Name: Murine Oppervlakkige lymfkliertest Chirurgie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Leer de chirurgische verwijdering van oppervlakkige lymfeklieren bij muizen voor immunologisch onderzoek. Deze techniek maakt tijdsafhankelijke analyse van immuunresponsen mogelijk via flowcytometrie van levende lymfocyten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Sylvie Lesage en alle lab-leden voor de kritische lezing van het protocol. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​(MOP-77545) van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque wordt ondersteund door een FRSQ Senior Scholarship en Melissa Mathieu kreeg een NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.

1. Voorbereiding voor de operatie Muizen werden behandeld in overeenstemming met de Canadese Raad voor Dierenaangelegenheden Care richtlijnen. <ol><li> Verdoven muizen door injectie van ketamine / xylazine (150/300 mg / kg, ip) of door inhalatie van isofluraan (2% 1L zuurstof). Indien beschikbaar is, dient isofluraan worden gebruikt als het zorgt voor een betere controle van de narcose tijd en diepte. Ook is zuurstof toegediend op hetzelfde moment waarop de fysiologische functies van het dier ondersteunt. Bovendien wordt isofluraan direct geëlimineerd door de longen en dus vereist geen lever-of nierproblemen metabolisme. </li><li> Injecteer buprenorfine (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) of een andere analgeticum. </li><li> Breng zalf op de muis ogen voor de operatie om droge ogen te vermijden (indien van isofluraan wordt gebruikt). </li><li> Controleer of de muis in slaap is door te knijpen zijn poot en rollend zijn staart. Als de muis niet reageert, ga dan verder met de operatie. </li></ol> 2. De operatie <pclass het is mogelijk verwijderen van de oppervlakkige lymfeknopen door chirurgie: twee inguinale en arm. isolatie ln gemakkelijker in jonge magere muizen weken aangezien aanwezigheid vetweefsel oudere kunnen interfereren met isolatie. echter wordt deze beperking te overwinnen bij herhaalde praktijk. voor comfort oogsten we een maximum lns tijd als tijd-gangen-experimenten uit voeren om dag. ook infectie voorkomen kan antibiotica worden gegeven aan muis maar wij niet wonden zijn genezen prima. men moet er rekening mee dat afhankelijk experimentele ontwerp gebruik antibioticum be resultaat waargenomen reactie op bacterie gemeten merk alle instrumenten gesteriliseerd na elk aseptische omstandigheden gehandhaafd tijdens gehele procedure.><ol><li> Plaats de muis op zijn kant. </li><li> Lokaliseer de regio waar u uitvoeren van een incision, afhankelijk van de LN u oogsten. (Figuur 1). </li><li> Toepassen chloorhexidine of een desinfectiemiddel, die regio. </li><li> Een kleine insnijding met schaar (ongeveer 5 mm) hetzij aan de achterkant van het onderbeen of boven de achterpoot bij buik (figuur 1). </li><li> Verwijder de losse haren die u hebt gesneden met de tang. Als u wilt, kunt u de muis scheren voor het maken van de incisie. Echter, het verlengt de procedure en we vinden dat het niet nodig is, aangezien, zoals hier wordt getoond, niet is verbeterd genezing of vermindering van infectie, die beide zeer zeldzaam. </li><li> Strek de incisie met 2 tangen om de LN te zien. De incisie kan oplopen tot 10 mm. De LN verschijnt grijs of donkerder dan de omringende vet. </li><li> Knijp de fascia (de dunne membraan dat het vet en weefsel) op de top van de LN met een pincet en trek voorzichtig zonder het omringende weefsel. </li><li> Plaats tweede tang zoveel mogelijk underneath de LN. Met de eerste tang, breek de fascia en verwijder de LN. Als u met succes de geoogste LN, moet een vlek van bloed verschijnen op de plaats waar de LN eerder werd gevestigd. Merk op dat de LN zinkt in een isotone oplossing. Deze eenvoudige test kunt u controleren of u een LN en niet vetweefsel gewonnen. </li><li> Controleer of er geen haren in de wond. </li><li> Sluit de insnijding door het steken van de twee delen van de huid elkaar (de binnenzijde van de huid) en nieten met een clip. Wij gebruiken een aantal Michel Clip met het toepassen van een tang. Plaats een of twee clips afhankelijk van de grootte van de insnijding. Meestal de clips vallen wanneer het weefsel geneest. </li></ol> 3. Postoperatieve zorg <ol><li> Voeg wat natvoer de bodem van de kooi, zodat de muizen gemakkelijk voeden na de operatie. </li><li> Ongeveer 6 tot 8 uur na de operatie, controleert u de muizen om ervoor te zorgen dat ze geen pijn ervaren. Let zorgvuldig op hun gedrag (houding, manier van lopen, ininteractie met de congeneer en het uiterlijk van de vacht). Als de totale uitstraling van de muizen is slecht, het beheren van een tweede dosis van buprenorfine. De volgende dag de muizen moeten weer hun normale gedrag anders doorgaan met de toediening van buprenorfine. De muizen mag nooit bij de eindpunten vooraf bepaald en geaccepteerd door uw Animal Care Raad. Wellicht wilt u advies in te winnen van en naar uw verzorging van dieren terrarium technicus te helpen. </li></ol> 4. Lymfkliertest Handling <ol><li> In het laboratorium, op een enkele cel suspensie te verkrijgen, distantiëren de LN als je per gebruikelijke procedure. We kiezen LN tegen mat dia's en routinematig te verkrijgen 1-2 x 10 6 cellen per LN. Als alternatief, bereiden we de LN voor RNA-extractie. </li><li> Vlekken op de cellen als per uw gebruikelijke protocol. U moet krijgen naar verwachting LN flowcytometrie profielen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing ppartij wordt getoond LNS geoogst van een verdoofd muizen door een operatie of een opgeofferd muis (figuur 2). Het profiel en de percentages van cellen in de live-lymfocyt gate zijn gelijk aan te tonen dat LN chirurgie is een geschikte techniek om te oogsten cellen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Lies en arm LN lokalisatie in de muis. A. de lies LN bevindt zich net boven de achterpoot, iets in de richting van de buik. B. De arm LN bevindt zich achter het voorbeen. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Flowcytometrie profiel van lymfocyten die wordt verkregen na LN chirurgie. Vooruit en zijwaartse verstrooiing profielen worden getoond voor LNS geoogst van een Anesthetized muis door een operatie (A) of van een geofferd muis (B). LNS werden geoogst, gescheiden en geanalyseerd op een flow cytometer. Percentages van cellen in levende lymfocyten poort weergegeven. </pclass>

<ol><li>Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+but+curtailed+T-cell+response+to+very+low-affinity+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen.</a> Nature. 458, 211-214 (2009).</li>
<li>Vezys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8+T-cell+compartment+grows+in+size+with+immunological+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience.</a> Nature. 457, 196-199 (2009).</li>
<li>Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+persistence+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+depend+on+T+cell+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1.</a> Immunity. 33, 229-240 (2010).</li>
<li>Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+central+memory+CD8+T+cells+is+independent+of+CD62L-mediated+trafficking+to+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes.</a> J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).</li>
<li>Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+complementation+of+MHC+class+II+deficiency+by+intrathymic+delivery+of+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses.</a> Immunity. 7, 123-134 (1997).</li>
<li>Witherden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-controllable+selection+of+CD4%28%2B%29+T+cells%3A+half-life+and+survival+signals+in+the+absence+of+major+histocompatibility+complex+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules.</a> J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).</li>
<li>Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+TCR+does+a+T+cell+need%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">How much TCR does a T cell need.</a> Immunity. 15, 71-82 (2001).</li>
<li>Leignadier, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+density+influences+CD8%2B+memory+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation.</a> PLoS One. 5, e13740(2010).</li>
<li>Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T-lymphocyte+survival+does+not+require+T-cell+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).</li>
<li>Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+persistence+is+required+throughout+the+expansion+phase+of+a+CD4%28%2B%29+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response.</a> J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).</li>
<li>Bassett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell+expansion+and+maintenance+after+recombinant+adenovirus+immunization+rely+upon+cooperation+between+hematopoietic+and+nonhematopoietic+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells.</a> Blood. 117, 1146-1155 (2011).</li>
<li>Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+receptor+expression+levels+do+not+identify+CD8%2B+memory+T+lymphocyte+precursors+following+peptide+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization.</a> J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).</li>
<li>Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+TCR+expression+on+naive+CD8%2B+T+cells+does+not+affect+memory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation.</a> Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben beschreven een protocol van LN operatie die kan worden toegepast op een groot aantal experimentele systemen. Hoewel het zeer nuttig om te volgen immuunreacties of immuuncellen homeostase, deze techniek heeft een aantal beperkingen. Ten eerste kan slechts vier LNS worden geoogst. Ten tweede moet de bestudeerde immuunrespons zijn systemische of voorkomen in de oppervlakkige inguinale of brachiale (huid-drainage) LNS. Tenslotte wordt het aantal geoogste cellen beïnvloed door de kwaliteit van de LN verwijdering, t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Graefe Fine Patroon Premium tang </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 52-2144 </td><td> Sterk gebogen, 10 cm (4 in), 0,8 mm tip </td></tr><tr><td> Michel Clip toepassen en verwijderen tang </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 52-3779 </td><td> 12,5 cm (5 cm) </td></tr><tr><td> Michel Clip 100 </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> 52-3746 </td><td> 7.5-1.75 mm </td></tr><tr><td> Temgesic (buprenorfinehydrochloride) </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetalar (Ketamine hydrochloride) </td><td> Boniche Animal Healthcare </td><td></td><td> DIN: 01989529 </td></tr><tr><td> Rompun (xylazine) </td><td> Bayer </td> &lt;td&gt; </td><td> DIN: 02169592 </td></tr><tr><td> Isofluraan </td><td> ABBOTT </td><td></td><td> DIN: 02032384 </td></tr><tr><td> Hypotears oogzalf </td><td> Novartis Ophtalmics </td><td></td><td> DIN: 02133288 </td></tr><tr><td> Baxedin (Clorhexidine gluconaat 2% in isopropylalcohol 70%) </td><td> Omega </td><td> L0000017 </td><td> DIN: 02251477 </td></tr></tbody></table>

murine oppervlakkige lymfkliertest chirurgie

Murine Superficial Lymph Node Surgery

Op het gebied van de immunologie, om de progressie van een immuunrespons tegen een vaccin, een infectie of tumor te begrijpen wordt de reactie vaak tijd te volgen. Ook de studie van lymfocyten homeostase vergt tijd natuurlijk experimenten. Het uitvoeren van deze studies in dezelfde muis is ideaal om de experimentele variabiliteit en het aantal muizen gebruikt verminderen. Blood terugtrekking kan uitvoeren van tijdsverloop experimenten maar geeft slechts over circulerende lymfocyten en geeft een beperkt aantal cellen 1-4. Sinds lymfocyten circuleren door het lichaam en die woonachtig zijn in de lymfeklieren hebben verschillende eigenschappen, is het belangrijk om te onderzoeken beide locaties. De sequentiële verwijdering van lymfeklieren door een operatie biedt een unieke gelegenheid om een ​​immuunrespons of immuun cel expansie in dezelfde muis over de tijd te volgen. De techniek levert tussen 1 2x10 6 cellen per lymfeknoop die voldoende is om ierform fenotypische karakterisering en / of functionele assays. Sequential lymfklier operatie of lymfadenectomie is met succes gebruikt door ons en anderen 5-11. Hier beschrijven we hoe de arm en lies lymfeklieren kan worden verwijderd door een kleine incisie in de huid van een narcose muis. Sinds de operatie is oppervlakkig en snel gedaan, de muis herstelt heel snel geneest goed en niet een overmatige pijn. Elke tweede dag, is het mogelijk om oogsten een of twee lymfeknopen waardoor tijdsverloop experimenten. Deze techniek is dus geschikt om de eigenschappen van lymfeknoop-verblijvende lymfocyten bestuderen tijd. Deze aanpak is geschikt voor verschillende experimentele ontwerpen en wij geloven dat veel laboratoria baat zouden hebben bij het uitvoeren van opeenvolgende lymfeknoop operaties.

Om de progressie van een immuunrespons na verloop van tijd in dezelfde muis volgen, kunnen de lymfeklieren achter elkaar worden verwijderd door een operatie. Hier wordt beschreven hoe deze techniek kan worden uitgevoerd.

Murine Oppervlakkige lymfkliertest Chirurgie

Op het gebied van de immunologie wordt de respons vaak ..., om het verloop van een immuunrespons tegen een vaccin, een infectie of een tumor te begrijpen.

Het algemene doel van deze procedure is om chirurgisch lymfeklieren te verwijderen bij een geanestheseerde muis. Dit wordt bereikt door eerst de lymfeklieren te lokaliseren. De lymfeklieren worden geoogst, waarna de incisie wordt gesloten.Ten slotte kan een suspensie van enkelvoudige cellen worden verkregen voor experimentele analyse. Uiteindelijk kunnen levensvatbare lymfocytenpopulaties worden geëvalueerd via flowcytometrie. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, aangezien de lokalisatie en verwijdering van lymfeklieren bekeken moeten worden om deze procedure te beheersen.Nadat de muis is geanestheseerd, brengt u oogsalf aan, injecteert u buprenorfine en bevestigt u de sedatie via een teenknijptest, waarna u de muis op zijn zij legt. Lokaliseer eerst de brachiale lymfeknoop en scheer vervolgens het te dissekeren gebied. Nadat eventuele losse haren zijn weggeborsteld, brengt u een desinfectiemiddel aan op het gebied en maakt u vervolgens een kleine incisie van ongeveer vijf millimeter op de achterzijde van het voorbeen.Gebruik twee sets pincetten om de incisie open te trekken totdat de brachiale lymfeklier, die grijsachtig of donkerder kan zijn dan het omliggend

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een techniek voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de lies lymfeklier (LN) is geschetst. Een dergelijke techniek maakt het mogelijk voor...

Intravitale Microscopie van de lies lymfkliertest

This video demonstrates the surgical isolation procedure of the inguinal draining lymph node from a mouse model. Incision of the abdominal region provides access to the inguinal lymph node, which is surgically harvested. The harvested translucent inguinal lymph node can be used for immunological studies.

Harvesting an Inguinal Draining Lymph Node from a Murine Model

We beschrijven hier een minimaal invasieve laparoscopische techniek voor periodieke bemonstering van de lever en mesenteriale lymfeknopen (MLN) bij makaken waarmee verhoogde bemonsteringsfrequentie, en vermindert de kans op operatieve complicaties in vergelijking met het uitvoeren van een laparotomie.

Laparoscopische techniek voor seriële Verzameling van lever en mesenteriale lymfeklieren in makaken

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Dit diermodel stelt onderzoekers in staat om statistisch significant secundair lymfoedeem in het achterlijf van muizen te induceren, met een minimumduur van 8 weken. Het model kan worden gebruikt om de pathofysiologie van lymfoedeem te bestuderen en nieuwe behandelingsopties te onderzoeken.

Een herziene methode voor het induceren van secundair lymfoedeem in het achterlijf van muizen

Een protocol om lymfestroom te blokkeren door chirurgische hechting van afferent lymfevaten wordt gepresenteerd.

Het blokkeren van lymfestroom door het hechten van Afferent Lymfatische bloedvaten in muizen

Lymfoedeem is zwelling van de extremiteit veroorzaakt door lymfatische disfunctie. We beschrijven een chronisch muizenstaartmodel van lymfoedeem en het nieuwe gebruik van weefselnanotransfectietechnologie (TNT) voor genetische ladingafgifte aan de staart.

Een Murine Staart Lymfoedeem Model

Het huidige protocol beschrijft een muismodel van de ablatie van adrenerge innervatie door het superieure cervicale ganglion te identificeren en te reseceren.

Chirurgische techniek voor superieure cervicale ganglionectomie in een muizenmodel

Dit protocol beschrijft een overlevingsprocedure voor een veilige en goed verdraagde bilaterale murale nierlymfadenectomie.

Murine bilaterale nierlymfadenectomie

Dit protocol beschrijft een overlevingsprocedure voor een veilige en goed verdraagde muismesenteriale lymfadenectomyat van elk van vier stations langs de mesenterische lymfeklierketen. Deze procedure is aanpasbaar om selectieve verstoring van lymfecommunicatie met de distale colon, proximale dikke darm en/of dunne darm mogelijk te maken.

Muismesenteriene lymfadenectomie voor selectieve verstoring van lymfatische communicatie met regio-specifieke darmen

Leer de chirurgische verwijdering van oppervlakkige lymfeklieren bij muizen voor immunologisch onderzoek. Deze techniek maakt tijdsafhankelijke analyse van immuunresponsen mogelijk via flowcytometrie van levende lymfocyten.

Murine Oppervlakkige lymfkliertest Chirurgie

Meer video's verkennen