Name: Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Leer granulocytfunctie evalueren met beeldgebaseerde flowcytometrie. Deze methode identificeert drie activeringssubsets via fagocytose en oxidatieve burst, wat klinische en voedingsimmunologische inzichten biedt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De huidige studie werd gedeeltelijk gefinancierd door een Research Initiation Grant (RIG) van de University of North Texas aan Dr. McFarlin. De auteurs ontvingen geen directe financiering voor het voltooien van deze studie en melden geen belangenconflict.

OPMERKING: Alle bloedafname procedures in deze methode beschreven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en de UNT Institutional Review Board (IRB) voor gebruik bij mensen goedgekeurd. Alle patiënten gaven toestemming voor bloedafname, die werd gebruikt in de onderhavige werkwijze zodat ze ogenschijnlijk gezond, normaal lichaamsgewicht en ziektevrij. 1. reagens Bron &amp; Voorbereiding <ol><li> Gebruik CD66b-APC (kloon # G10F5; DF = 1: 50) en CD45-APCeFluor780 (kloon # 2D1; DF = 1: 50) voor deze test. OPMERKING: Vóór het onderzoek CD45 en CD66b antilichamen werden getitreerd om de optimale verdunning te bepalen die duidelijk opgelost granulocyten (CD45 + / + 66b) van andere leukocyten (CD45 + / 66b-) 11. Na toevoeging van de verdunde antilichaam voor het kleuren van de uiteindelijke verdunning in de buis was 875. </li><li> Kopen en ontdooien voorraad S. aureus bioparticles gelabeld met pHrodo rode kleurstof. Suspendeer in een concentratie van 1 mg bioparticles per ml in steriel PBS. Aliquot verdunde bioparticles en opslag bevroren bij -20 ° C tot gebruik in de assay. </li><li> Los dihydroethidium (DHE), dat wordt omgezet in fluorescerend ethidium bromide in aanwezigheid van zuurstof vrije radicalen (dwz de oxidatieve burst) in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 10 g / ml. </li><li> Mix N-ethylmaleïmide (van extra fagocytose na de gespecificeerde assay incubatieduur verhinderen) met steriele PBS in een 2 stap verdunning van 200 mg / ml en 17,5 mg / ml. In de test gebruikt een eindconcentratie van 15 mM. Bij ontdooien N-ethylmaleimide, gebruikt een 37 ° C warmteblok, zoals N-ethylmaleimide niet in oplossing blijven. </li><li> Na de laatste fixatie stap, gebruiken 7AAD om nucleair DNA vlek. Voorafgaand aan de toevoeging, verdunnen voorraad 7AAD 01:10 met steriele PBS. </li></ol> 2. Bloedmonster Collection <ol><li> Ja onderwerpen komen het laboratorium na een O / N snel (&gt; 8 uur) en abstentiop van lichamelijke activiteit (&gt; 12 uur). </li><li> Na het reinigen van de huid met een alcohol prep pad, plaatst u een steriele bloedafname naald in een perifere ader in de arm. </li><li> Verzamel bloed in vacuümbuizen die commercieel zijn gevuld met natrium heparine. </li><li> Na het verzamelen, gelden een pleister op de arm van het onderwerp. </li><li> Omkeren bloed buizen tot 10 keer te mengen en vervolgens te plaatsen op een rocker tot analyse. </li></ol> 3. Fagocytose Assay Techniek <ol><li> Ontdooi S.aureus bioparticles (RT), DHE (RT) en N-ethylmaleïmide (37 ° C). </li><li> Voeg 20 L van S. aureus bioparticles tot 4 individuele 1,2 ml buizen tijdens het werken in de steriele kap. </li><li> Voeg 40 L van DHE aan elke buis met het bioparticles. </li><li> Tik de buizen op de bank oppervlak om de reagentia te verzamelen op de bodem van de buis. </li><li> Voeg 100 L van gemengde volbloed aan elke buis die is gevuld met bioparticles en DHE. </li><li>Veeg de binnenkant van de buizen met een wattenstokje om eventuele verontreinigende bloed te verwijderen. </li><li> Meng het bloed en reagentia met een elektronische pipet op het bloed en reagentia meng gedurende drie cycli na toevoeging bloed. </li><li> Plaats test buizen in een ijsemmer en dekken ter bescherming tegen licht. </li><li> Incubeer testbuizen 10, 20 en 40 min. Begin met het 40 min buis zodat alle testbuizen eindigen tegelijk. </li><li> Ontdooi N-ethylmaleimide in 37 ° C bad kraal. </li><li> Pipetteer 15 L N-ethylmaleïmide (beschreven in 1.4) in elke proef buis, incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Pipet 10 L van CD66b-APC en 10 L van CD45-APCeFluor780 verdunde antilichamen (hierboven beschreven in 1.1), incubeer gedurende 60 min. </li><li> Pipet 750 L van WBC fix / RBC Lyse oplossing in elke test buis, incubeer gedurende 60 min. </li><li> Centrifuge (10 min bij 400 xg) testbuizen om de celpellet te verzamelen. </li><li> Vacuüm te zuigen de WBC Lyse / RBC fix oplossing, waardoor er een resterende fluid volume (100 L) boven de cel pellet. </li><li> Pipetteer 10 liter verdunde 7AAD oplossing (beschreven in 1.5) en 50 L PBS in elke testbuis. </li><li> Voeg een druppel kalibratie kralen (~ 25 L) om elke test buis, plaats caps op test buizen, wrap buizen in folie en plaats in de koelkast. </li><li> Laad het monster buis in de image-based stroomcytometer en het verzamelen van een minimum van 3.000 granulocyten gebeurtenissen met behulp van vooraf gedefinieerde parameters: Autosampler, blauw (488 nm; 60 mW), rood (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8.5 mW) lasers (figuur 1). </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Verwerving Methode &amp; Template. Monsters werden verworven op een beeld-gebaseerde stroomcytometer (A). Tijdens de overname werden puntdiagrammen van Bright Field Aspect Ratio versus CD66b-APC gegenereerd om gescheiden granulocyten uit spiked kalibratie kralen using INSPIRE v. 100.2.292.0 software (B). Een minimum van 5.000 granulocyten werden verworven voor elke monsters met behulp van een autosampler, blauw (488 nm; 60 mW), rood (640 nm, 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers. Houd er rekening mee dat een aantal histogrammen aanwezig tijdens overname laser instellingen en andere aspecten van het verzamelen van gegevens te controleren zijn. Al deze histogrammen zijn optioneel en alleen nodig als het laboratorium standaard operationele procedures vereist dat ze als kwaliteitscontrole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> 4. Steekproef Verwerving en Analyse <ol><li> Gebruik het automatische software-compensatie-wizard van de ideeën software op een vergoeding matrix om Raw-afbeeldingsbestanden (RIF) en maak hiermee compenseren belichte bestanden (CIF). </li><li> Laad individuele CIF bestanden in IDEAS software en het genereren van de volgende percelen aan de granulocyten subgroepen te identificeren: </li&gt; <li> Vestigen initiële poorten naar de cellen die met behulp van een histogram voor heldere veldgradient RMS (Figuur 2A) werden geacht in de focus te identificeren. Maak deze bepaling voor elke patiënt monster met behulp van de gestimuleerde controle als referentie standaard. </li><li> Gebruik secundaire percelen te scheiden singlet cellen van puin en wambuizen met een dot plot van helder veld aspect ratio (verhouding van de cel hoogte versus breedte) vs. lichte veld gebied (Figuur 2B). Maak deze bepaling voor elke patiënt monster met behulp van de gestimuleerde controle als referentie standaard. </li><li> Zodra een schone populatie van cellen waren geïdentificeerd, stellen een dot plot van CD45 versus CD66b (figuur 2C) om positief granulocyten identificeren (CD45 + / 66b +). Maak een dochter perceel (figuur 3) van heldere details intensiteit voor S. aureus (x-as) versus lichte detail intensiteit oxidatieve burst (DHE, y-as) subsets van geactiveerde granulocyten identificeren. Verzamel brechts veld beelden in kanaal 1 en 9, bioparticles in Kanaal 2, DHE in Channel 4, 7AAD in Channel 5, CD66b in kanaal 11 en CD45 in het Kanaal 12. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> Figuur 2. Analyse sjabloon. Dit cijfer de serie plots die zijn gegenereerd om cellen die in focus (A) waren identificeren enkelvoudige cellen (B), granulocyten (C). Extra percelen werden gebruikt om de drie subsets van geactiveerde granulocyten vs. inactief granulocyten identificeren. Alle analyse van verworven beeldbestanden werd ingevuld met behulp van IDEEËN v.6 software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<ol><li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li>
<li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li>
<li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis%2C+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li>
<li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Hematol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li>
<li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li>
<li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-year+school-based+diet%2Fexercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children%5BTitle%5D)+AND+%22Matern.+Child+Nutr%22%5BJournal%5D)">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li>
<li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate-intensity%2C+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Physiol.+Nutr.+Metab%22%5BJournal%5D)">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li>
<li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise%3A+implications+for+infection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li>
<li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li>
<li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li>
<li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis%3A+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatology%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold%2FFlu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diet.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huidige werkwijze is een verfijning van bestaande methoden voor de beoordeling van granulocyten functie met behulp van flowcytometrie 1,3,4,12-14. De kritische stappen van deze test vaak gerelateerd goede menging van het bloedmonster met de bioparticles en DHE. Onvolledige menging zal leiden tot onnauwkeurige resultaten. Terwijl volledige menging kritisch moet de mengmethode zachte aard zijn. Voorgesteld wordt mengen worden bereikt met een elektronische pipet met een mengfunctie plaats van een vortex mixer. Een kritische stap bij de bepaling is om altijd zorgen dat er geen bloed besmetting van de bovenste helft van de testbuis. Dit resterende bloed kan worden verwijderd met behulp van een steriel wattenstaafje. Volledige verwijdering is belangrijk, omdat het niet om dit te doen kan de test voorbereiding met-un gelyseerde rode bloedcellen besmetten. Voorafgaand aan het gebruik van deze methode een passende compensatie controles moeten worden toegevoegd om te controleren voor spectral overlap tussen de reagentia gebruikt om de verschillende aspecten van granulocyten functie identificeren. Voor deze methode compensatie controles omvatten verzamelen bloedmonsters die zijn voorgesteld de 40 min incubatie assay en vervolgens labelen met een marker (bijv E. coli, DHE, etc.). Na etikettering, worden enkele positieve gebeurtenissen verzameld en een vergoeding matrix wordt gegenereerd met behulp van een geautomatiseerd tovenaar in de IDEAS analyse software. Het is cruciaal dat als deze test wordt gebruikt, geschikte compensatie controles worden voltooid om goede test prestaties. Analyse wordt uitgevoerd met behulp van de functie finder en co-lokalisatie wizards te identificeren die heldere details intensiteit is de beste variabele aan de bevolking te scheiden en ook bepalen hoe veel overlap bestaat tussen oxidatieve burst en fagocytose signalen. Met name het gebruik van beeldgebaseerde cytometrie ontvangen het vermogen geactiveerde granulocyten scheiden in drie deelverzamelingen. Tzijn opsplitsing deelverzameling werd bepaald met behulp van heldere details intensiteit van fagocytose vs. oxidatieve burst. Naast het onderzoek van deze bijzondere celfuncties, werden cellen die beide gebeurtenissen vertoonden tegelijk in dezelfde anatomische plaats (co-lokalisatie) geïdentificeerd. Granulocyten dat viel in de &quot;high-actief&quot; deelverzameling waren de enige fenotype die consistent zijn co-localisatie tussen fagocytose en oxidatieve burst aangetoond. Deze identificatie van geactiveerde granulocyten subsets is het grootste gebied waar problemen nodig. Het is zeer belangrijk voor een nieuwe gebruiker tijd om het monster procesworkflow in IDEEËN begrijpen en de mechanica van gating de celpopulaties met de beeldvormende component begrijpen. Andere wijzigingen die een gebruiker kunnen proberen te maken onder andere de selectie van alternatieve of aanvullende test incubatietijd. De huidige methode suggereert het gebruik van een duur van 10-40 minuten; echter, afhankelijk van het experimentele model waarbij deze werkwijzete gebruiken, kan het nodig langere looptijden assay selecteren zijn. Een dergelijke wijziging zou moeten worden beoordeeld op individuele basis. Verder werd vastgesteld dat de duur van de test incubatie heeft een significant effect op het uiterlijk van de drie geactiveerde subsets. De in dit rapport beschreven aanpak betekent een uitbreiding van de informatie die voorheen niet konden worden verkregen met betrekking tot granulocyten functie 3,4,13,15. Andere laboratoria hebben het belang van de beoordeling van veranderingen in de granulocyten functie als onderdeel van een uitgebreide beoordeling van de immuniteit en de ziekte van 15-17 aangetoond. Ondanks het potentieel van deze test is niet zonder beperkingen. Een van de belangrijkste beperkingen kosteneffectief en tijd vraag geassocieerd met veel monsters worden verwerkt. Bij een studie ontwerp vereist een groot aantal monsters in een bepaalde dag, kan dit moeilijk te verwerken. Verwerking wordt gestroomlijnd door het gebruik van elektronische pipetten en dispensers,maar deze hebben de neiging duur te zijn en zijn per definitie niet beschikbaar in elk laboratorium. Ons gebied van onderzoek richt zich op een studie van hoe lichaamsbeweging en eetgewoonten beïnvloeden het immuunsysteem gezondheid en functioneren 6,8-10,18-20. Dergelijke doelstellingen hebben belangrijke praktische gevolgen voor verschillende gebieden van de menselijke gezondheid. Voorbij de studie bewegen en nutritionele effecten de fagocytose methode aangetoond in dit manuscript bruikbaar in andere gebieden van klinische immunologie kunnen zijn bij het opmaken van fagocytose functie is kritisch voor behandelingsresultaten. De onderhavige bepalingsmethode is de eerste van vele die immunologische assays met mogelijk opnieuw uitgevonden door middel voordelen van de unieke imaging informatie van een beeldgebaseerde flowcytometer kan worden kan.

Granulocyten vormen een onderdeel van het lichaam het aangeboren immuunsysteem, die de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende antigenen biedt. Vorige methoden voor de beoordeling van granulocyten functie gericht op fagocytosecapaciteit of oxidatieve burst het gebruik van afzonderlijke methoden, waardoor het moeilijk is om gezamenlijk na te gaan hoe granulocyten zijn veranderd 1-4. Vooruitgang op het gebied van flowcytometrie hebben geleid tot de productie van stationaire apparaten voor het hoge-resolutie, multi-color beeldvorming van cellen in een high throughput wijze 5. De mogelijkheid om beeldvorming te combineren met traditionele flowcytometrie vertegenwoordigt een vooruitgang dat de technologische platform nodig om te innoveren binnen bestaande flowcytometrie methoden en pak nieuwe informatie over het immuunsysteem zorgt. In de afgelopen tien jaar heeft ons laboratorium, onder anderen, is scherp gericht op het effect van verschillende voedings- en oefening behandelingen patterns op aangeboren immuunsysteem 6-9. De werkwijze aangetoond in dit manuscript heeft praktische implicaties op het gebied van klinische immunologie. De huidige methode maakt gebruik van de kracht van beeld-gebaseerde flowcytometrie om gelijktijdig meten van fagocytose van bacteriële deeltjes en oxidatieve burst. Met deze aanpak, is men in staat om geactiveerde granulocyten gebruik van variabelen die door de beeld-gebaseerde deel van de analyse te scheiden. Deze subgroepen waren slechts herkenbaar na de beoordeling van de beelden van de cel op het individu granulocyten. Verdere analyse incubatietijd beïnvloed de overgang tussen de drie activatie subsets 10. Aldus is het aannemelijk dat het gebruik van meerdere incubatietijd mag een methode om de verandering in granulocyten functie na een bepaalde experimentele behandeling getest. Het doel van dit manuscript was om een ​​methode voor het beoordelen van granulocyten functie aan te tonen met behulp van image-based flowcytometrie om gelijktijdig meten van fagocytose met oxidative barsten.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers</td><td>BD Life Sciences</td><td></td><td>gebruikt voor bloedopname</td></tr><tr><td>WBC Fixatiemiddel / RBC Lysis oplossing</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>clone G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>clone 2D1</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus bioparticles</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmalemide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematologie Analyzer</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96-kanaals pipet</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubator</td><td>LabArmour</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>Dell Computers</td><td>Various</td><td>Gebruikt voor IDEAS analyse</td></tr></tbody></table>

image-based flowcytometrie techniek om veranderingen in granulocyt functie evalueer in vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocyten spelen een sleutelrol in de aangeboren immuunrespons van het lichaam op bacteriële en virale infecties. Hoewel er methoden bestaan om de functie van granulocyten te meten, zijn deze in het algemeen beperkt in de informatie die ze kunnen verstrekken. De meeste bestaande tests geven bijvoorbeeld slechts een percentage van hoeveel granulocyten geactiveerd zijn na een enkele, vaste incubatietijd. Complicaties ontstaan doordat de meeste tests zich vanwege beperkingen in detectietechnologie op slechts één aspect van de functie richten. Dit rapport demonstreert een techniek voor gelijktijdige meting van fagocytose van bacteriën en oxidatieve burst door granulocyten. Door beide functies tegelijkertijd te meten, werden drie unieke fenotypes van geactiveerde granulocyten geïdentificeerd: 1) Lage activering (minimale fagocytose, geen oxidatieve burst), 2) Matige activering (matige fagocytose, enige oxidatieve burst, maar geen co-lokalisatie van de twee functionele gebeurtenissen) en 3) Hoge activering (hoge fagocytose, hoge oxidatieve burst, co-lokalisatie van fagocytose en oxidatieve burst). Er werd ook een vierde populatie geïdentificeerd die uit inactieve granulocyten bestond. Met behulp van testincubaties van 10, 20 en 40 minuten werd het effect van de duur van de testincubatie op de herverdeling van de fenotypes van geactiveerde granulocyten beoordeeld. Een vierde incubatie werd voltooid op ijs als controle. Door seriële tijdincubaties te gebruiken, kan de test mogelijk detecteren hoe een behandeling de functie van granulocyten ruimtelijk beïnvloedt. Alle monsters werden gemeten met behulp van een op beeld gebaseerde flowcytometer uitgerust met een kwantitatieve beeldvormingsoptie (QI), autosampler en meerdere lasers (488, 642 en 785 nm).

Met behulp van image-based flowcytometrie liet ons toe om een homogene populatie van geactiveerde granulocyten scheiden in drie verschillende activering deelverzamelingen (figuur 3). In deze werkwijze de meest effectieve manier om de drie activatie subsets lossen is door het uitzetten helder detail intensiteit fagocytose (S. aureus) vs. oxidatieve burst (DHE) (Figuur 3; Figuur 4). Ook zal het gebruik van de co-lokalisatie tovenaar in IDEEËN software zorgen voor het kwantificeren van de aanwezigheid van gelijktijdige fagocytose en oxidatieve burst, dat is een kenmerk teken van zeer geactiveerde granulocyten. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> Figuur 3. Identificatie van Activated Granulocyt subsets. Na de identificatie van granulocyten behulp celoppervlak merkers (CD45 + / 66b +), een dochter perceel is gegenereerd met heldere details Intensity voor fagocytose vs. lichte detail intensiteit voor oxidatieve burst. Met deze aanpak, het percentage inactieve (paars), low-actief (rood, A), matige-actief (blauw, B), en high-actief (geel, C) granulocyten werd bepaald. Deze gating techniek werd ook gebruikt om het effect van test incubatietijd op de relatieve abundantie van de verschillende geactiveerde granulocyten subsets evalueren. Het hoogste percentage &quot;hoogactief&quot; granulocyten aanwezig was na 40 min incubatie. Alle analyse van verworven beeldbestanden werd ingevuld met behulp van IDEEËN v.6 software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Naast het aantonen van drie verschillende subsets van geactiveerde granulocyten werd aangetoond dat de test incubatietijd invloed op de relatieve abundantie van iedere geactiveerde granulocyten deelverzameling. Specifiek, de 40 min incubation resulteerde in de grootste percentage &quot;hoogactief&quot; granulocyten. Door ten minste drie assay incuberen tijdsduren het mogelijk is te bepalen hoe een bepaalde klinische behandeling verandert de temporele activeringsstatus van granulocyten. Dit is de eerste gepubliceerde werkwijze met beeldgebaseerde doorstroomcytometrie verschillende geactiveerde granulocyten subgroepen te identificeren als een functie van gelijktijdige metingen van fagocytose en oxidatieve burst. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> Figuur 4. Vertegenwoordiger afbeeldingen van Cellular Markers. Een fotogalerij van cellen geclassificeerd als hoog-actieve (A), matig-actieve (B), en een laag-actieve (C) wordt gepresenteerd in deze figuur. S. aureus bioparticles zijn in CH03 , oxidatieve burst is in CH04, 7AAD voor de kern is in CH05, zijwaartse verstrooiing is in CH06, CD66b is inCH11, en CD45 is in Ch12. Ook is een co-gelokaliseerde merge beeld van fagocytose (CH03) vs. oxidatieve burst (CH04) weergegeven. Gebieden van geel in beeld samenvoegen duiden dat fagocytose en oxidatieve burst zich voordoen in dezelfde anatomische ruimte op hetzelfde moment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Deze methode toont een techniek voor het beoordelen van de functie van granulocyten door gelijktijdig de fagocytose van bacteriën en oxidatieve burst te meten. Beeldgebaseerde flowcytometrie maakte het mogelijk om drie verschillende subsets van geactiveerde granulocyten te identificeren die allemaal verschilden in hun relatieve functionele capaciteit.

Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van granulocyten te beoordelen als een twee-parameters aanpak. Dit wordt bereikt door eerst granulocyten uit patiëntenbloedmonsters te incuberen met biodeeltjes en reagens om de oxidatieve burst te visualiseren. In de tweede stap wordt de fagocytose na incubatie geblokkeerd, en vervolgens worden de celoppervlaktereceptoren van belang gelabeld om de positieve identificatie van de granulocyten mogelijk te maken.Uiteindelijk kunnen de geactiveerde granulocytensubpopulaties worden geïdentificeerd en geïsoleerd door beeldgebaseerde flowcytometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van nutritionele of klinische immunologie, zoals hoe voedingsgewoonten en voedingspraktijken bijdragen aan veranderingen en de functie van granulocyten. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Eric Prado, een doctoraalstudent uit mijn laboratorium.Na het verkrijgen van het perifere bloedmonster, ontdooi de SIU's biodeeltjes en DHE op kamertemperatuur en ethyl malamed in een 37 graden Celsius B-bad, wanneer de reagentia zijn ontdooid, voeg 20 microliter van de ssus biodeeltjes toe aan vier afzonderlijke 1,2 milliliter buisjes in een steriele kap. Voeg vervolgens 40 microliter van het ontdooid DHE toe aan elk buisje dat de biodeeltjes bevat, en tik voorzichtig op de buisjes op de werktafel om het reagens in de bodems van de buisjes te verzamelen. Na het toevoegen van 100 microliter gemengd volbloed aan elk buisje, verwijder eventuele besmettende bloed langs de binnenrand van de buisjes met een wattenstaafje en meng het bloed en de reagentia met een elektronische pipette voor drie cycli.Na de derde cyclus, plaats alle buisjes in een ijsemmer beschermd tegen licht. Bewaar vervolgens de buisjes gedurende 10, 20 of 40 minuten in een 37 graden Celsius snelbad, beginnend met de 40 minuten buis om ervoor te zorgen dat alle incubaties tegelijkertijd eindigen. Aan het einde van de incubatie, doseer 15 microliter ethyl malamed in elk van de buisjes.Na 30 minuten, incubeer de cellen met elk 10 microliter van de juiste antilichamen. Na een uur verder incubeer de cellen in 750 microliter witte bloedcelfixeerde rode bloedcel lice-oplossing. Na nog een uur, centrifugeer de cellen en aspireer het supernatant vacuüm, waardoor een restvolume van 100 microliter boven het celpelletje achterblijft.Voeg nu 10 microliter vers verdunde zeven A a d 50 microliter PBS en 25 microliter kalibratiekralen toe aan elk monster. Sluit vervolgens de buisjes, wikkel ze in folie en bewaar ze bij vier graden Celsius. Wanneer de beeldgebaseerde flowcytometer klaar is, voer elk monsterbuisje uit door minimaal 3000 ULU-sitegebeurtenissen te verzamelen met behulp van voorgedefinieerde parameters om de monsters te analyseren.Gebruik de geautomatiseerde softwarecompensatiewizard van de IDEA-software om een compensatiematrix toe te passen op de ruwe beeldbestanden en om gecompenseerde beeldbestanden te maken. Laad vervolgens de individuele CIF-bestanden in de IDEA-software en genereer de volgende grafieken om de granulocytensubpopulaties voor elk patiëntenmonster te identificeren. Gebruik de onge stimuleerde controle als referentiestandaard om eerst de histogrammen van de lichtveldgradiëntwortelgemiddelde vierkant te gebruiken om de initiële poorten vast te stellen en om de cellen te identificeren die als scherp werden beschouwd.Vervolgens om de enkele cellen te scheiden van het puin en de dubbelen, maak een stipplot van de lichtveld aspectverhouding versus de lichtveldoppervlakte. Zodra een schone populatie cellen is geïdentificeerd, stel een stipplot van CD 45 versus CD 66 B in. Om de CD 45 positieve CD 66 B positieve granulocyten positief te identificeren. Maak tenslotte een stipplot van de heldere detailintensiteit voor de aureus versus de heldere detailintensiteit voor de oxidatieve burst.Om de subsetten van de geactiveerde granulocyten te identificeren die de lichtveldbeelden verzamelen in kanalen één en negen, de biodeeltjes in kanaal drie, de DHE in kanaal vier, de zeven a a d in kanaal vijf, de CD 66 B in kanaal 11 en de CD 45 in kanaal 12, kan ook een tweekleuren overlay worden gegenereerd die gecombineerde DHE- en biodeeltje gebeurtenissen weergeeft. Met beeldgebaseerde flowcytometrie kan een homogene populatie geactiveerde granulocyten worden gescheiden in drie verschillende activeringssubsetten. Met deze methode is de meest effectieve manier om de drie subsetten op te lossen door de heldere detailintensiteit voor de fagocytose tegenover de oxidatieve burst uit te zetten.Verder gebruik van de coloclisatieswizard in de IDEAS-software maakt de kwantificering van de aanwezigheid van de gelijktijdige fagocytose en oxidatieve burst van de granulocyten mogelijk, een kenmerk van hoge activering. Bovendien toonde in dit experiment de 40 minuten incubatieperiode het grootste percentage zeer actieve granulocyten. Het opnemen van minimaal drie incubatieperioden in het protocol vergemakkelijkt dus de bepaling van hoe een bepaalde klinische behandeling de temporele activeringsstatus van de granulocyten kan veranderen.Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden zoals kralen-gebaseerde multiplex-assays worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld, hoe verandert de GRANULOCYTE-chemokineproductie in de supinate na blootstelling aan biodeeltjes?

image-based-flow-cytometry-technique-to-evaluate-changes-granulocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

This video demonstrates a flow cytometry-based technique using two fluorochromes to identify CD4+ and CD8+ T cells, γδ T cells, B cells, natural killer (NK) cells, and monocytes in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Upon incubating the cells with fluorochrome-conjugated antibodies against the surface markers, the cell subsets are identified using an optimal flow cytometric gating strategy.

A Flow Cytometry Assay to Identify Immune Cell Subsets in Peripheral Blood Mononuclear Cells

This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het identificeren van een populatie van enucleating orthochromatische erytroblasten van multispectrale beeldvorming flowcytometrie, die een visualisering van de erytroblast enucleatie proces.

Identificatie van een Muriene erytroblast subpopulatie verrijkt in Enucleating Events door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Monocyten zijn integrale componenten van het menselijke aangeboren immuunsysteem die afhankelijk zijn van glycolytisch metabolisme wanneer geactiveerd. We beschrijven een flowcytometrieprotocol om glucosetransporterexpressie en glucoseopname door totale monocyten en monocytensubpopulaties in vers volbloed te meten.

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Het doel van dit manuscript is om een methode te presenteren voor het meten van fagocytose van monocyten en granulocyten en oxidatieve burstactiviteit in menselijke bloedmonsters.

Het meten van granulocyten en monocyten fagocytose en oxidatieve Burst activiteit in menselijk bloed

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Leer granulocytfunctie evalueren met beeldgebaseerde flowcytometrie. Deze methode identificeert drie activeringssubsets via fagocytose en oxidatieve burst, wat klinische en voedingsimmunologische inzichten biedt.

Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer In Vitro

Meer video's verkennen