Name: Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Leer hoe u een galvanotaxiskamer gebruikt om de gerichte migratie van prostaatcellen in een elektrisch veld te bestuderen. Deze methode maakt tijdopnamebeeldvorming en kwantitatieve analyse van celgedrag mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De prostaat cellijnen worden vriendelijk door Dr. Ling-Yu Wang en Dr. Hsing-Jien Kung op Cancer Center, UC Davis. Dit project wordt ondersteund door NIH galvanotaxis subsidie ​​4R33AI080604.

1. Het kweken Prostaat Cellen <ol><li> Cultuur de PRN-1-1 en PNT2 prostaatcellen op 100 mm kweekschalen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica Antimycoticum bij 37 ° C met 5% CO2. Vernieuw de kweekmedium elke dag tot de cellen te bereiken 80% samenvloeiing van de galvanotaxis experimenten. </li></ol> 2. Montage galvanotaxis Chambers <ol><li> Assembleren bodem Chambers <ol><li> Veeg een plastic galvanotaxis kamer met 2-propanol. Breng de zeewaardig siliconen afdichting rond de cirkelvormige openingen aan de onderzijde van een kamer met een injectiespuit en bevestig een groot dekglaasje (figuur 1). Gebruik de achterkant van een katoenen applicator naar beneden te duwen het dekglaasje en veeg de overtollige lijm met wattenstaafjes. De cirkelvormige openingen maken het medium en elektrische stroom over de cellen tussen de twee binnenste medium reservoirs. </li><li> Snijd een kleine dekglaasje tot 6 mm x 2 maken5 mm spacers met een diamanten punt marker. </li><li> Flip de kamer. Breng 2 lijnen van silicium lijm met een spuit en / of een metalen spatel tot een 10 mm x 25 mm kanaals oppervlakte celhechting tussen 2 cirkelvormige openingen aan de onderzijde glas creëren. Lijm 2 stukjes glas afstandhouder tussen de 2 ronde openingen. Gebruik de achterkant van de katoen applicators naar beneden te duwen de afstandhouders en veeg de overtollige lijm met wattenstaafjes en / of tandenstokers. </li><li> Droog de kamer gedurende 24 uur totdat het silicium lijm is uitgehard. Week de kamer in gedestilleerd water &#39;s nachts aan het azijnzuur residu van de lijm te verwijderen. Droog de kamer voor onmiddellijk gebruik, of bewaar de kamer voor later gebruik in een schone container. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1: Vergadering van de bodem galvanotaxis kamer. A) Een groot dekglaasje wordt naar de bodem van een schone kamer. B bijgevoegd) Two stukjes glas afstandhouders gelijmd tussen de 2 cirkelvormige openingen 10 mm x 25 mm kanaal cellen hechten creëren. </li></ol></li><li> Zaaien cellen op de galvanotaxis kamers <ol><li> Bereid de eisen aantal galvanotaxis kamers nodig zijn voor het experiment. Elke cellijn of behandeling vereist een enkele galvanotaxis kamer. Veeg de galvanotaxis kamers met 2-propanol. Was de kamers met steriele PBS 3 keer en controleer de vloeistofstroom tussen de 2 ronde openingen in de kamers. </li><li> Sluit de kamers in steriele celcultuurschalen en laten equilibreren bij 37 ° C gedurende 15 min. Maak de prostaatcellen uit hun kweekschaal met 5 ml 0,25% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 min. Neutraliseer de trypsine-EDTA met 5 ml 10% FBS in PBS. </li><li> Breng de cellen tot 15 ml en centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 200 xg, 37 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium. </li><li> Neem 20 μl celoplossing te laden op een telkamer en bereken het aantal cellen. Pas de cel concentratie tot 8 x 10 4 cellen / ml kweekmedium. </li><li> Neem de galvanotaxis kamers uit de 37 ° C incubator. Zaad 350 pi van de celsuspensie op elke kamer. </li><li> Incubeer de cellen in de kamers overnacht in de kweekschaal met natte Kimwipe of in een vochtige kamer in de incubator bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2:. Zaaien cellen de kamer De onderste kamer wordt gedroogd en gereinigd A) prostaat cellen getrypsiniseerd, geteld en overgebracht naar de kamer en overnacht geïncubeerd B) Een top dekglaasje wordt bevestigd aan de kamer verzegelen voor filmen... <ol start="3"><li> Eenssembling de top kamers <ol><li> Monteer de bovenste kamer voorafgaand aan het filmen. De microscoop is alleen geschikt voor de beeldvorming van een enkele galvanotaxis kamer in een keer. Warming-up 10 ml kweekmedium bij 37 ° C voor elke galvanotaxis kamer. Transfer een galvanotaxis kamer van de incubators tot een temperatuur van 37 ° C opwarming plaat. </li><li> Spoel de cellen met kweekmedium om de losse cellen te verwijderen. Verlaat 400 ul van medium in de kamer. Gebruik een spuit te hoog vacuüm vet aan op de top van beide glazen spacers. </li><li> Voeg een kleine dekglaasje aan de kamer af te dichten. Druk licht het dekglaasje met de achterkant van een katoenen applicator. Veeg het overtollige medium met wattenstaafjes. </li><li> Droog het glasoppervlak en de toepassing van hoge vacuüm vet om de kloof tussen het dekglaasje en de kamer af te dichten. Gebruik een metalen spatel om het vet te verspreiden. Voeg 4 ml van het kweekmedium aan de binnenste reservoirs en controleer de vloeistofstroom tussen de reservoirs. </li></ol></li><li> Maak agarbruggen <ol><li> Snijd een paar van 2 cm lang PVC-buis (503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall), spiegelen en plaats ze in een bekerglas van 100 ml. </li><li> Meet 200 mg Bacto-Agar en voeg deze in een kolf van 50 ml met 10 ml kweekmedium tot 2% agar gel maken. Magnetron gedurende 30 sec. Laad de agar-gel om de plastic buis met een transfer pipet. Laat de agar bruggen bij kamertemperatuur gedurende 10 min aan de agar stollen. </li><li> Voeg 2 ml kweekmedium naar de buitenste reservoirs van de galvanotaxis kamer. Plaats de agar bruggen naar de binnenste en buitenste medium reservoirs die het stroom. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 3" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" /> Figuur 3:. Het filmen van de cellen op de kamer Een diagram met de eindassemblage van de galvanotaxis kamer te tonen. De kamer is volledig afgesloten met een hoog vacuüm vet. Medium wordt toegevoegd to vul de reservoirs, en twee agar bruggen worden in de kamer geplaatst. Dan galvanotaxis kamer wordt overgedragen aan de microscoop podium en de elektroden zijn bevestigd aan het elektrisch veld. Zijaanzicht van de samengestelde galvanotaxis kamer wordt getoond tonen dat de elektrische stroom over de cellen door de agar bruggen en de ruimte tussen het afdekglas. 3. Time-lapse Imaging <ol><li> Schakel de klimaatkamer bij 37 ° C met 5% CO2 in de circulerende lucht 2 uur voorafgaand aan beeldvorming. </li><li> Schakel de microscoop en de inleiding van de beeld-verwerven van software. Kalibreren van de microscoop podium en selecteer de 10X objectief. </li><li> Breng de galvanotaxis kamers om de microscoop podium, zet de kamer met tape en focus op de cellen. Plaats de galvanotaxis elektroden met de buitenste reservoirs met kathode aan de rechterkant. Bevestig de draad en de elektroden met tape. </li><li> Schakel de stroom box een elektrisch veld naar de kamer. Meet de uitgangsspanning met de voltmeter over de kamer tot 2,5 volt voor de 25 mm lange kamer (100 mV / mm) te bereiken. Handhaaf de veldsterkte tijdens het experiment door aanpassing van de uitgangsstroom. </li><li> Selecteer 10 punten in de hele kamer te filmen in de software om tien time-lapse filmpjes te genereren. Het opzetten van de overname omstandigheden op 10-min intervallen gedurende 2 uur. </li><li> Beginnen filmen en pas de uitgangsstroom als dat nodig is. </li><li> Aan het einde van het experiment, verwijdert de ruimte van het toneel en zet de cellen met 95% alcohol. Open te breken de kamer met een scheermesje te reinigen en opnieuw te gebruiken. </li></ol> 4. Kwantificering van galvanotaxis <ol><li> Draai de time-lapse filmpjes en heroriënteren van de kathode naar de top van de beelden. De films te exporteren naar de cel tracking software. </li><li> Handmatig volgen de (x, y) positie van 10-20 cellen bij elk tijdpunt van elke film (Figuur 4 A, B).De migratie afstanden en de hoeken ten opzichte van de noord-zuid richting, dezelfde oriëntatie van het elektrisch veld, zal worden berekend in de cel tracking software (Figuur 4C). OPMERKING: De gemiddelde migratie snelheid wordt omgezet van de totale migratie afstand en de totale filmen tijd. De richtingsgevoeligheid wordt omgezet van de hoeken tot de cosinus waarde. Als migreren met willekeurige directionaliteit, zal de gemiddelde netto cosinus nagenoeg nul. Als de cellen migreren recht naar de kathode, de cosinus waarde +1. Als de cellen migreren recht naar de anode, zal de cosinuswaarde -1 zijn. </li></ol><img alt="Figuur 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" /> Figuur 4: Cell volgen om gerichtheid meten A) Overlay van de tracking lijnen met mobiele beelden.. De (x, y) posities van de cellen manually bijgehouden in de time-lapse filmpjes. . Wanneer de cellen migreren willekeurig, de gemiddelde cosinus dichtbij nul B) Indien de cellen migreren naar de kathode of de anode, de waarde van de gemiddelde cosinus vlakbij + (kathode) of -. (Anode) 1,0 C ) De gerichtheid wordt door de cosinus waarde, die wordt omgezet van de migratie hoeken (θ). De cosinus (θ) gelijk aan de verhouding van de afstand a (de migratieafstand) om afstand b (de afstand verwachting de richting van het elektrisch veld). <ol start="3"><li> Sla de metingen. De gegevens te importeren naar een database-applicatie om de gecombineerde resultaten te berekenen. </li><li> De gecombineerde gegevens van de gemiddelde migratie snelheid en gemiddelde cosinuswaarde exporteren naar een spreadsheet voor de grafieken (Figuur 5) plotten. </li></ol>

<ol><li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+currents+might+guide+rostral+migration+of+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric currents might guide rostral migration of neuroblasts.</a> EMBO Rep. 14 (2), 184-190 (2013).</li>
<li>Hotary, K. B., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electrical+currents+and+voltage+gradients+in+Xenopus+embryos+and+the+consequences+of+their+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endogenous electrical currents and voltage gradients in Xenopus embryos and the consequences of their disruption.</a> Dev Biol. 166 (2), 789-800 (1994).</li>
<li>Hotary, K. B., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+role+for+endogenous+electrical+fields+in+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence of a role for endogenous electrical fields in chick embryo development.</a> Development. 114 (4), 985-996 (1992).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+axon+guidance+in+embryonic+retina%3A+galvanotropism+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Electric axon guidance in embryonic retina: galvanotropism revisited.</a> Biochem Biophys Res Commun. 431 (2), 280-283 (2013).</li>
<li>Wood, M. D., Willits, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applied+electric+field+enhances+DRG+neurite+growth%3A+influence+of+stimulation+media%2C+surface+coating+and+growth+supplements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Applied electric field enhances DRG neurite growth: influence of stimulation media, surface coating and growth supplements.</a> J Neural Eng. 6 (4), 046003(2009).</li>
<li>Kucerova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+electrical+signals+in+murine+corneal+wound+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of electrical signals in murine corneal wound re-epithelialization.</a> J Cell Physiol. 226 (6), 1544-1553 (2011).</li>
<li>Sillman, A. L., Quang, D. M., Farboud, B., Fang, K. S., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Dermal+fibroblasts+do+not+exhibit+directional+migration+on+collagen+I+in+direct-current+electric+fields+of+physiological+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human Dermal fibroblasts do not exhibit directional migration on collagen I in direct-current electric fields of physiological strength.</a> Exp Dermatol. 12 (4), 396-402 (2003).</li>
<li>Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+cellular+membrane+components+creates+the+directional+cue+guiding+keratocyte+galvanotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of cellular membrane components creates the directional cue guiding keratocyte galvanotaxis.</a> Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).</li>
<li>Nishimura, K. Y., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+migrate+to+the+negative+pole+in+direct+current+electric+fields+comparable+to+those+measured+in+mammalian+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes migrate to the negative pole in direct current electric fields comparable to those measured in mammalian wounds.</a> J Cell Sci. 109 (1), 199-207 (1996).</li>
<li>Farboud, B., Nuccitelli, R., Schwab, I. R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC+electric+fields+induce+rapid+directional+migration+in+cultured+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">DC electric fields induce rapid directional migration in cultured human corneal epithelial cells.</a> Exp Eye Res. 70 (5), 667-673 (2000).</li>
<li>Fang, K. S., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J Cell Sci. 112 (12), 1967-1978 (1999).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+T+lymphocytes+migrate+toward+the+cathode+of+DC+electric+fields+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices.</a> Lab Chip. 11 (7), 1298-1304 (2011).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J., Gage, F. H., Zhao, M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).</li>
<li>Wu, D., Ma, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC+Electric+Fields+Direct+Breast+Cancer+Cell+Migration%2C+Induce+EGFR+Polarization%2C+and+Increase+the+Intracellular+Level+of+Calcium+Ions.+%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">DC Electric Fields Direct Breast Cancer Cell Migration, Induce EGFR Polarization, and Increase the Intracellular Level of Calcium Ions. </a> Cell Biochem Biophys. 67 (3), 1115-1125 (2013).</li>
<li>Martin-Granados, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PP1%2FNIPP1+in+steering+migration+of+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A role for PP1/NIPP1 in steering migration of human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), 40769(2012).</li>
<li>Yang, H. Y., Charles, R. P., Hummler, E., Baines, D. L., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+sodium+channel+mediates+the+directionality+of+galvanotaxis+in+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The epithelial sodium channel mediates the directionality of galvanotaxis in human keratinocytes.</a> J Cell Sci. 126 (9), 1942-1951 (2013).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).</li>
<li>Shanley, L. J., Walczysko, P., Bain, M., MacEwan, D. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influx+of+extracellular+Ca2%2B+is+necessary+for+electrotaxis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Influx of extracellular Ca2+ is necessary for electrotaxis in Dictyostelium.</a> J Cell Sci. 119 (22), 4741-4748 (2006).</li>
<li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+of+corneal+epithelial+sheets+in+physiological+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Directed migration of corneal epithelial sheets in physiological electric fields.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (13), 2548-2558 (1996).</li>
<li>Peng, H. B., Jaffe, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+fucoid+eggs+by+steady+electrical+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarization of fucoid eggs by steady electrical fields.</a> Dev Biol. 53 (2), 277-284 (1976).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+prostatic+epithelial-cells+immortalized+by+polybrene-induced+DNA+transfection+with+a+plasmid+containing+an+origin-defective+sv40-genome%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human prostatic epithelial-cells immortalized by polybrene-induced DNA transfection with a plasmid containing an origin-defective sv40-genome.</a> Int J Oncol. 4 (4), 821-830 (1994).</li>
<li>Berthon, P., Cussenot, O., Hopwood, L., Leduc, A., Maitland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+sv40+in+normal+human+prostatic+epithelial+and+fibroblastic+cells+-+differentiation+pattern+of+non-tumorigenic+cell-lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Functional expression of sv40 in normal human prostatic epithelial and fibroblastic cells - differentiation pattern of non-tumorigenic cell-lines.</a> Int J Oncol. 6 (2), 333-343 (1995).</li>
<li>Aurich-Costa, J., Vannier, A., Grégoire, E., Nowak, F., Cherif, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPM-FISH%2C+a+new+M-FISH+approach+using+IRS-PCR+painting+probes%3A+application+to+the+analysis+of+seven+human+prostate+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">IPM-FISH, a new M-FISH approach using IRS-PCR painting probes: application to the analysis of seven human prostate cell lines.</a> Genes Chromosomes Cancer. 30 (2), 143-160 (2001).</li>
<li>Tyson, D. R., Inokuchi, J., Tsunoda, T., Lau, A., Ornstein, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+requirements+of+prostatic+epithelial+cell+lines+for+acinar+morphogenesis+and+lumen+formation+in+vitro%3A+role+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Culture requirements of prostatic epithelial cell lines for acinar morphogenesis and lumen formation in vitro: role of extracellular calcium.</a> Prostate. 67 (15), 1601-1613 (2007).</li>
<li>Lang, S. H., Sharrard, R. M., Stark, M., Villette, J. M., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+epithelial+cell+lines+form+spheroids+with+evidence+of+glandular+differentiation+in+three-dimensional+Matrigel+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional Matrigel cultures.</a> Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+galvanotaxis+assay+for+analysis+of+neural+precursor+cell+migration+kinetics+in+an+externally+applied+direct+current+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-controlled+directed+migration+of+neural+progenitor+cells+in+2D+and+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2D and 3D environments.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Pullar, C. E., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+mediates+keratinocyte+directional+migration+in+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP mediates keratinocyte directional migration in an electric field.</a> J Cell Sci. 118 (9), 2023-2034 (2005).</li>
<li>Sheridan, D. M., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imposition+of+a+physiologic+DC+electric+field+alters+the+migratory+response+of+human+keratinocytes+on+extracellular+matrix+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Imposition of a physiologic DC electric field alters the migratory response of human keratinocytes on extracellular matrix molecules.</a> J Invest Dermatol. 106 (4), 642-646 (1996).</li>
<li>Feng, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+migration+of+neural+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+by+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Guided migration of neural stem cells derived from human embryonic stem cells by an electric field.</a> Stem Cells. 30 (2), 349-355 (2012).</li>
<li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li>
<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De analyse van galvanotaxis reactie van een cel is een belangrijke functionele indicator voor vele cellulaire trekkende of groeiprocessen 27, 28. Hier gebruiken we een op maat gemaakte kamer met glazen oppervlak tot twee prostaat cellijnen te filmen. Deze cellijnen toonden verschillende graden van galvanotaxis en we speculeren dat de intracellulaire lokalisatie of de activering van de galvanotaxis bemiddelende eiwitten gedurende het proces van het genereren van de onsterfelijke cellijnen, waardoor het waargen...

Endogene elektrische velden worden gedetecteerd in verschillende weefsels, zoals huid 1, 32, 33 en hersenen 2. De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, waaronder aansturen embryo ontwikkeling 3, 4, geleiden de uitgroei van neuronale uitlopers 5, 6 en bevorderen epitheel en corneale wonden 1, 7. In vitro toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen bootst de fysiologische elektrisch veld en induceert celmigratie directionele of galvanotaxis. Galvanotaxis is onderzocht in fibroblasten 8, vissen keratinocyten 9, menselijk epitheel en hoornvlies keratinocyten 10-12, lymfocyten 13 neuroblasts 2 en neuronale progenitorcellen 14. Bij blootstelling aan het aangelegde veld, de meeste onderzochte cellen migreren directioneel naar de kathodische (-) pool. Maar verschillende kankercellen, waaronder zeer metastatischehumane borstkankercellen en de humane prostaatkanker cellijn PC-3M, naar de anodische (+) pool 15, 16. verschillende mechanismen voorgesteld galvanotaxis bemiddelen of het vermogen van de cellen om het elektrisch veld detecteren, inclusief activatie verklaren van EGF receptoren 12, de epitheliale natriumkanaal 17 PI3K en PTEN 18 en vrijgave van calciumionen 15, 19. Het mechanisme is nog niet volledig begrepen en het is mogelijk dat meerdere signaalroutes betrokken bij galvanotaxis. De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren nuttig is de gerichte migratie van hechtende, beweeglijke cellen te karakteriseren, op individuele celmigratie 10, 12, 17 of migratie van een vel van confluente cellen 18, 20. Deze techniek is aangepast van toezicht Peng en Jaffe 21, en ​​Nishimura et al. 10 met op maat gemaakte, heldere PVC kamers, met afneembare coverslips zorgen voor gemakkelijke cel ophalen na galvanotaxis voor secundaire analyse, zoals immuno-fluorescentie beeldvorming. Het glasoppervlak van de galvanotaxis kamers is optisch-compatibel, die het filmen bij een hoge vergrotingsfactor en met fluorescent-gelabelde cellen mogelijk maakt. Ook kan proefopzet met modificatie van het glasoppervlak, zoals het veranderen van de oppervlaktelaag of kosten. Afstandhouders van No. 1 dekglaasje worden in de kamers om de stroom over de cellen te minimaliseren; daarom jouleverwarming, dat evenredig is met het kwadraat van de stroom, zou de cellen oververhitten tijdens het experiment. De verbindende agar bruggen voorkomen direct contact van de elektroden met de cellen en verandering van het medium pH of de ionenconcentratie in galvanotaxis voorkomen. Twee niet-tumorigene humane prostaat cellijnen onderzocht op hun galvanotaxis reactie in deze studie. De PRN-1-1 22 en PNT2 23 zijn beide SV40-geïmmortaliseerde, growth factor-afhankelijke cellijnen die de epitheliale merkers cytokeratine 5, 8, 18 en 19 met weinig of geen expressie van het prostaat-specifiek antigeen (PSA). Beide cellijnen houden de veelhoekige morfologie van normale epitheelcellen, maar chromosomale abnormaliteit werd waargenomen bij karyotypering 22, 24. Hoewel PRN-1-1 en PNT2 hebben dezelfde gedrag bij de meeste experimenten, ze vertonen verschillen in de vorming van acinaire structuur en galvanotaxis. Bij een 3-D matrix Matrigel, de PRN-1-1 cellen vormen holle acinaire structuren lumen lijken de normale prostaat weefsel 25. De PNT2 cellen vormen vaste bolletjes zonder lumen of gepolariseerde epitheel 26. De PRN-1-1 cellen ook een hogere galvanotactic respons dan de PNT2 in de huidige studie tonen. De correlatie tussen de vorming van acinar structuur en galvanotaxis in PRNS-1-1 suggereert dat de galvanotactic signalen een rol kunnen spelen bij het organiseren van de prostate klier bewegingen weefsel in reactie op endogene elektrische velden, en verschaft verder kenmerken onderscheid tussen deze 2 cellijnen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cellen</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 prostaatcellen</td><td></td><td></td><td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>PNT2 prostaatcellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">Medium en oplossingen</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>opwarmen tot 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% in PBS, opwarmen tot 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>voeg 5 ml toe aan 500 ml medium</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td>-</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 en 1.5 mM KH2PO4 in 1.000 ml H2O, pH tot 7.4 en autoclaved, opwarmen tot 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>opwarmen tot 37 &deg;C voor gebruik, behandel cellen gedurende 3-5 min op 37 &deg;C</td></tr><tr><td colspan="4">Galvanotaxie apparaat</td></tr><tr><td>Galvanotaxie kamers</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>Op maat gemaakte (1/4" x 2" x 3.5"), niet-giftige, doorzichtige PVC kamers. Neem contact op met de auteurs voor de ontwerpspecificaties.</td></tr><tr><td>Galvanotaxie elektroden</td><td>UCD electric shop</td><td></td><td>platina gewikkelde elektroden met flexibele snoeren</td></tr><tr><td>Galvanotaxie voedingsbox</td><td>Substrate Engineering, CA</td><td></td><td>op maat gemaakte DC-voedingsuitgang met voltmeter</td></tr><tr><td>Microscoop Dekglas, Groot, 45 x 50 mm, Nr. 1.5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop Dekglas, klein, 25 x 25 mm, Nr. 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>Diamantpuntmarker</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Marine grade siliconen afdichtmiddel, helder</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>Hoge vacuümvet</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>6 ml spuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Nichiryo Spuit, 1.5 ml</td><td>Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafjes</td><td>Purtian Medical Products</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>Johnson &amp; Johnson</td><td>729389</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 180 PVC slangen&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Muur</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>maak 2% agaroplossing</td></tr><tr><td>Veiligheidsmes</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur en Software</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>bediend met een A-4-62 rotor</td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer telkamers</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>laad 20 &#956;l celoplossingen om te tellen</td></tr><tr><td>Cultuurtemperatuur opwarmplaat</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>om de galvanotaxie kamers op 37 &deg;C te houden&nbsp;</td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000 microscoop met gemotoriseerde tafel en omgevingskamer</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30 objectief</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX CCD camera&nbsp;</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Gekoelde CCD camera, monochroom, 12-bits</td></tr><tr><td>Perslucht met 5% CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td>speciale bestelling</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software voor het verzamelen van beelden</td></tr><tr><td>Improvision OpenLab 5.5.2</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Cell tracking software en aangepast om migratiehoeken te meten</td></tr><tr><td>FileMaker Pro Advanced, 8.0</td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 voor Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis chambers naar study directional migratie van prostaat cellen

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, zoals het leiding celmigratie in embryonale ontwikkeling, neuronale uitgroei en epitheliale wondgenezing. Het toepassen van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen in vitro induceert directionele celmigratie of galvanotaxis. De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren gemodificeerd met op maat gemaakte poly (vinylchloride) (PVC) Chambers, glas, platina elektroden en het gebruik van een gemotoriseerde podium waarop de cellen worden afgebeeld. De PVC-kamers en platina elektroden vertonen een lage cytotoxiciteit en zijn betaalbaar en herbruikbaar. Het glasoppervlak en het gemotoriseerde microscooptafel verbeteren beeldkwaliteit en laat mogelijke wijzigingen op het glasoppervlak en behandelingen aan de cellen. We filmden de galvanotaxis van twee niet-tumorigene, SV40 vereeuwigd prostaat cellijnen, PRN-1-1 en PNT2. Deze twee cellijnen vertonen gelijkaardige migratie snelheden en beide migreren naarde kathode, maar ze vertonen een verschillende mate van gerichtheid in galvanotaxis. De verkregen via dit protocol resultaten suggereren dat de PRN-1-1 en de PNT2 cellijnen verschillende intrinsieke eigenschappen die hun directionele trekkende reacties regeren kan hebben.

Twee lijnen van prostaatcellen (PRN-1-1 en PNT2) werden onderzocht met deze methode. Cellen in beide lijnen migreren vergelijkbare snelheden van 1,0 +/- 0,3 micron / min in de loop van 2 uur (Figuur 5A). Echter, de gerichtheid op het elektrische veld is 0,7 +/- 0,3 voor de PRN-1-1 lijn, en 0,2 +/- 0,8 voor de PNT2 lijn (Figuur 5B). De resultaten tonen een significant verschil in de galvanotaxis van deze twee cellijnen (p &lt;0,01, 100 cellen werden gevolgd), wat suggereert dat ze versch...

We presenteren een methode om een fysiologisch elektrisch veld toe te passen op migrerende, geïmmortaliseerde prostaatcellen in een op maat gemaakte galvanotaxiekamer. Met behulp van deze methode, tonen we aan dat 2 lijnen van niet-tumorigene prostaatcellen verschillende graden van migratiedirectionaliteit in het veld vertonen.

Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

Het algemene doel van deze procedure is om Galvan Axxis uit te voeren, een test om de directionele migratie van cellen in een toegepast elektrisch veld te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst een Galvan axxis-kamer te assembleren en vervolgens te zaaien met de cellen van belang. In de tweede stap wordt de kamer afgesloten en wordt er een elektrisch veld aangelegd voor time-lapse beeldvorming.In de laatste stap wordt de migratiesnelheid van individuele cellen en de hoek ten opzichte van het elektrische veld gevolgd. Uiteindelijk cosign. De kan worden gebruikt om te laten zien hoe de cellen reageren op het elektrische veld en of ze directioneel naar de kathode migreren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek zijn de eenvoudige celretrieval na gegeven Texas voor secundaire analyse en de gemak waarmee de migratie bij hoge vergroting kan worden gefilmd en met fluorescerend gelabelde cellen. Visualisatie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het assembleren van een kamer moeilijk te leren zijn zonder demonstratie Om de bodemkamers te assembleren. Begin met het afvegen van een plastic galvan axxis-kamer met twee propanol.Gebruik vervolgens een spuit om marine grade s

utilizing-custom-designed-galvanotaxis-chambers-to-study-directional

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Time lapse beeldvorming van 3D-weefselkweek maakt het bestuderen van trekgedrag van de individuele cellen die afkomstig zijn van ganglion eminentie in reactie op gefractioneerde eiwitten halen uit cerebrale cortex.

Trekkende gedrag van cellen gegenereerd in ganglion Eminence culturen

Een benadering om de migratie van cellen geëxplanteerde (trunk neurale cellen) analyseren beschreven. Deze methode is goedkoop, zacht en kunnen onderscheiden chemotaxis van zowel chemokinesis en andere invloeden op trekkende polariteit zoals die afgeleid van cel-cel interacties in de primaire neurale stam celkweek.

Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

Dit protocol laat zien methoden die worden gebruikt om 2D-en 3D-omgevingen tot stand in de speciaal ontworpen electrotactic kabinet, kan volgen...

Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

De ECIS / Taxi-systeem is een geautomatiseerde, real-time test die cellulaire chemotaxis meet. In deze assay cellen bewegen onder een laag van agarose om tot een doel elektrode. Cellulaire beweging wordt gemeten door het optreden van resistentie tegen wisselstroom 0.

Meting van Cellulaire Chemotaxis met ECIS / Taxis

In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.

Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Een kwantitatief spontane migratie van cellen te bestuderen in een eendimensionale beperkte micro beschreven. Deze methode maakt gebruik van microfabricated kanalen en kan worden gebruikt om de migratie van grote aantallen cellen te bestuderen onder verschillende omstandigheden in enkele experimenten.

Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen

Celmigratie is een belangrijk onderdeel van de menselijke ontwikkeling en het leven. Om de mechanismen te begrijpen die celmigratie kunnen veranderen, presenteren we een planar gradient diffusiesysteem om chemotaxis in een 3D collageenmatrix te onderzoeken, waardoor men de moderne diffusiekamerbeperkingen van bestaande assays kan overwinnen.

Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

Veel microfluïdische apparaten zijn ontwikkeld voor gebruik in de studie van elektrotaxis. Toch laat geen van deze chips toe om de gelijktijdige chemische en elektrische veldeffecten (EF) op cellen efficiënt te bestuderen. We hebben een apparaat op basis van polymethylmethacrylaat ontwikkeld dat een beter gecontroleerde co-existentie van EF en chemische stimulatie biedt voor gebruik in elektrotaxis onderzoek.

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Dit protocol Gegevens een aanpasbare werkwijze celmigratie als reactie op chemoattractanten die ook kunnen worden gebruikt om de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te bepalen uit een polymeermatrix meten.

Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Leer hoe u een galvanotaxiskamer gebruikt om de gerichte migratie van prostaatcellen in een elektrisch veld te bestuderen. Deze methode maakt tijdopnamebeeldvorming en kwantitatieve analyse van celgedrag mogelijk.

Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen

Meer video's verkennen