Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen
December 7th, 2014
We presenteren een methode om een fysiologisch elektrisch veld toe te passen op migrerende, geïmmortaliseerde prostaatcellen in een op maat gemaakte galvanotaxiekamer. Met behulp van deze methode, tonen we aan dat 2 lijnen van niet-tumorigene prostaatcellen verschillende graden van migratiedirectionaliteit in het veld vertonen.
Het algemene doel van deze procedure is om Galvan Axxis uit te voeren, een test om de directionele migratie van cellen in een toegepast elektrisch veld te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst een Galvan axxis-kamer te assembleren en vervolgens te zaaien met de cellen van belang. In de tweede stap wordt de kamer afgesloten en wordt er een elektrisch veld aangelegd voor time-lapse beeldvorming.
In de laatste stap wordt de migratiesnelheid van individuele cellen en de hoek ten opzichte van het elektrische veld gevolgd. Uiteindelijk cosign. De kan worden gebruikt om te laten zien hoe de cellen reageren op het elektrische veld en of ze directioneel naar de kathode migreren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek zijn de eenvoudige celretrieval na gegeven Texas voor secundaire analyse en de gemak waarmee de migratie bij hoge vergroting kan worden gefilmd en met fluorescerend gelabelde cellen. Visualisatie van deze methode is cruciaal omdat de stappen voor het assembleren van een kamer moeilijk te leren zijn zonder demonstratie Om de bodemkamers te assembleren. Begin met het afvegen van een plastic galvan axxis-kamer met twee propanol.
Gebruik vervolgens een spuit om marine grade siliconen zeelverf aan te brengen rond de cirkelvormige openingen aan de onderkant van de kamer. Plaats een groot dekglas over de sealant en druk het op zijn plaats met het uiteinde van een wattenstaafje, waarbij het overtollige lijm met de wattenstaaf wordt weggeveegd. Gebruik vervolgens een diamantstift om een klein dekglas te snijden om zes bij 25 millimeter ruimtes te maken en draai de kamer om.
Gebruik vervolgens een spuit om twee strepen siliconen aan te brengen, waardoor een kanaaloppervlak van 10 bij 25 millimeter voor celanhechtenis tussen de twee cirkelvormige openingen aan de onderkant van het glas ontstaat. Lijm vervolgens twee glazen ruimtes tussen de cirkelvormige openingen, drukt de ruimtes naar beneden met een nieuw wattenstaafje en veegt het overtollige lijm weg zoals net gedemonstreerd. Probeer de kamer 24 uur lang totdat de siliconenlijm is uitgehard.
De volgende dag laat je de kamer een nacht in gedistilleerd water weken om de azijnzuurrestanten uit de lijm te verwijderen voordat je cellen op de kamer zaait. Droog en veeg de kamers af met twee propanol zoals net gedemonstreerd. Was ze drie keer met steriel PBS en controleer vervolgens de vloeistomstroom tussen de twee cirkelvormige openingen in de kamers.
Nadat is bevestigd dat de kamers in goede werkende staat verkeren, plaats ze in steriele kweekschalen en plaats de kamers gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Terwijl de kamers in evenwicht zijn, los de prostaatcellen los van hun kweekschaal met vijf milliliter trypsine EDTA bij 37 graden Celsius. Neutraliseer na vijf minuten de reactie met vijf milliliter 10%FBS.
In PBS breng je de losgemaakte cellen over in 15 milliliter buisjes en centrifugeer ze vervolgens gedurende vijf minuten. Bij 200 keer G aspireer je het medium en suspendeer je de pellet vervolgens in één milliliter medium. Tel vervolgens de cellen en pas de celconcentratie aan tot acht keer 10 tot de vier cellen per milliliter met kweekmedium en zaai.
350 microliter van de celsuspensie op elke kamer. Incuber de cellen in de kamer 's nachts in een kweekschaal met een nat Kim-doekje bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag begin je met het samenstellen van de bovenste kamers door eerst 10 milliliter kweekmedium op te warmen tot 37 graden Celsius voor elke galvan AXS-kamer.
Terwijl het medium opwarmt, breng je een Galvan axxis-kamer van de incubator naar een opwarmingsplaat van 37 graden Celsius en spoel je de kamer met kweekmedium. Om de niet-bevestigde cellen te verwijderen, laat je 400 microliter medium in de kamer en gebruik je vervolgens een spuit om hoogvacuümvet aan te brengen op beide glazen ruimtes. Sluit de kamer af met een dekglas en een wattenstaafje en droog vervolgens het glazen oppervlak.
Breng vervolgens het hoogvacuümvet met een spuit aan om de opening tussen het dekglas en de kamer af te sluiten. En voeg vervolgens het kweekmedium toe aan de binnenreservoirs. Verwijder luchtbellen en controleer de vloeistomstroom tussen de reservoirs.
Om de agarbruggen te maken, snijd je een paar twee-inch PVC-buizen, draai ze om en plaats de stukken in een 100 milliliter beker. Voeg vervolgens 200 milligram bact toe aan agar in een 50 milliliter kolf met 10 milliliter kweekmedium om een 2% agargel te maken. Na het microgolven gedurende 30 seconden, gebruik je een transferpipet om de agargel in de plastic buis te laden en laat je de agarbruggen 10 minuten op kamertemperatuur staan om de agar te laten stollen.
Voeg vervolgens twee milliliter kweekmedium toe aan de buitenreservoirs van de galkamer en steek de agarbruggen in de binnen- en buitenreservoirs om de stroom door te leiden om time-lapse beeldvorming van de migratie uit te voeren. Begin met het overbrengen van de Galvan-kamer naar een omgevingskamer van 37 graden Celsius op het microscoopplatform, zet de kamer vast met plakband en richt je onder een 10 x objectief op de cellen. Plaats vervolgens de Galvan Axxis-elektroden in de buitenreservoirs met de kathode aan de rechterkant en zet de draad en de elektroden vast met plakband.
Schakel vervolgens de stroombron in om een elektrisch veld aan de kamer toe te passen en gebruik een voltmeter om de uitgangsspanning over de kamer te meten om 2,5 volt te bereiken voor de 25 millimeter lange kamer. Selecteer nu 10 punten over de kamer voor het genereren van 10 time-lapse films en stel de verwervingscondities in op intervallen van 10 minuten gedurende twee uur. Begin vervolgens met filmen en pas de uitgangsstroom aan zoals nodig is om de veldsterkte tijdens het experiment te handhaven.
Aan het einde van het experiment verwijder je de kamer van het platform en fixeer je de cellen in 95% alcohol. Open vervolgens de kamer. Het dekglas kan later worden bewaard.
Kleuren en beeldvorming. Reinig de kamer voor de komende jaren. Om de
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het toepassen van een fysiologisch elektrisch veld op migreerende, geïmmortaliseerde prostaatcellen met behulp van een op maat gemaakte galvanotaxiekamer. De resultaten geven aan dat twee lijnen van niet-tumorige prostaatcellen verschillende graden van migratiedirectionaliteit vertonen in reactie op het elektrische veld.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celmigratie
- Elektrofysiologie
- Prostaatkankeronderzoek
Achtergrond
- Galvanotaxis is de gerichte beweging van cellen in reactie op een elektrisch veld.
- Deze methode kan helpen bij het begrijpen van cellulair gedrag in kankeronderzoek.
- Geïmmortaliseerde prostaatcellen dienen als een model voor het bestuderen van niet-tumorige celgedrag.
- Verschillende cellijnen kunnen verschillend reageren op elektrische velden.
Doel van het onderzoek
- Om de directionele migratie van prostaatcellen in een elektrisch veld te beoordelen.
- Om het migratiegedrag van verschillende niet-tumorige prostaatcellijnen te vergelijken.
- Om een betrouwbare methode te vestigen voor het bestuderen van galvanotaxis in vitro.
Gebruikte methoden
- Samenstelling van een op maat gemaakte galvanotaxiekamer.
- Zaaien van de kamer met geïmmortaliseerde prostaatcellen.
- Toepassing van een elektrisch veld tijdens time-lapse beeldvorming.
- Volgen van individuele celmigratiesnelheid en richting ten opzichte van het elektrische veld.
Belangrijkste resultaten
- Twee lijnen van niet-tumorige prostaatcellen vertoonden verschillende graden van directionele migratie.
- Cellen migreerden naar de kathode, wat een reactie op het elektrische veld aangeeft.
- Kwantitatieve analyse van migratiesnelheid en hoeken werd uitgevoerd.
- De methode biedt inzichten in het gedrag van prostaatcellen onder elektrische velden.
Conclusies
- De galvanotaxiekamer is een effectief hulpmiddel voor het bestuderen van celmigratie.
- Verschillende prostaatcellijnen vertonen verschillende migratiepatronen in reactie op elektrische velden.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrijpen van de rol van elektrische velden in cellulair gedrag.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of prostate cell migration phenotypes by quantifying directional responses to physiological electric fields, supporting target validation in early discovery. The custom galvanotaxis chamber provides a reproducible, disease-relevant system for assessing intrinsic migratory behavior, which can inform lead identification strategies by highlighting functional differences between cell models. Such electrophysiological profiling adds predictive confidence to preclinical models by linking cellular signaling mechanisms to functional outputs under controlled stimuli.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing differential intrinsic features governing directional migratory responses between prostate cell lines.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative measurement of migration speed and angle relative to cathode-directed galvanotaxis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell line-specific signaling mechanisms that modulate electrotaxis, informing target confidence assessments.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems using low-cytotoxicity, reusable PVC chambers and platinum electrodes for standardized electrotaxis screening.
- Quantitative Outputs: Generates migration speed and directional persistence metrics via time-lapse imaging and cell tracking software, enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Facilitates platform reuse through agar bridge-mediated current conduction and motorized stage imaging, supporting assay standardization across runs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses SV40-immortalized prostate cell lines (pRNS-1-1 and PNT2) as a disease-relevant system to model non-tumorigenic cell behavior under electrophysiological cues.
- Translational Continuity: Links discovery-stage galvanotaxis measurements to preclinical risk-adjusted advancement by revealing differential electrotaxis that may reflect underlying pathway activity.
- Mechanistic De-risking: Highlights how cellular signaling mechanisms direct differential migration responses to electric fields, reducing ambiguity in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The galvanotaxis assay integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, providing electrophysiological readouts that complement biochemical and imaging-based screening cascades.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how prostate cell lines directionally migrate in applied electric fields, clarifying pathway-dependent migratory phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chamber assembly, sterile equilibration, and time-lapse imaging under controlled field strength (2.5 V across 25 mm chamber).
- Analytics: Enables comparative analysis via exported time-lapse movies, manual XY tracking, and calculation of migration angles relative to the electric field north-south orientation.
- Translational Research: Connects galvanotaxis outcomes to preclinical continuity by identifying intrinsic migratory differences that may predict differential responses in complex microenvironments.
- Enterprise Reuse: Positions the chamber as a reusable capability due to affordable, autoclavable components and modular design allowing glass surface modifications and cell treatments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantitative galvanotaxis metrics that reduce mechanistic ambiguity in cell migration studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via sealed chambers, agar bridges, and motorized stage imaging, minimizing variability in electrotaxis measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by revealing cell line-specific electrotaxis profiles that inform capital allocation in early-stage target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through differential directionality measurements (e.g., 0.7±0.3 vs 0.2±0.8) that reflect intrinsic migratory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, microfluidic chamber assembly, and time-lapse microscopy for reliable galvanotaxis execution.
- Dependent on instrumentation including motorized microscope stages, voltage meters, and cell tracking software for quantitative directional analysis.
- Necessitates cross-team standardization of chamber sealing protocols (silicone application, agar bridge preparation) to ensure consistent current conduction.
- Involves adaptation considerations when modifying glass surfaces or testing extracellular matrix coatings on chamber substrates for cell attachment studies.
- Includes practical limitations such as the 24-hour silicone curing time and overnight chamber soaking to remove acetic acid residue before cell seeding.
