Name: Basis- Caenorhabditis elegans Methoden: Synchronisatie-en- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Leer C. elegans synchroniseren bij het eerste larvale stadium met behulp van alkalische hypochlorietoplossing. Deze methode is ideaal voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek en biedt waardevolle optimalisatietips.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Auteurs willen MICINN (PTA programma ter ondersteuning van Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (PhD Fellowship aan Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programma ter ondersteuning van Julián Cerón), en Marie Curie-IRG, ISCIII en IDIBELL te erkennen voor de financiering van het lab.

1. Protocol A: Het kweken van Worms voor het bleken van 11 Grote populaties van C. elegans kan worden verkregen door het kweken die hetzij in vloeibare media of vast medium in platen. Ze zijn meestal gegroeid op vaste NGM (Nematode Groei Media) en gevoed met E. coli bacteriën, die aan de platen een levend of dood (gedood door UV 12, door hitte 13 of koude door 14). De meest gebruikelijke procedure maakt gebruik van live-OP50 E. coli die defect in de synthese van uracil en niet overwoekeren een dikke laag zou belemmeren de wormen. <ol><li> Meng 3 g NaCl, 17 g agar en 2,5 g pepton en voeg 975 ml H2O Autoclaaf 50 minuten. </li><li> Koel de kolf af tot 55 ° C. </li><li> Voeg 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg / ml cholesterol in ethanol, 1 ml 1 M MgSÜ4 en 25 ml 1 M KPO 4 buffer (allemaal maar cholesterol eerder autoclaved). </li><li> Met behulp van steriele procedures afzien van de NGM oplossing in petrischalen, vul platen tot 2/3 van hun volume. </li><li> Na droging is het raadzaam om platen te verlaten kamertemperatuur 2-3 dagen vóór gebruik voor de detectie van verontreinigingen. Maak een streak van OP50 E. coli uit een glycerol voorraad (OP50 kan worden verkregen bij de Caenorhabditis Genetics Center). </li><li> Kies een kolonie en groeien in LB overnacht bij 37 ° C onder roeren. </li><li> Overtollig van vocht uit de platen verdampen door het verwijderen van het deksel in de laminaire stroming en voeg OP50 het centrum van de plaat met een steriele Pasteur pipet. </li><li> Laat de OP50 E. coli gazon een nacht groeien bij kamertemperatuur of bij 37 ° C gedurende 8 uur. </li><li> Voeg de gewenste hoeveelheid wormen de platen (indien geïncubeerd bij 37 ° C platen worden gekoeld bij kamertemperatuur voor gebruik). </li></ol> TIPS: <ul><li> De uitstorting van dezelfde hoeveelheid mediain de platen met een pipet of een dispenser pomp zorgt hetzelfde volume agar de platen en vergemakkelijkt het verplaatsen van de plaat zonder de noodzaak om de stereomicroscoop heroriënteren. </li><li> Platen (zowel zaden en unseeded met bacteriën) kan verschillende weken na bereid bij opgeslagen in een bij kamertemperatuur en 4 ° C. </li><li> Voorkom plateren de bacteriën aan de rand van de plaat. Als het gazon uitstrekt tot de randen van de plaat de wormen kan kruipen de zijkanten, uitdrogen en sterven. </li><li> Wormen leven langer als de bacterie gezaaid op de platen zijn al dood 15. </li></ul> 2. Protocol B: Behandeling met Alkaline hypochloriet oplossing (&quot;Bleken&quot;) 11 Het bleken techniek wordt gebruikt voor synchronisatie C. elegans culturen op het eerste larvale stadium (L1). Het principe van de werkwijze ligt in het feit dat wormen gevoelig zijn bleken terwijl de eischaal beschermt embryos van. Na behandeling met alkalisch hypochloriet-oplossing, worden embryo&#39;s geïncubeerd in vloeibare media zonder voedsel, die zich toelegt laat maar voorkomt verdere ontwikkeling. <ol><li> Laat wormen te groeien tot volwassen stadium. </li><li> Recover zwangere volwassenen in 15 ml buizen door het wassen van platen met M9 buffer. </li><li> Pellet wormen door centrifugeren gedurende 2 minuten 400xg (~ 1500 rpm op een standaard tafelcentrifuge) bij kamertemperatuur en verwijderen supernatant. </li><li> Voer 1-3 wasbeurten totdat de buffer lijkt vrij van bacteriën. </li><li> Het gewenste bleekoplossing (Tabel I) en schud enkele minuten (vernietiging van de volwassen weefsels worden gecontroleerd onder stereomicroscoop en de reactie gestopt wanneer sporen van volwassenen nog zichtbaar, die gewoonlijk 3 tot 9 minuten, afhankelijk takes kwesties, zoals het volume van de worm pellet, genoemd in de discussie) (afb. 3). </li><li> Stop reactie door het toevoegen van M9 Buffer de buis vullen. </li><li> Snel (sinds de behandeling nog steeds actief zijn) centrifugeer 1 minuut bij 400 xg en gooi supernatant. </li><li> Was de pellet nog drie keer door het vullen van de buis met M9 buffer. </li><li> Voeg 1 ml M9 buffer op de korrel, of plaats de eieren ongeplaatste NGM platen, en incubeer op de gewenste temperatuur onder zacht schudden. Goede beluchting dient te worden voorzien (Fig. 4). </li></ol> TIPS: <ul><li> Er zijn verschillende bleken oplossingen te kiezen die beter werkt in je handen (zie tabel 1, Fig. 1). </li><li> Eieren al gelegd op de platen kan worden teruggewonnen door schrappen het oppervlak van de agar met een zacht materiaal, zoals een stuk van een X-straal film. </li><li> Te veel resten van volwassen dieren kan schadelijk zijn voor synchronisatie aangezien zij een voedselvoorziening voor de onlangs uitgekomen larven. </li><li> Hogere temperaturen iets versnellen van de ontwikkeling die is lastig if een worm slaat synchronisatie omdat het verschil in ontwikkeling tussen gesynchroniseerd en niet-gesynchroniseerde wormen groter zal zijn bij hogere temperaturen. </li><li> Bleken oplossing moet vlak voor worden uitgevoerd om het gebruik ervan. Daarnaast bleek verliest kracht nadat het is al een tijdje open, mede vanwege de lichtgevoeligheid. Wij stellen voor om aliquot elke nieuwe fles in kleine amberkleurige flesjes die schade te voorkomen en blootstelling aan licht te minimaliseren. </li></ul> 3. Protocol C: Worm Plating <ol><li> Wacht tussen 12 en 24 uur (tijd embryonale ontwikkeling vullen afhankelijk van de temperatuur) na het bleken uitgevoerd en terug wormen door centrifugeren (2 minuten bij 400 x g). </li><li> Gooi supernatant, zaad wormen op de gewenste plaatjes en laat resterende vloeistof droog. </li><li> Plaats platen bij de vereiste temperatuur. </li></ol> TIPS: <ul><li> L1 larven in M9 buffer kan worden gehouden bij 15 ° C schommelen ten minste een week without voor de hand liggende wijzigingen. </li><li> Wees voorzichtig bij het berekenen van de wormen zul je zaad omdat er te veel kan het voedsel uitputten sneller dan verwacht en ruïneren uw experiment. Ongeveer 500 L1 kan bereiken volwassenheid in een 55 mm plaat zonder een tekort aan voedsel. </li></ul> 4. Protocol D: C. elegans Observatie D.1 Nomarski observatie Differentieel interferentie contrast microscopie is een optische microscopie verlichting techniek die gebruikt wordt om het contrast in de ongekleurde transparante monsters te verbeteren. Het woord Nomarski verwijst naar het gebruikte prisma, genoemd naar zijn uitvinder. Door het observeren van dieren in leven zijn wij in staat de fysiologie van het dier te onderzoeken met het enige veranderingen afgeleid van immobilisatie. Bovendien, aangezien geen fixatief wordt toegevoegd, fluorescerende merkers worden in vivo. Dit feit en de mogelijkheid smelten fluorescerende merkers voor een gen van interesse maken het mogelijk om processen w volgenhich het eiwit van onderzoek kan worden betrokken. Door het gebruik van de techniek beschreven in dit protocol, kan niet alleen levende wormen in acht worden genomen, maar ze kunnen ook worden hersteld en bekleed opnieuw. Agar pad voorbereiding (vlak voor gebruik): <ol><li> Bereid agarose 2% in water en smelten. Houd gesmolten bij 65 ° C. </li><li> Plaats twee dia&#39;s met een stukje plakband deze aan weerszijden van een derde schoon dia. </li><li> Met behulp van een Pasteur pipet plaats een druppel agar op de schone ondergrond. </li><li> Bedek de agar met een schoon dia bovenop de drie loodrecht dia. </li><li> Druk voorzichtig zodat de agar druppel plat op de dikte van de band spacers. </li><li> Zodra de agar stolt, trek de tape dia&#39;s en scheiden de twee overgebleven dia&#39;s door te schuiven een familielid naar de andere. </li></ol> Montage van levende dieren <ol start="7"><li> Plaats een druppel (10 ul) van levamisol 1 mm of natriumazide 10-30 mm op thij midden van het pad. </li><li> Breng dieren in de daling van het gebruik van een worm keuze. </li><li> Plaats voorzichtig een dekglaasje over de dieren en bevestig deze aan beide zijden met wat nagellak of silicone. </li></ol> TIPS: <ul><li> Houd aliquots van 2% agarose bij 4 ° C. </li><li> Gesmolten agarose kan worden gehouden op 65 ° C gedurende ten minste een dag. </li><li> Let op: Levamisol is een nicotine receptor agonist die ontlokt spastische spierverlamming 16. </li><li> Wees voorzichtig, natriumazide is extreem giftig! </li></ul> D.2 Ethanol fixatie en DAPI vlekken Het protocol hier beschreven is een snelle manier van verven wormen met DAPI, maar vanwege de dissecation van de worm een ​​aantal structuren kunnen vormen enkele wijziging. Er zijn verschillende andere methodes om wormen voorafgaand aan DAPI vlekken, zoals fixatie met de oplossing Carnoy&#39;s of formaldehyde die beter behoud van de integriteit van de worm 17 vast. Ethanol fixatie (gewijzigd van 18) <ol><li> Plaats ~ 10 pi M9 buffer (of water) op een microscoopglaasje. </li><li> Met behulp van een worm pick zorgvuldig over te dragen 10-25 wormen aan de daling. </li><li> Met behulp van filtreerpapier of een micro-pipet te verwijderen zoveel M9 buffer mogelijk zonder het verwijderen van de wormen of hen te laten drogen. </li><li> Voeg ~ 10 ul van 90% ethanol en laat het drogen. </li><li> Herhaal stap 4 een of twee keer. </li></ol> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring <ol start="6"><li> Meng DAPI met de gewenste afdekmiddel tot een eindconcentratie van 2 ng / pl. </li><li> Zodra de ethanol volledig verdampt, voeg 7 pi van de DAPI: montage media mengsel. </li><li> Plaats een dekglaasje aan en bevestig deze aan beide zijden met wat nagellak of silicone. Dia klaar voor waarneming ongeveer 5 minuten na toevoeging van DAPI. </li></ol> TIPS: <ul><li> De montage media bevat glycerol, dus een kleine hoeveelheid is genoeg om de hele voorbereiding te dekken. </li><li> Er bestaat een breed scala aan commerciële montage media (Fluoromount of verlengen, bijvoorbeeld), hun kwaliteit en prijs hangt af van hoe lang u wilt uw monster op te slaan. </li><li> Wees voorzichtig, DAPI is een bekende mutageen die sterk bindt aan AT-rijke regio&#39;s in DNA. </li></ul> Recepten Nematoden groeimedium (NGM) 1,7% (w / v) Agar 50 mM NaCl 0,25% (w / v) pepton 1 mM CaCl2 5 pg / ml Cholesterol 25 mM KPO 4 1 mM MgSÜ4 M9 buffer 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM NaCl 1 mM MgSÜ4 Bleken oplossingen getest <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> recept # 1 </td><td> recept # 2 </td><td> recept # 3 </td><td> Recept nr. ​​4 </td><td> Recept nr. ​​5 </td></tr><tr><td> water (ml) </td><td> 2,75 </td><td> 3,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> natriumhydroxide (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0,5 (5M) </td><td> 2.5 (1M) </td><td> 2.5 (2M) </td><td> 2.5 (1M) </td></tr><tr><td> natriumhypochloriet op ~ 4% (ml) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> totaal (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tabel I. Verschillende bleken oplossing recepten getest op dit artikel. Recepten # 3 en # 4 zijn 2x en worden toegevoegd aan een gelijk volume M9. Recepten voor # 1 # 2 # 5 en al eerder gemeld 2, 11, 19. Final concentraties: # 1 NaOH 0,25 M, NaOCl op ~ 0,8%<html> , # 2 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%. 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Vergelijking van vijf verschillende oplossingen bleken twee verschillende incubatietijden. N2 wormen tweemaal gewassen met M9 werden verdeeld in vijf 15 ml conische buizen die elk bleken oplossing. Buizen werden krachtig geschud en 1 ml overgebracht naar een nieuwe buis met M9 de reactie na het aangegeven tijdstip stoppen. Na het bleken procedure wormen werden geïncubeerd met 1 ml M9 bij 20 ° C gedurende 24 uur. In elk geval werd onderste foto genomen net na het bleken, bovenste foto 24 uur later. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figuur 2 &quot;/&gt; Figuur 2. Temperatuur bleekoplossing invloed op de doelmatigheid van de behandeling. Gelijke volumes van N2 wormen gebleekt met dezelfde bleekoplossing een vooraf gekoeld op ijs gedurende 20 minuten of bewaard bij 25 ° C op dezelfde tijd. De twee kolommen aan de linkerkant geven aan foto&#39;s net na het bleken. Na behandeling wormen geïncubeerd in 15 ml conische buizen met 1 ml M9 bij 20 ° C gedurende 24 uur. Kolommen aan de rechterkant schermafbeeldingen 24 uur later. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. De verhouding worm pellet: tijdstip alkalisch hypochloriet incubatie invloed op de doelmatigheid van de behandeling 50, 100, 250 en 500 ul worm pellet werden geïncubeerd met 2 ml bleekoplossing # 3 3, 6 en 9 minuten.. Uitgebroed L1, dode embryo&#39;s en resten van volwassen fragmenten werden gekwantificeerd na incubatie bij 20 ° C gedurende 2<html> 4 uur in 15 ml conische buizen met 1 ml M9 buffer. Ongeveer drie confluerende 55 mm platen met volwassen wormen zijn nodig om een ​​100 pi worm pellet te krijgen. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Een goede beluchting is vereist voor broedeieren en overleving van C. elegans embryo. een pellet van 100 pi N2 wormen gebleekt 6 minuten en geïncubeerd in 15 ml conische buizen met 1, 5 of 10 ml zoals aangegeven, van M9 bij 20 ° C gedurende 24 uur. Het bovenste deel van de figuur toont foto&#39;s van de culturen na 24 uur, waarbij pijlen eieren niet uitkomen. Onderaan is een grafiek die de hoeveelheid larven (grijs) en dode embryo (grijs) 48 uur na het bleken op de aangegeven voorwaarden. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Figuur 5 &quot;/&gt; Figuur 5. Levenscyclus van C. elegans. een. Geschatte lengte van de wormen in verschillende stadia. Uur nodig is om elke fase te bereiken, afhankelijk van de temperatuur (gewijzigd vanaf 20). B. Nomarski (omhoog) en DAPI (naar beneden) foto&#39;s van verschillende wormen op de aangegeven ontwikkelingsstadia. De meeste belangrijke functies in elke fase worden vergroot L1: pijl geeft de voorlopers van de somatische gonaden en de kiembaan vroege L4: zwarte pijl (Nomarski) geeft de ontwikkeling van vulva, witte pijlen (DAPI) geven de twee gonadale armen Mid-... laat L4: pijl geeft de ontwikkeling van vulva op de zogenaamde kerstboom stadium Young Adult:. zwarte pijl geeft aan een embryo in de baarmoeder, pijlpunt wijst naar de spermatheca, witte pijl geeft een eicel zwangere volwassene:. pijlpunt (DAPI) wijst erop bevruchte embryo&#39;s. Arrow in DAPI beeld geeft aan spermatheca. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Vulva morfologie bij L3, L4 en volwassen stadia. Op L3 stadium alleen een lumen waarin de vulva gevormd worden waargenomen. Op L4 dit lumen expandeert die de zogenaamde &quot;kerstboom&quot;. In de volwassen de vulva is al gesloten. Gele lijnen geven de plaats van de vulva op deze drie fasen. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="Figuur 7" /> Figuur 7. DAPI vlekken op L3, L4 vroege, late L4 en volwassen stadia. Op L3, wordt kiemlijn verlengd. Op L4, gonaden armen huidige U-vorm morfologie. Op late-L4 stadium sperma kan worden waargenomen in het distale deel van de gonaden. Jonge Volwassenen presenteren eicellen. De Adult kiembaan presenteert eicellen en embryo&#39;s. Gele lijnen begrenzen kiem lijnen op ee verschillende stadia aangegeven. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="Figuur 8" /> Figuur 8. C. elegans ontwikkeling bij 15 en 25 ° C. N2 wormen gebleekt, overnacht geïncubeerd in M9 en roeren bij 15 ° C, overgebracht naar platen en gekweekt de aangegeven tijdstippen de aangegeven temperaturen.

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1988).</li>
<li>Potts, M. B., Cameron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+cell+death%3A+Caenorhabditis+elegans+and+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and cell death: Caenorhabditis elegans and cancer research.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 50-58 (2011).</li>
<li>Kimble, J., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postembryonic+cell+lineages+of+the+hermaphrodite+and+male+gonads+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The postembryonic cell lineages of the hermaphrodite and male gonads in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 70, 396-417 (1979).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-24 (2010).</li>
<li>Depuydt, G., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+metabolism+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein metabolism and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 81-107 (2010).</li>
<li>Jia, K., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+longevity%3A+lessons+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and longevity: lessons from C. elegans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 47-60 (2010).</li>
<li>Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology.</a> Dev. Dyn. 239, 1539-1554 (2010).</li>
<li>Waters, K. A., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+control+of+germ+cell+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic control of germ cell proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 151-160 (2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev. Biol. 8, 49(2008).</li>
<li>Olahova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox-sensitive+peroxiredoxin+that+is+important+for+longevity+has+tissue-+and+stress-specific+roles+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A redox-sensitive peroxiredoxin that is important for longevity has tissue- and stress-specific roles in stress resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19839-19344 (2008).</li>
<li>Voisine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington%27s+disease+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2, e504(2007).</li>
<li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Aceves, J., Erlij, D., Martinez-Maranon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+paralysing+action+of+tetramisole+on+Ascaris+somatic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the paralysing action of tetramisole on Ascaris somatic muscle.</a> Br. J. Pharmacol. 38, 602-607 (1970).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Methods in cell biology.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbardm, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+glp-1+mutants+suggests+receptor+interaction+or+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition.</a> Genetics. 163 (1), 115-132 (2003).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10417-10422 (2002).</li>
<li>Protocols [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://protocols.mmml.nl">http://protocols.mmml.nl</a> (2012).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Nematode Synchronisatie Verschillende oplossingen bleken zijn beschreven. We hebben geprobeerd vijf verschillende recepten (Tabel I) en, in onze handen, ze toonde geen significante verschillen in de synchronisatie van worm populaties (afb. 1). Maar onze experimenten toonden aan dat zoals temperatuur (Fig. 2), de verhouding bleekoplossing: volume van wormen (fig. 3) en het volume van M9 met de embryo&#39;s geïncubeerd broedeiere...

basis-<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; methoden: synchronisatie-en-

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Onderzoek naar de Ontwikkelings-en Moleculaire biologie van de nematode Caenorhabditis elegans is begonnen in de vroege jaren zeventig door Sydney Brenner en het is sindsdien veelvuldig gebruikt als modelorganisme 1. C. elegans bezit essentiële eigenschappen als eenvoud, transparantie en korte levenscyclus hebben gemaakt dat het een geschikte experimentele systeem voor fundamenteel biologisch onderzoek voor vele jaren 2. Ontdekkingen in deze nematode heeft grote gevolgen, omdat vele cellulaire en moleculaire processen die de dieren ontwikkeling zijn evolutionair geconserveerd 3. C. elegans levenscyclus gaat door middel van een embryonale fase en vier larvale stadia voordat de dieren volwassen zijn. Ontwikkeling kan 2 tot 4 dagen te afhankelijk van de temperatuur. In elk van de fasen een aantal kenmerkende eigenschappen waar te nemen. De kennis van de complete cellijn 4,5 samen met de diepe annotation van zijn genoom maken van dit aaltje in een groot model in uiteenlopende gebieden als de neurobiologie 6, de vergrijzing 7,8, stamcelbiologie 9 en kiembaan biologie 10. Een extra functie dat C. maakt elegans aantrekkelijk model te werken met de mogelijkheid om populaties wormen gesynchroniseerd in een bepaald stadium met een relatief eenvoudige protocol. Het gemak van onderhoud en propageren van deze nematode toegevoegd om de mogelijkheid van synchronisatie een krachtig middel grote hoeveelheden wormen, die kunnen worden gebruikt voor een groot aantal kleine of high-throughput experimenten zoals RNAi schermen, microarrays, massieve sequencing verkrijgen, immunoblot of in situ hybridisatie, onder anderen. Door de transparantie C. elegans structuren kunnen worden onderscheiden onder de microscoop met differentieel interferentie contrast microscopie, ook bekend als micro Nomarskikopiëren. Het gebruik van een fluorescerende DNA bindmiddel DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool) bijvoorbeeld kan leiden tot de specifieke identificatie en lokalisatie van individuele cellen alsmede subcellulaire structuren / defecten worden herkend.

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de nematode<em&gt; C. elegans</em&gt; Maken het een leuk model organisme om mee te werken. De mogelijkheid synchronisatie wormen kan het werken met een aanzienlijke hoeveelheid onderwerpen aan dezelfde ontwikkelingsfase, wat maakt de studie van een bepaald proces veel dieren.

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Onderzoek naar de moleculaire en ontwikkelingsbiologie van de nematode Caenorhabditis elegans werd begin jaren zeventig gestart door Sydney Brenner en het is ...

In deze video laten we u zien hoe u C. elegans synchroniseert in het L1-stadium. Dit is een eenvoudige methode, maar deze komt zeer veel voor en is daarom erg nuttig, zeker als u nog een beginner bent.Als u een expert bent in C, vindt u hier wellicht enkele tips om dit protocol te optimaliseren. De basis van de synchronisatie van wormen berust op de relatieve resistentie van embryo's ten opzichte van volwassen wormen tegenover een alkalische hypochlorietoplossing. Hierbij worden deze volwassen wormen, met talrijke embryo's in hun lichaam, geïncubeerd met een hypochlorietoplossing zodat zij worden gedood en alleen de embryo's overblijven.Het tweede deel van de synchronisatie wordt bereikt door voedseltekort, zodat embryo's, ook al komen ze op verschillende tijdstippen uit, zich niet verder ontwikkelen dan het L1-stadium. De eerste stap om een blitzing-protocol te starten, is het hebben van wormen in het eigelegendstadium, waarbij er verscheidene eieren over de plaat zijn verspreid. Gebruik M9 om de volwassen wormen te herstellen voor de oogst.Daarnaast kunnen de embryo's die zich al op het oppervlak van de plaat bevinden, worden afgeschraapt met een zacht materiaal, zoals een stukje

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video laten we een methode zien om een ontwikkelingsgesynchronleerde populatie steriele volwassen C. elegans teproduceren. Het voorbeeldprotocol synchroniseert wormen om zuurstofverbruik bij levende dieren te bestuderen.

Nematodensynchronisatie: een methode om populaties wormen in identieke stadia van ontwikkeling te verkrijgen

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Hier worden gestandaardiseerde protocollen gepresenteerd om de inductie van de warmteschokrespons (HSR) in Caenorhabditis elegans te beoordelen met behulp van RT-qPCR op moleculair niveau, tl-verslaggevers op cellulair niveau en thermorecovery op organism niveau.

Gestandaardiseerde methoden voor het meten van inductie van de heat shock response in Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en monteren van Caenorhabditis elegans-embryo's , het registreren van de ontwikkeling onder een 4D-microscoop en het traceren van de cellijn.

4D-microscopie: Caenorhabditis elegans embryonale ontwikkeling ontrafelen met behulp van Nomarski-microscopie

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Dit is een veelgebruikte methode voor C. elegans gonad-dissectie gevolgd door vriesscheur, die kiembaanmonsters produceert voor immunofluorescentie via antilichaamkleuring, of voor eenvoudige DAPI-kleuring om DNA te visualiseren. Dit protocol is succesvol geweest voor studenten in een onderzoekslaboratorium en in een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring.

C. elegans Gonad dissectie en freeze crack voor immunofluorescentie en DAPI-kleuring

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor het in beeld brengen van de mitochondriale morfologie in meerdere weefsels van C. elegans tijdens veroudering.

Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering

Deze studie onderzoekt het effect van leeftijd op de voortbeweging in C. elegans door de grootste Lyapunov-exponent (LLE) te meten. Naarmate ze ouder worden, vertonen C. elegans een toename en daaropvolgende afname van de motorische controle. De resultaten laten een piek LLE zien na vijf dagen, gevolgd door een afname naarmate de wormen ouder worden.

Leeftijdsafhankelijke dynamiek van voortbeweging in Caenorhabditis elegans: een Lyapunov-exponentanalyse

Leer C. elegans synchroniseren bij het eerste larvale stadium met behulp van alkalische hypochlorietoplossing. Deze methode is ideaal voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek en biedt waardevolle optimalisatietips.

Basis-

Meer video's verkennen