Transcriptomic Analyse van de Mens Retina Chirurgische Specimens gebruiken Journal

Het algemene doel van deze procedure is het zuiveren van RNA uit menselijke chirurgische retina-monsters voor transcriptoomanalyse bij netvliesloslating. Om dit te bereiken, worden de reagentia en materialen die nodig zijn voor de verzameling van het chirurgische monster in het laboratorium voorbereid en naar het ziekenhuis gestuurd. Tijdens de chirurgische ingreep wordt het monster verzameld en teruggestuurd naar het laboratorium.

Het RNA wordt vervolgens gezuiverd met behulp van een gestandaardiseerde cesiumchloride-gradiëntprocedure en de kwaliteit van het gezuiverde RNA wordt beoordeeld. Uiteindelijk laat analyse van de mRNA-expressie zien dat zowel ontsteking als degeneratie van fotoreceptoren betrokken zijn bij netvliesloslating, wat wordt aangegeven door veranderingen in de expressie van sleutelgenen. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande RNA-zuiveringsmethoden zoals guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroformextractie, ook wel bekend als TRIzol, is dat het resulterende RNA niet besmet is met DNA.

De toepassing van deze techniek strekt zich uit tot therapieën voor netvliesloslating, omdat het technische middelen biedt voor de ontwikkeling van nieuwe adjuvante therapieën. Gebruik voor elk te verzamelen monster een RNase-vrije pipet om een steriele polyethyleen buis met ronde bodem van vijf milliliters te vullen met 2,4 milliliters van een zes molar RNase-vrije guanidinechloride-oplossing. Gebruik argongas om het bovenste gedeelte van de buizen te vullen.

Plaats vervolgens snel de dop en druk deze stevig aan om een goede afsluiting te garanderen. Dit voorkomt de oxidatie van guinechloride gedurende meerdere jaren bewaring in de chirurgische kast. Plaats daarna elke buis van 5 milliliter in een steriele polypropylene buis van 50 milliliter met conische bodem.

Nadat het weefsel is toegevoegd en de dop is vastgedraaid, worden de buizen van 50 milliliter in een polystyreen rek geplaatst. Plaats vervolgens het rek en de voorbereide enveloppen samen met de voorbereide verzendformulieren in een kartonnen doos in het ziekenhuis. Breng de kartonnen doos van de chirurgische kast naar de operatiekamer.

Plaats tijdens de operatie het retina-preparaat in een buis gevuld met chloride-oplossing in de aangegeven hoeveelheid. Sluit de buis stevig af. Meng de inhoud van de buis kort.

Plaats de buis vervolgens gedurende 10 minuten op de bloedbuis-rocker. Vul het bijbehorende monsterformulier in met de patiëntidentificatie, de operatiedatum en eventuele aanvullende opmerkingen. Schrijf daarna het identificatienummer op de bijbehorende genummerde buis van 50 milliliter.

Plaats vervolgens de buis van 5 milliliter met het chirurgische preparaat in de buis van 50 milliliter. Voeg papieren weefsel toe en sluit de buis af met de dop. Plaats daarna de buis van 50 milliliter en het monsterregistratieformulier in de bijbehorende gewatteerde envelop en verzegel deze.

Zodra het monster in het laboratorium is ontvangen, homogeniseert u het specimen in de buis van vijf milliliter met een poly tron TM homogeniseerder op de maximale stand gedurende één minuut, terwijl u de buis op en neer beweegt. Nadat het monster is gehomogeniseerd, voegt u ter extractie van de polysachariden 270 µL 2 M kaliumacetaat toe en plaatst u de buis horizontaal op een schudmachine. Schud krachtig gedurende 10 minuten en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 6.500 G bij 20 °C.

Zuig na het centrifugeren met een pipet voorzichtig de oplosbare fractie op zonder het pellet te verstoren. Breng het supernatant over naar een steriele RNase-vrije buis van 14 milliliter. Voeg aan het supernatant 5,3 milliliter 1% Laurylsarcosine in 100 millimolaire Tris en 3,2 gram cesiumchloride toe.

De sarcosine zal het membraan solubiliseren en het cesiumchloride wordt gebruikt om een gradiënt te genereren. Meng de buis door één minuut te vortexen. Voeg 1,8 milliliters cesiumchloride EDTA toe aan een steriele polymere centrifugebuis van 11 milliliter.

Laag vervolgens met een steriele Pasteurpipet van 10 milliliter de RNA-oplossing op de cesiumchloride EDTA-oplossing door deze langs de binnenzijde van de buis te laten lopen. Plaats de buizen in een centrifuge. Gebruik indien nodig een tweede buis met de buffers zonder retina als tegengewicht en centrifugeer gedurende 24 uur bij 225 000 G bij 20 °C.

De volgende dag. Na het centrifugeren zal er zich een lipidelaag aan de bovenkant van de buis hebben gevormd. Het DNA bevindt zich in het midden en het RNA zal als pellet onderin de buis aanwezig zijn.

Gebruik een steriele Pasteur-pipet om de bovenste lipidelaag voorzichtig te verwijderen en weg te gooien met een tweede steriele Pasteur-pipet. Verwijder geleidelijk de oplossing totdat het viskeuze DNA is opgezogen. Gooi de oplossing en het DNA weg.

Verwijder vervolgens met een derde steriele Pasteurpipet de resterende oplossing en gooi deze weg, waarbij u er zorg voor draagt dat het RNA-pellet niet wordt verstoord. Snijd nu met een vlamgesteriliseerd scalpel de buis door zoals hier getoond en gooi het bovenste gedeelte weg.

Plaats het resterende deel ondersteboven op steriel gaas. Keer de buis om en gebruik een pipet om deze voorzichtig te spoelen met 160 µL guinechloride. Laat het pellet 10 minuten drogen.

Zodra de pellet droog is, wordt deze resuspendeerd in 150 µL tris-EDTA-SDS. Voeg vervolgens 150 µL tris-EDTA en 30 µL 3 M natriumacetaat toe en vortex daarna om het RNA te laten neerslaan. Voeg 900 µL ijskoude, 100% ethanol toe.

Vortex de buis en plaats deze gedurende 30 minuten op smeltend ijs. Centrifugeer de buis vervolgens 30 minuten bij 18,000 G bij vier graden Celsius. Na het centrifugeren kan er een klein wit pellet zichtbaar zijn, of niet.

Aspireer het supernatant voorzichtig, ongeacht of het pellet zichtbaar is of niet, en gooi dit weg. Voeg vervolgens, om overtollig zout te verwijderen, 500 µL 70% ethanol op kamertemperatuur toe en vortex. Centrifugeer de buis 20 minuten lang bij 18.000 G bij vier graden Celsius. Nadat de wasstap met 70% ethanol en de centrifugatie zijn herhaald, gebruikt u een P 200 pipette om alle resterende ethanol te verwijderen.

Laat het pellet 10 minuten aan de lucht drogen. Resuspendeer het pellet in 50 µL DEPC-behandeld water en meng dit krachtig door twee minuten te vortexen. Plaats de monster vervolgens gedurende 15 minuten in een waterbad van 45 °C.

Om het RNA volledig te resuspenderen. Bepaal tot slot de RNA-concentratie via absorptie bij 260 nanometer en analyseer het RNA via gelelektroforese volgens het protocol. In het bijbehorende document werd, om het transcriptoom van netvliesloslating te onderzoeken, de procedure uit het tijdschrift gebruikt om retinaal RNA te winnen en te analyseren van 18 patiënten met netvliesloslating en 18 leeftijd-gematchte controles voorbereid met post-mortem retina's.

RNA werd vervolgens gezuiverd en geanalyseerd middels gelelektroforese en rettino base zoals beschreven in dit rapport; hier worden radargrafieken getoond die de expressie van het monocyten-chemotactische MCP-1-gen CCL2 representeren. Het rechtergedeelte van de figuur, aangeduid met RD, correspondeert met RNA van patiënten met netvliesloslating, terwijl het linkergedeelte, aangeduid met N, het RNA van de controles is, zoals hier te zien is. Netvliesloslating resulteert in de upregulatie van CCL2, zoals wordt aangegeven door de hoge C-waarden in de meeste RD-monsters aan de rechterkant in vergelijking met die van de controles aan de linkerkant.

Deze toename duidt op ontsteking bij de patiënten met netvliesloslating, zoals hier te zien is. De expressie van het transducerende gen GNAT1 voor staafjesfotoreceptoren was verlaagd, in tegenstelling tot CCL2; de waarden zijn laag voor de RD-monsters aan de rechterkant. Ook werd een afname in de expressie van het kortgolfige kegeltjesopsine OPN1SW en het homeogenen CRX waargenomen, wat wijst op degeneratie van zowel staafjes- als kegeltjesfotoreceptoren bij patiënten met netvliesloslating. Deze methode kan inzicht bieden in veranderingen in genexpressie na netvliesloslating. Het kan ook worden toegepast op andere netvliespathologieën in diermodellen, zoals erfelijke netvliesdegeneraties.

Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen moeite hebben omdat er kennis van nucleïnezuren vereist is. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel als ondersteuning, aangezien het proces van RNA na de certificering complex is.