken van de bodem van de buis.Voeg vervolgens één milliliter vriesmedium A toe met een serologische pipet van vijf milliliter en resuspendeer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren. Nadat de klonten uniform zijn gesuspendeerd, voegt u één milliliter vriesmedium B druppelgewijs toe aan de buis, terwijl u de cel-suspensie voorzichtig draait om te mengen. Verdeel één milliliter cel-suspensie over elke cryovial en vries de cellen gedurende één nacht bij minus 80 °C in een isopropanolkamer.Overdraag de volgende dag de vials met cellen naar een tank met vloeibare stikstof voor langetermijnopslag. Ontdooi de bevroren vial met cellen snel door deze gedurende ongeveer drie tot vier minuten in een waterbad van 37 °C te plaatsen, totdat er slechts een klein bevroren stukje in de vial overblijft. Spuit na het verwijderen van de vial uit het waterbad 70% isopropanol om deze te decomprimeren, en gebruik vervolgens een pipet van 5 mL om de volledige inhoud van de vial aseptisch over te brengen naar een conische buis van 15 mL.De volgende stap kan het moeilijkste aspect van de procedure zijn. Het feeder-vrije medium moet langzaam en voorzichtig aan de cellen worden toegevoegd. Om osmotische shock te verminderen, voegt u langzaam vier milliliter compleet feeder-vrij medium druppelsgewijs toe aan de cellen in de 15 milliliter conische buis.Beweeg de buis tijdens het toevoegen van het medium voorzichtig heen en weer om de cellen te mengen. Dit vermindert de osmotische shock voor de cellen. Complete feeder-vrij medium kan worden vervangen door knockout serum replacement met geconditioneerd medium of knockout serum replacement medium voor gebruik met feeders; raadpleeg de tekst van het protocol voor instructies over de bereiding van de media.Zodra alle vier milliliter medium is toegevoegd, worden de cellen gedurende vijf minuten gecentrifugeerd bij 1000 RPM bij kamertemperatuur. Na centrifugatie wordt het supernatant voorzichtig geaspireerd en weggegooid zonder het celpellet te verstoren. Resuspendeer het celpellet voorzichtig in vier milliliter compleet feeder-vrij medium.Voeg de celstuspensie met een pipette van vijf milliliter voorzichtig druppelsgewijs toe aan een met gelt trucks gecoate kweekschaal van 60 millimeter. Plaats de kweekschaal in een incubator van 36 tot 38 graden Celsius met een bevochtigde atmosfeer van vier tot 6% koolstofdioxide in lucht. Draai de schaal voorzichtig in een noord-zuid- en oost-westpatroon om de cellen gelijkmatig te verspreiden.24 uur na het ontdooien. Vervang het medium in de schaal door vers medium. Vervang het verbruikte medium daarna dagelijks totdat de cellen ongeveer 70 tot 80% confluent zijn.Deze contrastafbeelding toont menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen die zijn gekweekt op met gelt TRX gecoate kweekschaaltjes met gebruik van compleet serumvervangend, feeder-vrij medium. De iPSC's vertonen een morfologie die vergelijkbaar is met menselijke embryonale stamcellen, gekenmerkt door grote kernen en weinig cytoplasma. Een voorbeeld van cellen na ontdooiing en knockout serumvervanging.Feeder-vrij medium op gelt TrackX wordt hier getoond. Bij het volgen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle celkoloniën dezelfde grootte moeten behouden. Bij cryopreservering verbetert dit het herstel van de cellen.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het volgende protocol bevat instructies voor het aanpassen van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan feeder-vrije cultuur met complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (KSR-FF). Een keer aangepast, instructies voor de voortdurende onderhoud zijn ook aanwezig.

Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Regelmatige karakterisering van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), om het behoud van hun pluripotente toestand vast te stellen, is een belangrijke stap voordat deze cellen voor andere toepassingen worden gebruikt. Hier beschrijven we een methode voor de kleinschalige vermenigvuldiging van menselijke iPSC's, specifiek ontworpen om hun eenvoudige en routinematige karakterisering via immunocytochemie mogelijk te maken.

Kleinschalig Voortplanting van Human iPSCs in serum-vrij Voorwaarden voor Routine Immunocytochemisch karakterisering

Hier rapporteren we een protocol voor het ontwikkelen van een driedimensionaal (3-D) systeem van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het serumvrije embryoïde lichaam (SFEB) genoemd. Dit 3-D model kan gebruikt worden als een organotypische plakcultuur om menselijke corticale ontwikkeling te modelleren en voor de fysiologische ondervraging van neurale ontwikkelingen.

Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses

De productie van gespecialiseerde netvlies cellen uit pluripotente stamcellen is een keerpunt in de ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapie voor retinale ziekten. De huidige paper beschrijft een eenvoudige methode voor een efficiënte generatie van retinale organoids en retinale pigment epitheel voor fundamenteel, translationeel, en klinisch onderzoek.

Gedefinieerde Xeno-vrij en kweekomstandigheden Feeder-gratis voor de generatie van menselijke iPSC afkomstige Retinal cel modellen

Primordiale kiemcellen (PGCs) zijn gemeenschappelijk voorlopers van zowel de zaadcellen als de eicellen. Menselijke embryonale PGCs zijn opgegeven uit pluripotente cellen van de epiblast door middel van interacties van cytokinen. Hier beschrijven we een 13-daagse protocol van het inducerende menselijke cellen transcriptomally gelijkend op PGCs aan het oppervlak van embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van menselijke primordiale geslachtscellen-achtige cellen aan de oppervlakte van Embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor de efficiënte cryopreservatie van van menselijke stamcellen afgeleide retinale pigmentepitheelcellen.

cryopreservatie van menselijke embryonale stamcel-afgeleide retinale pigmentepitheelcellen in het optimale stadium

De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

Hier presenteren we een methode om menselijke iPSC-afgeleide chimere antigeenreceptor (CAR)-tot expressie brengende natural killer-cellen te differentiëren en uit te breiden met verbeterde doding tegen verschillende maligniteiten. Dit protocol demonstreert de differentiatie en uitbreiding van voor natural killer (NK) geoptimaliseerde iPSC-afgeleide CAR-NK-cellen en de meting van antitumoractiviteit tegen verschillende tumorcellijnen.

Vooruitgang in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide chimere antigeenreceptor-expressie natuurlijke killercellen

Leer cryopreservering en herstel van menselijke iPS-cellen met KnockOut SR-vrije medium. Dit protocol toont succesvol invriezen en ontdooien met behoud van viabiliteit en gezonde morfologie.

Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Meer video's verkennen