Transcriptomic Analyse van de Mens Retina Chirurgische Specimens gebruiken Journal
August 14th, 2013
We gebruikten het netvlies monsters uit retinectomy voor een transcriptoom analyse netvliesloslating. We ontwikkelden een procedure die RNA conservering tussen de chirurgische blokken en het laboratorium maakt. We een gestandaardiseerd protocol voor RNA zuivering door cesiumchloride ultracentrifugatie te verzekeren dat de gezuiverde RNA's zijn geschikt voor microarray analyse.
Het algemene doel van deze procedure is om RNA uit menselijke retinale chirurgische specimen te zuiveren voor transcriptoomanalyse bij netvliesloslating. Met behulp van een journal om dit te doen, worden de reagentia en materialen die nodig zijn voor het verzamelen van het chirurgische specimen in het laboratorium bereid en naar het ziekenhuis gestuurd. Tijdens de chirurgische procedure wordt het specimen verzameld en teruggestuurd naar het lab.
Het RNA wordt vervolgens gezuiverd met behulp van een gestandaardiseerde cesiumchloridegradiëntprocedure en de kwaliteit van het gezuiverde RNA wordt beoordeeld. Uiteindelijk. Analyse van mRNA-expressie toont aan dat zowel ontsteking als fotoreceptordegeneratie betrokken zijn bij netvliesloslating, aangegeven door veranderingen in de expressie van sleutelgenen. In deze processen geïdentificeerd door transcriptoomanalyse, is het belangrijkste voordeel van journal boven bestaande orna-zuivering zoals GTIN-chloor uit extractie, ook wel bekend als ole, dat de resulterende orna niet besmet zijn met DNA.
De toepassing van deze techniek strekt zich uit naar de therapieën van netvliesloslating omdat het technische middelen biedt om nieuwe adjuvante therapieën te ontwikkelen. Gebruik voor elk monster dat moet worden verzameld, een RNAs-vrije pipet om een vijf milliliter steriele polyethyleen ronde bodembuis te vullen met 2,4 milliliter van een zes molaar RNAs-vrije guinechlorideoplossing. Gebruik argongas om het bovenste deel van de buizen te vullen.
Plaats vervolgens snel de dop en druk stevig om te zorgen dat deze afgedicht is. Dit voorkomt dat guinechloride gedurende meerdere jaren van opslag in de chirurgische kast oxideert. Plaats vervolgens elke vijf milliliterbuis in een 50 milliliter steriele polypropyleen, kegelbodembuis.
Na het toevoegen van weefsel en het opschroeven van de dop, plaats de 50 milliliterbuizen in een polystyreenrek. Plaats vervolgens het rek en de voorbereide enveloppen samen met de voorbereide verzendformulieren in een kartonnen doos in het ziekenhuis. Breng de kartonnen doos van de chirurgische kast naar de operatiekamer.
Tijdens de operatie plaatst u het retinale specimen in een buis gevuld met een oplossing van hoeveelheid en chloride. Sluit de buis stevig. Meng de buis kort.
Plaats vervolgens de buis gedurende 10 minuten op de bloedbuisrocker. Vul het bijbehorende monsterformulier in met de identificatie van de patiënt, operatiedatum en eventuele aanvullende opmerkingen. Schrijf vervolgens het identificatienummer op de bijbehorende genummerde 50 milliliterbuis.
Plaats vervolgens de vijf milliliterbuis met het chirurgische specimen in de 50 milliliterbuis. Vervang papierweefsel en sluit de buis. Plaats vervolgens de 50 milliliterbuis en het monsterinnameformulier in de juiste gevoerde envelop en verzegel deze.
Zodra het monster in het lab is ontvangen, homogeniseert u het specimen in zijn vijf milliliterbuis met een poly tron TM homogenisator op de maximale instelling gedurende één minuut terwijl u de buis op en neer beweegt. Zodra het monster is gehomogeniseerd, om de polysacchariden te extraheren, voegt u 270 microliters twee molaar kaliumacetaat toe en plaatst u de buis op een shaker in de horizontale positie. Schud krachtig gedurende 10 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 6.500 G bij 20 graden Celsius.
Na het draaien, gebruikt u een pipet om voorzichtig de oplosbare fractie aan te zuigen zonder de pellet te verstoren. Breng het supernatant over naar een 14 milliliter steriele RNAs-vrije buis. Naast het supernatant, voegt u 5,3 milliliter 1% en Laurel Sarcosine toe in 100 millimolar tri en 3,2 gram cesiumchloride.
De sarcosine zal het membraan oplossen en het cesiumchloride wordt gebruikt om een gradiënt te genereren. Meng de buis door één minuut te vortexen. Voeg 1,8 milliliter cesiumchloride EDTA toe aan een steriele 11 milliliter polymeercentrifugebuis.
Vervolgens slaat u met een 10 milliliter steriele pastorpipet de RNA-oplossing op de cesiumchloride EDTA-oplossing door deze langs de binnenkant van de buis te laten lopen. Plaats de buizen in een centrifuge. Gebruik een tweede buis met de buffers zonder netvlies als balans indien nodig, en draai gedurende 24 uur bij 225.000 G bij 20 graden Celsius.
De volgende dag. Na het draaien zal er een lipidelaag zich bovenaan de buis hebben gevormd. Het DNA zal in het midden zijn en het RNA zal op de bodem van de buis zijn gepelleteerd.
Gebruik een steriele pasterpipet om voorzichtig de bovenste lipidelaag te verwijderen en weg te gooien met een tweede steriele pasterpipet. Verwijder geleidelijk oplossing totdat het viskeuze DNA wordt afgezogen. Gooi de oplossing en het DNA weg.
Vervolgens verwijdert u met een derde steriele pastorpipet de resterende oplossing en gooit deze weg. Zorg ervoor dat u de RNA-pellet niet verstoort. Gebruik nu een vlam gesteriliseerde scalpel om de buis te snijden zoals hier getoond wordt en gooi het bovenste gedeelte weg.
Plaats het resterende gedeelte ondersteboven op steriele gaas. Draai de buis om en gebruik een pipet om het delicaat te spoelen met 160 microliters guinechloride. Laat de pellet 10 minuten drogen.
Zodra de pellet droog is, resuspendeert u deze in 150 microliters tris, E-D-T-A-S-D-S. Voeg vervolgens 150 microliters tris, EDTA en 30 microliters drie molaar natriumacetaat toe en vortex om de RNA te precipiteren. Voeg 900 microliters ijskoud, 100% ethanol toe.
Vortex de buis en plaats deze 30 minuten op smeltende ijs. Centrifugeer vervolgens de buis 30 minuten bij 18.000 G bij vier graden Celsius. Na het draaien kan een kleine witte pellet zichtbaar zijn of niet.
Of de pellet nu zichtbaar is of niet, zuigt u voorzichtig het supernatant af en gooit u het weg. Voeg vervolgens 500 microliters kamertemperatuur, 70% ethanol toe om overtollig zout te verwijderen en vortex. Centrifugeer de buis gedurende 20 minuten bij 18
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op het zuiveren van RNA uit chirurgische monsters van het menselijk netvlies om het transcriptoom te analyseren in gevallen van netvliesloslating. Er wordt gebruik gemaakt van een gestandaardiseerde cesiumchloridegradiëntprocedure om de RNA-kwaliteit voor verdere analyse te waarborgen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Netvliesbiologie
- Transcriptomics
Achtergrond
- Netvliesloslating kan leiden tot significant gezichtsverlies.
- Het begrijpen van veranderingen in genexpressie is cruciaal voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën.
- RNA-kwaliteit is essentieel voor nauwkeurige transcriptomische analyse.
- Bestaande RNA-zuiveringsmethoden kunnen leiden tot besmetting.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode voor RNA-zuivering uit netvliesmonsters te ontwikkelen.
- Om mRNA-expressie gerelateerd aan netvliesloslating te analyseren.
- Om de betrokkenheid van ontsteking en fotoreceptordegeneratie te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Verzameling van netvliesmonsters tijdens retinectomie.
- Voorbereiding van reagentia en materialen voor RNA-extractie.
- Gestandaardiseerde cesiumchloridegradiëntprocedure voor RNA-zuivering.
- Beoordeling van RNA-kwaliteit voor microarray-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van belangrijke genexpressie veranderingen geassocieerd met netvliesloslating.
- Bewijs van ontsteking en fotoreceptordegeneratie in de transcriptomische analyse.
- Demonstratie dat de nieuwe methode DNA-besmetting voorkomt.
- Verbeterde RNA-kwaliteit geschikt voor microarray-analyse.
Conclusies
- De ontwikkelde RNA-zuiveringsmethode is effectief voor netvliesmonsters.
- Transcriptomische analyse biedt inzichten in de mechanismen van netvliesloslating.
- Toekomstig onderzoek kan deze methode gebruiken voor verder onderzoek naar netvliesziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Retinal detachment triggers concurrent inflammation and photoreceptor degeneration, creating a complex pathophysiological environment that complicates therapeutic development. The jouRNAl method enables high-fidelity transcriptomic profiling of surgically discarded human retinal specimens, providing a scalable source of disease-relevant tissue for target validation. This approach supports mechanistic de-risking by linking molecular signatures to clinical phenotypes, informing go/no-go decisions in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous detection of inflammatory and degenerative pathways in human retinal tissue.
- Operational Value: Transforms discarded surgical specimens into validated biological systems, reducing reliance on animal models for early target assessment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing human-derived expression data on CCL2, GNAT1, OPN1SW, and CRX as biomarkers of RD progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers DNA-free RNA suitable for microarray and RT-PCR, ensuring assay specificity for gene expression readouts.
- Operational Value: Standardized cesium chloride gradient protocol ensures reproducibility across batches and sites, enabling scalable screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified RNA quality validated by gel electrophoresis and absorbance, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by using human retinal specimens to validate findings in animal models of inherited retinal degeneration.
- Biomarker Alignment: Identifies CCL2 upregulation and photoreceptor gene downregulation as translatable signatures for therapeutic monitoring.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic insight into RD progression, informing biomarker-stratified clinical trial design.
Pipeline & Workflow Integration
The jouRNAl method integrates into the discovery continuum from early target identification through preclinical validation, enabling human tissue-based de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inflammation and degeneration pathways via transcriptomic analysis of human retinal specimens.
- Screening: Delivers standardized, quantitative RNA outputs suitable for high-throughput gene expression profiling.
- Analytics: Generates measurable readouts (e.g., CCL2 upregulation, GNAT1 downregulation) that allow cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects human specimen data to preclinical continuity by enabling comparative analysis in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA extraction from surgical tissues, applicable across retinal pathologies and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct human tissue transcriptomics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cesium chloride purification, minimizing batch variability in multi-site studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-derived molecular evidence, reducing late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concurrent inflammation and degeneration signatures in patient-derived samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and gradient ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to cesium chloride, ultracentrifuges, and RNase-free laboratory infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, pathology, and molecular biology units for specimen tracking.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of homogenization and lysis steps.
- Practical limitation: RNA yield depends on timely specimen transfer and avoidance of RNase exposure during surgical collection.
