Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

Het algemene doel van deze procedure is om de mate te evalueren waarin een molecuul chemotaxis en andere migratiereacties kan veroorzaken in geëxplanteerde neurale crestcellen van de stam. Dit wordt bereikt door eerst neurale buizen op stamniveau, met een lengte van ongeveer acht tot 15 somieten, te isoleren en vervolgens elk van de neurale buizen gedurende een nacht op afzonderlijke met fibronectine beklede dekplaatjes te kweken om neurale crestemigratie mogelijk te maken. Vervolgens wordt een optimale neurale crestcultuur geselecteerd.

De neurale buis wordt uit de cultuur verwijderd en de dekplak bevattende de cultuur wordt op een aangepaste Zigmundkamer gemonteerd zodat de rechtste rand van de cultuur parallel staat aan de vector van de moleculaire gradiënt die over de cultuur zal worden aangebracht. De derde stap is het genereren van een moleculaire gradiënt over de cultuur en vervolgens het filmen van de migratie van de perifere neurale crestcellen langs de eerder geselecteerde recht grens van de cultuur. De laatste stap is het volgen en analyseren van de migratie van de perifere neurale crestcellen die langs de geselecteerde rand van de cultuur zijn gepositioneerd met behulp van Image J-software.

Uiteindelijk kan worden bepaald of het geselecteerde molecuul de richting van de cellen of andere migratiekarakteristieken zoals snelheid kan veranderen door middel van de analyse van de verkregen celtrajectgegevens. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals de Boydenkamer-test, is dat deze tegen zeer lage kosten kan worden toegepast. Deze methode kan worden gebruikt om de migratie van reeds gepolariseerde cellen op de periferie van primaire explantculturen te analyseren met behulp van time-lapse beeldvorming.

Nadat kuikeneieren 56 uur zijn geïncubeerd bij 38 graden Celsius, verwijder de eieren uit de incubator, spuit ze lichtjes met 70% ethanol en laat de eieren vervolgens drogen terwijl de eieren aan het drogen zijn. Vul een steriele plastic petrischaal met Chick-ringeroplossing en steriliseer een glazen bak met UV. Vul een vijf centimeter glazen petrischaal met dis-displays.

Breek nu de eieren open in de UV-gesteriliseerd glazen bak. Haal elk embryo uit zijn dooier door eerst rond de bloedeilandjes van het embryo met gekromde schaar te snijden. Neem vervolgens met stompe pincetten het embryo op door het extra embryonale membraan en plaats het embryo in de voorbereide petrischaal met ringers.

Selecteer vervolgens ongeveer negen embryo's die zich tussen hamburger en Hamilton bevinden. Stadia 15 tot 17. Snijd met een tungsteennaald alle embryonale weefsels anterior aan somiet 10 af en verwijder alle cordale embryonale weefsels vanaf de ongeveer vijf meest recent gevormde somiet. Trim vervolgens de extra embryonale membranen tot ongeveer twee millimeter van het embryo.

Plaats de geïsoleerde embryo-stam in dis-baaien en incubeer ze een uur en 15 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide terwijl de embryo-stammen incuberen. Bereid zes dekplaatjes voor voor het kweken. Eerst door ze in 70% ethanol te spoelen en ze te laten drogen.

Tekend vervolgens met een laboratoriumstift een cirkel in het midden van elk dekplakje dat ongeveer een centimeter in diameter is voor latere identificatie van de fibrine verbindingslaag op dezelfde kant van elk dekplakje. Schrijf een asymmetrisch woord of symbool buiten de getekende cirkel om de identificatie van de boven- en onderkant van het dekplakje te vergemakkelijken. Plaats nu elk dekplakje in een afzonderlijke steriele schotel van 40 bij 10 millimeter met de gelabelde kant naar beneden en laat de schotel 10 minuten onder een bacteriedodende UV-lamp staan.

Breng vervolgens 60 microliter fibronectine aan op het ongemarkeerde oppervlak van het dekplakje binnen de cirkel van een centimeter, en zorg ervoor dat het hele gebied van de cirkel is bedekt. Plaats de schotels in de incubator bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na de incubatieperiode aspireert u voorzichtig de fi nin van elk dekplakje.

Voeg vervolgens 250 microliter kweekmedium toe aan het met fi nin beklede gebied. Het dekplakje en vervolgens incubeer de dekplakjes opnieuw totdat de neurale buizen zijn geïsoleerd. Terwijl de dekplakjes worden geïncubeerd, vult u een glazen petrischaal van vijf centimeter met L 15-medium.

Breng nu alle geïncubeerde embryo-stammen over naar de voorbereide petrischaal. Gebruik een fijne pincet en een scherpe tong en naald om de neurale buis te verwijderen door voorzichtig langs de rand van de neurale buis en de somieten met de naald te snijden. Verwijder de dekplakjes uit de incubator.

Selecteer zes van de langste en rechtste neurale buizen en vervolgens, met behulp van een micropipettip voorbereid met kweekmedium, brengt u een neurale buis over naar elk van de zes dekplakjes. Zorg ervoor dat elke neurale buis zich binnen het met fibronectine beklede gebied van zijn respectieve dekplakje bevindt met behulp van een micropipet en incubeer de hele nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Plaats vervolgens ten minste twee milliliter kweekmedium zonder serum in een steriele 15 milliliter centrifugeerbuis.

Laat de calf lichtjes losgeschroefd terwijl de buis een nacht wordt geïncubeerd bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om de pH van het medium aan te passen. Na overnachtelijke kweek, selecteert u de drie beste neurale crestcelculturen die minstens één lange rechte rand hebben uit de drie culturen. Kies er een voor het laden van de eerste kamer en plaats de andere terug in de incubator voor later gebruik.

Breng vervolgens met onze wattenstaafjes een dunne gelijkmatige laag vaseline aan op de gebieden rond de reservoirs en brug van een aangepaste sigmundkamer. Verwijder vervolgens met een tungsteennaald voorzichtig de neurale buis van het dekplakje dat de geselecteerde neurale crestcelcultuur bevat, waarbij de omringende neurale crestcellen aan de fibronectinelaag worden achtergelaten. Markeer de schotel met een laboratoriumstift om de oriëntatie van de rechtste rand van de neurale crestcelcultuur te onthouden.

Plaats vervolgens een paar druppels van het vooraf geïncubeerde medium op de brug van de aangepaste zigmundkamer. Neem ver