Scheiden Kralen en cellen in Multi-channel Microfluïdische apparaten met behulp van Dielectrophoresis en Laminar Flow

Het algemene doel van deze procedure is om cellen en beads binnen microfluïdische apparaten te manipuleren met behulp van dielektroforese (DEP) via printplaten (PCB's). Dit wordt bereikt door eerst de PCB-elektroden en de microfluïdische kanalen te ontwerpen en voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het voorbereiden van de PCB-microfluïdische assemblage en de bead- en celoplossingen.

De derde stap van de procedure is het vullen van de kanalen met medium met een lage geleidbaarheid, waarna de kralen en cellen worden geladen. De laatste stap van de procedure is het verbinden van de PCB-assemblage met de vermogensversterker en functiegenerator, om vervolgens de DEP te starten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de scheiding en manipulatie van cellen en kralen in microfluïdische apparaten aantonen door middel van DEP.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite ondervinden, omdat de gebruiker de principes van DEP moet begrijpen om een effectieve elektrode te ontwikkelen die werkt met een microfluïdisch apparaat voor de gewenste cel- of bolletjesmanipulatie. Aan de andere kant maakt het gebruik van PCB's als elektroden de activering van cellen en bolletjes in microfluïdische apparaten toegankelijk voor een verscheidenheid aan wetenschappelijke disciplines. De eerste stap van deze procedure is het ontwerpen van de printplaat of PCB-elektroden met de gewenste geometrie om een niet-uniform elektrisch veld op te wekken.

Wanneer het ontwerp is voltooid, bestelt u de aangepaste PCB-elektrodechips via een commerciële productiefaciliteit. Nadat de op maat gemaakte PCB is gearriveerd, opent u deze en inspecteert u deze voor deze demonstratie. De PCB is 8.4 centimeters lang en 2.1 centimeters breed.

De metalelektroden zijn vijf millimeter breed. In dit voorbeeld hebben de elektroden twee lange metalen strips en twee dwarsgebieden van 4,5 millimeter lang waar de elektroden in elkaar grijpen. Deze interdigitatiegebieden genereren een sterk niet-uniform elektrisch veld om een verbinding tussen de stimulator en de PCB-elektrode te creëren.

Plaats een draad van 16 gauge op het uiteinde van de elektrode. Gebruik een hete soldeerbout om de draad op het metalen gedeelte van de PCB vast te zetten. Hierdoor wordt de draad verhit.

Houd de soldeer tegen de verhitte draad en laat een kleine hoeveelheid soldeer in de draad vloeien. Nadat de draad is gevuld met soldeer, verwijdert u de soldeerbout terwijl u de draad op zijn plaats houdt tot het soldeer is afgekoeld. Herhaal het soldeerproces voor de andere elektrische verbinding op de PCB.

De volgende stap is het voorbereiden van microfluïdische kanalen met het gewenste vertakkingspatroon. Gebruik standaard microfabricagetechnieken om een mastermold te maken waarmee de kanalen worden gedefinieerd, met behulp van een siliciumwafer en SU-8 fotoresist. Deze mastermold heeft één ingangskanaal en drie doelkanalen.

De breedte van de kanalen is 100 micrometers en de hoogte van de kanalen is 27 micrometers. Zodra de mastermold is gemaakt, mengt u het polymethyl LAANE of PDMS-elastomeer met een uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1 gedurende vijf minuten. Giet het vloeibare PDMS op de vooraf gefabriceerde SU eight mastermold en verwijder luchtbellen door het vloeibare PDMS drie minuten lang aan een vacuüm bloot te stellen.

Herhaal het vacuümproces indien nodig om alle bellen volledig te verwijderen. Een stroom stikstofgas kan worden gebruikt om eventuele overgebleven bellen te verwijderen. Hard het PDMS uit in een oven bij 70 °C gedurende twee uur.

Gebruik een scheermesje om de PDMS-slab met de microfluïdische kanalen van de wafer te verwijderen. Wees voorzichtig om de wafer niet te breken, met de kanaalruimte naar boven. Gebruik een biopsietpons om gaten te ponsen voor het introduceren van vloeistoffen en cellen in het microfluïdische apparaat. Trim.

Verwijder alle overtollige PDMS. Inspecteer het microfluïdische device om er zeker van te zijn dat het vrij is van stof en vuil. Gebruik 3M Scotch Magic-tape om de PDMS te reinigen.

Stel de PDMS-kanalen en een schoon dekglas nummer nul met een dikte van 80 tot 130 micrometer gedurende 1,5 minuut bloot aan plasmagas. Verwijder de PDMS-slab en het dekglas uit de plasmareiniger in een Petrischaal; bond de PDMS-microfluïdische kanalen met de basis naar beneden op het dekglas. Verhit de microfluïdische assemblage van het dekglas op een warmteplaat ingesteld op 100 degrees Celsius gedurende minimaal 15 minuten. De laatste stap bij het voorbereiden van het microfluïdische apparaat is het positioneren van de PDMS-kanalen en het dekglas boven de elektroden van de PCB.

Begin met het aanbrengen van ongeveer 10 µL minerale olie op de PCB. Om een nauw contact tussen de PCB en het dekglas te garanderen, plaatst u de microfluidische kanaalassemblage met het dekglas op de geoliede PCB. Druk de microfluidische assemblage met het dekglas voorzichtig aan zodra deze de olie raakt om een goed contact te waarborgen en luchtbellen te minimaliseren, aangezien deze de visualisatie van cellen en kraaltjes kunnen belemmeren.

Een andere belangrijke stap is het bereiden van het mediummengsel met lage geleidbaarheid, bestaande uit 8,5% sucrose en 0,3% glucose gewicht-per-volume in gedeïoniseerd water. Het microfluïdische apparaat is nu klaar voor gebruik; vul elk microfluïdisch kanaal indien nodig met 15 tot 20 µL van het medium met lage geleidbaarheid met behulp van een pipette. Gebruik vacuümaspiratie om eventuele luchtbellen in de kanalen te verwijderen.

De volgende stap is het introduceren van de testdeeltjes in het microfluïdische apparaat. Deze demonstratie maakt gebruik van een suspensie van 550 polystyreenbolletjes per microliter medium met een lage geleidbaarheid; aangezien de bolletjes na verloop van tijd kunnen bezinken, moeten ze door agitatie opnieuw worden gesuspendeerd. Introduceer vervolgens met een pipet 200 microliters van de polystyreenbolletjessuspensie in het kanaal.

De volgende stap is het voorbereiden van de elektroden en het verbinden van de uitgang van een functiegenerator met de ingang van een AC-versterker. Verbind vervolgens de uitgang van de versterker met de elektrodedraden. Bedek alle elektrische draden en oppervlakken van de opstelling met isolatietape om gebruikers te beschermen tegen mogelijke elektrische schokken.

Stel de functiegenerator zo in dat er een sinusgolfuitgang van 1 tot 1,5 megahertz wordt gegenereerd. Start de DEP om te beginnen met het sorteren van de cellen en beads in deze opstelling. Het inlaatkanaal bevindt zich rechts en de drie doelkanalen splitsen zich bij de trifurcatie.

De PCB-elektroden komen overeen met de zwarte strepen zonder laminaire stroming en zonder DEP. De kralen blijven in wezen stationair bij het starten van de DEP, maar zonder stroming. De kralen migreren naar de PCB-elektroden en weg van de ruimte tussen de elektroden wanneer de laminaire stroming is ingeschakeld.

Wanneer de DEP is uitgeschakeld, worden de kralen die door de inlaatkanalen stromen verdeeld over de drie doelkanalen. Zodra de DEP wordt geactiveerd en de laminaire stroming is ingeschakeld, worden de kralen gestuurd om uitsluitend in het centrale kanaal te stromen. In de volgende video's is het microfluïdische apparaat boven de PCB-elektroden gedraaid, wat resulteerde in een verandering in de oriëntatie van de kanalen.

Met betrekking tot de PCB-elektroden: het inlaatkanaal, dat voorheen loodrecht op de PCB-elektroden stond, bevindt zich nu bijna parallel aan de elektroden wanneer de laminaire stroming is ingeschakeld. Maar wanneer DEP is uitgeschakeld, treden de kraaltjes gelijkmatig in alle drie de doelkanalen binnen.

Wanneer DEP wordt geïnitieerd, naderen de beads het trifurcatiepunt en trekt de DEP-kracht de beads in het zijkanaal boven de elektrode. De volgende reeks figuren in de video toont een mengsel van menselijke colonadenocarcinoom- of HT 29-cellen en fluorescerende beads in het microfluïdische apparaat. In deze DIC-afbeelding geeft de open pijl de richting van de laminaire stroming aan, en de kanalen zijn omlijnd met streeplijnen.

De reflecterende metalelektroden zijn zichtbaar als de lichte achtergrondstreep; DIC-microscopie wordt gebruikt om de kralen af te beelden terwijl de intensiteit van de gloeiing wordt geschaald. De afbeeldingen worden gebruikt om de cellen beter zichtbaar te maken.

Deze figuur is hetzelfde beeld als de andere figuur, maar dan weergegeven als een glow-scale intensiteitsbeeld, om zo zowel de cellen als de beads te visualiseren. De reflecterende metalen elektroden verschijnen in deze figuur als gele en groene strepen. Met DEP verlaten de beads het rechterkanaal, zoals getoond in het DIC-beeld, terwijl de HT 29-cellen het centrale en linkerkanaal verlaten, zoals te zien is in het glow-scale beeld voorafgaand aan het starten van de DEP. Een gemengde oplossing van cellen en beads stroomt van het ene inlaatkanaal naar de drie afzonderlijke doelkanalen.

Na het induceren van DEP worden de bolletjes en cellen selectief in afzonderlijke kanalen gestuurd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kunt beginnen met het implementeren van dielektroforese voor de manipulatie van cellen en bolletjes binnen microfluïdische apparaten.