Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

Het algemene doel van deze procedure is om het vermogen van een molecuul om chemotaxis en andere migratie-responsies op te wekken in geëxplante neurale kamcellen van de romp te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst neurale buizen op rompniveau te isoleren met een lengte van ongeveer acht tot 15 somiten, en elke neurale buis gedurende de nacht te kweken op afzonderlijke met fibronectine gecoate dekglasjes om emigratie van de neurale kam mogelijk te maken. Vervolgens wordt een optimale neurale kamcultuur geselecteerd.

De neurale buis wordt uit de kweek verwijderd en het dekglas met de kweek wordt gemonteerd op een aangepaste Zigmund-kamer, zodat de meest rechte rand van de kweek parallel loopt aan de vector van de moleculaire gradiënt die over de kweek zal worden aangelegd. De derde stap is het genereren van een moleculaire gradiënt over de kweek en vervolgens het filmen van de migratie van de perifere neurale kamcellen langs de eerder geselecteerde rechte rand van de kweek. De laatste stap is het volgen en analyseren van de migratie van de perifere neurale kamcellen die langs de geselecteerde rand van de kweek zijn gepositioneerd, met behulp van Image J-software.

Uiteindelijk kan via de analyse van de verkregen celbanengegevens worden vastgesteld of het geselecteerde molecuul de celrichting of andere migratiekenmerken, zoals de snelheid, kan beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals de Boyden-kamerassay, is dat deze zeer kosteneffectief is. Deze methode kan worden gebruikt om de migratie van reeds gepolariseerde cellen aan de periferie van primaire explantaatkweken te analyseren met behulp van time-lapse imaging.

Na het incuberen van kippeneieren gedurende 56 uur bij 38 °C, haalt u de eieren uit de incubator, besproeit u ze licht met 70% ethanol en laat u de eieren vervolgens drogen. Vul een steriele plastic Petrischaal met Chick ringer-oplossing en steriliseer een glazen tray met UV-licht. Vul een glazen Petrischaal van vijf centimeter met dis displays.

Breek nu de eieren open in de UV-gesteriliseerde glazen tray. Haal elk embryo uit de dooier door eerst rond de bloedeilanden van het embryo te knippen met gebogen scharen. Pak vervolgens het embryo bij het extra-embryonale membraan op met stompe pincetten en plaats het embryo in de voorbereide petrischaal met ringers.

Select vervolgens ongeveer negen embryo's die zich tussen de hamburger- en Hamilton-stadia 15 tot 17 bevinden. Snijd met een wolfraamnaald alle embryonale weefsels anterior van somiet 10 af en verwijder alle caudale embryonale weefsels beginnend vanaf ongeveer de vijfde recentst gevormde somiet. Trim daarna de extra-embryonale membranen tot ongeveer twee millimeter vanaf het embryo.

Plaats de geïsoleerde embryonale rompen in dis bays en incubeer deze gedurende één uur en 15 minuten bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Terwijl de embryonale rompen incuberen, bereidt u zes dekglasjes voor voor de kweek. Doe dit eerst door ze te spoelen met 70% ethanol en ze vervolgens te laten drogen.

Teken vervolgens met een laboratoriumstift in het midden van elk dekglas een cirkel van ongeveer één centimeter in diameter, voor de latere identificatie van de fibrin-verbindingslaag op dezelfde zijde van elk dekglas. Schrijf buiten de getekende cirkel een asymmetrisch woord of symbool om de identificatie van de boven- en onderkant van het dekglas te vergemakkelijken. Plaats nu elk dekglas in een aparte steriele schaal van 40 bij 10 millimeter met de gelabelde zijde naar beneden, en laat de schaal 10 minuten openstaan onder een kiemdodende UV-lamp.

Breng vervolgens 60 µL fibronectine aan op het ongemarkeerde oppervlak van het dekglas binnen de cirkel van één centimeter, waarbij u ervoor zorgt dat het gehele oppervlak van de cirkel is bedekt. Plaats de schaaltjes in de incubator bij 37 °C gedurende 30 minuten. Aspireer na de incubatieperiode voorzichtig het fibronectine van elk dekglas.

Voeg vervolgens 250 µL kweekmedium toe aan het met fibronectine gecoate gebied op het dekglas, en incubeer de dekglazen opnieuw totdat de neurale buizen zijn geïsoleerd. Terwijl de dekglazen incuberen, vult u een glazen petrischaal van vijf centimeter met L 15-medium.

Breng nu alle geïncubeerde embryonale rompjes over naar de voorbereide Petrischaal. Gebruik fijne pincetten en een scherp stompe naald om de neurale buis te dissecteren door met de naald voorzichtig langs de grens van de neurale buis en de somiten te snijden. Verwijder de dekglasjes uit de incubator.

Selecteer zes van de langste en rechtste neurale buizen en breng vervolgens, met behulp van een micropipetpunt gevuld met kweekmedium, één neurale buis over naar elk van de zes dekglasjes. Zorg met een micropipet dat elke neurale buis zich binnen het met fibronectine gecoate gebied van het betreffende dekglasje bevindt en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Plaats vervolgens ten minste 2 mL serumvrij kweekmedium in een steriele centrifugebuis van 15 mL.

Laat de dop iets losgeschroefd tijdens het overnacht incuberen van de buis bij 37 °C en 5% koolstofdioxide om de pH van het medium te laten stabiliseren. Selecteer na de overnachtkweek de drie beste neurale kamcelculturen die uit de drie culturen ten minste één lange rechte rand hebben. Kies er één voor het laden van de eerste kamer en plaats de overige culturen terug in de incubator voor later gebruik.

Breng vervolgens met een wattenstaafje een dunne, gelijkmatige laag vaseline aan op de gebieden rond de reservoirs en de brug van één aangepaste Sigmund-kamer. Verwijder daarna met een wolfraamnaald voorzichtig de neurale buis van het dekglas met de geselecteerde neurale kamcelcultuur, waarbij de omliggende neurale kamcellen aan de fibronectinecoating blijven kleven. Markeer de schaal met een laboratoriumstift om de oriëntatie van de rechtste rand van de neurale kamcelcultuur te onthouden.

Plaats vervolgens een paar druppels van het vooraf geïncubeerde medium op de brug van de gemodificeerde Zigmund-kamer. Pak vervolgens het dekglas op met een fijne pincet. Dep de rand van het dekglas tegen een Kim wipe om het grootste deel van het oude cultuurmedium te verwijderen, en plaats het dekglas onmiddellijk op de gemodificeerde Zigmund-kamer, zodanig dat de rechte rand van de neurale kamcel die gefilmd moet worden, gecentreerd is over de lengte van de brug en ongeveer loodrecht staat op de rand van het reservoir van de brug.

Verplaats met behulp van een omgekeerde microscoop de rechte grens van de neurale kamcellen naar de zijde van de brug die het dichtst bij het reservoir ligt. Hiermee wordt het vermoedelijke chemotactische signaal ingesloten en wordt de rechte grens van de neurale kamcellen nauwkeuriger loodrecht op de grens van het brugreservoir uitgelijnd. Druk nu voorzichtig maar stevig het dekglas in de vaseline op de Zigmund-kamer, waarbij u er zeker van bent dat deze volledig op de kamer is afgesloten.

Breng vervolgens extra vaseline aan langs de rand van het dekglas om er zeker van te zijn dat het volledig luchtdicht is. Pas de hoek van de rand van de neurale kamcel opnieuw aan om eventuele verschuivingen tijdens het afsluiten te corrigeren. Laad daarna ongeveer 300 microliters vooraf geïncubeerd medium in een spuit van één milliliter.

Gebruik hiervoor een bevestigde naald van 25 gauge en 1,5 inch. Injecteer het medium in het reservoir dat geen chemo-attractant zal bevatten totdat dit vol is. Wees er zorgvuldig op toe dat er geen luchtbellen in het reservoir ontstaan.

Dicht vervolgens het reservoir aan beide zijden af met een voldoende hoeveelheid vaseline voordat het volgende reservoir wordt geladen. Laad nu een tweede spuit met 300 microliter vooraf geïncubeerd medium dat het gewenste chemotactisch middel bevat. Injecteer het medium vervolgens op dezelfde wijze in het tegenoverliggende reservoir.

Afdicht vervolgens zorgvuldig het reservoir met vaseline. Incubeer de geladen Sigmund-kamer gedurende één uur bij 37 °C voorafgaand aan het filmen. Beeld vervolgens, terwijl er wordt geïncubeerd bij ongeveer 37 °C, gedurende drie uur met intervallen van 92 seconden de rechtste rand van de neurale kamcelcultuur af voor de controles; laad op dezelfde wijze Sigmund-kamers met elk van de twee andere beste neurale kamcelculturen.

Gebruik de geschikte controlebehandelingen voor het vullen van de reservoirs en het primen van de brug. Gebruik de Image J manual tracking-plugin om de migratie van perifere neurale kamcellen langs de rechte rand van de cultuur te volgen. Gebruik de chemotaxis and migration tool-plugin om diverse parameters van de verkregen migratietrajecten te analyseren.

Culturen van neurale kamcellen uit de verlengde romp werden geprepareerd door neurale buizen gedurende een nacht te cultiveren, waarna neurale kamcelculturen met ten minste één lange, rechte rand werden geselecteerd voor experimenten. De langste rechte rand van een geselecteerde cultuur werd vervolgens loodrecht op de rand van het brugreservoir geplaatst en was daarmee parallel aan de vector van de toekomstige gradiënt. Het reservoir dat geen vermoedelijke chemoattractant bevatte, hier aangeduid met een minteken, werd eerst gevuld en afgesloten.

Vervolgens werd het andere reservoir gevuld met de vermoedelijke chemo-attractant, aangeduid met een plusteken, en werden de neurale kamcellen in de periferie langs de eerder geselecteerde grens gefotografeerd en gevolgd met de manual tracking-plugin voor ImageJ. Talrijke migratiekenmerken als reactie op de aangelegde gradiënt kunnen worden beoordeeld op basis van de verkregen trackinggegevens, zoals geïllustreerd in deze grafiek. Zo kan bijvoorbeeld een chemotaxis-index worden afgeleid door de verplaatsing van een cel langs de x-as te delen door de totale afstand die deze is gemigreerd. De attractieve respons van alle gevolgde cellen wordt aangetoond door de hier getoonde plot van de celbanen.

Elk rood spoor is de trajectorie van een cel die migreerde naar het reservoir dat was gevuld met een vermoedelijke chemoattractant. In deze figuur is er een aanzienlijk groter aantal rode sporen in vergelijking met zwarte. In een andere test werd de mogelijkheid van een gemodificeerde sigmund-kamer om een moleculaire gradiënt te handhaven gevalideerd.

Een Alexa Fluor 488 IGM-conjugaat werd toegevoegd aan het linkerreservoir en de fluorescentie-intensiteit over de brug werd op verschillende tijdstippen gemeten. De gradiënt bleef gedurende ten minste 26 uur behouden. Na het bekijken van de video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de eigenschap van een molecuul om chemotaxis en andere migratiegedragingen op te wekken in geëxplanteerde trunk neurale kamcelculturen kunt analyseren met behulp van een gemodificeerde zigmund chamber assay.