Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het menselijke immunologische veld, zoals hoe de communicatie tussen leukocyten plaatsvindt op moleculair en cellulair niveau. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ongezuiverde menselijke T-cellen in een relatief korte periode ex vivo kunnen worden geanalyseerd. Het aantonen van deze procedure zal Henning Kirchgessner zijn, een technicus van ons laboratorium.

Begin met het mengen van een milliliter vers getrokken menselijk perifeer bloed met 30 milliliter ACK lyse buffer in een 50-milliliter conische buis. Vul na acht minuten bij kamertemperatuur de buis met PBS voor een centrifugatiewassing en spoel de pellet opnieuw op in twee milliliters cultuurmedium voor een incubatie van 60 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie vijf keer 10 toe aan de vijfde Staphylococcus aureus enterotoxine B of SEB-geladen of geloste Raji-cellen in 500 microliter kweekmedium in afzonderlijke FACS-buizen, gevolgd door 650 microliter pan-leukocyten.

Spin de co-culturen, en resuspend de pellets in 150 microliters van verse cultuur medium voor een 45-minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Dan, voorzichtig vortex de cellen voor 10 seconden bij 100 rpm, terwijl het toevoegen van 1,5 milliliter van 1,5% paraformaldehyde. Na 10 minuten bij kamertemperatuur, stop de fixatie met een milliliter PBS aangevuld met 1%BSA en verzamel de cellen door centrifugatie.

Resuspend de pellets in 100 microliters van PBS plus BSA en 0,1% saponine, en voeg de cel monsters aan twee individuele putten van een 96-well, U-bodem plaat. Na 15 minuten op kamertemperatuur, centrifugeren de plaat en resuspend de pellets in 50 microliter van PBS plus BSA en saponine met de fluorofofoof-geconjugeerde antilichamen of verbindingen van belang voor een 30-minuten incubatie in het donker bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in 150 microliters van PBS plus BSA en saponine en resuspend de pellets in 60 microliter van PBS.

Als u de cellen wilt weergeven door cytometrie in de stroom stroom, opent u de analysesoftware, controleert u het vloeistofniveau en klikt u op Opstarten in het menu Instrument. Klik vervolgens op Laden en laad de monsters in de poort wanneer daarom wordt gevraagd. Verander onder het tabblad Verlichting de excitatielaserkracht in de juiste nanometerlengtes.

Pas vervolgens de poorten aan voor kanaal vier en 11 en pas het gebied aan voor kanaal één. Als u de aanpassingen van de gating- en laservermogen wilt evalueren, schakelt u het menu Weergave naar de desbetreffende poort en past u de poorten en laserkrachten aan totdat de cellen en celkoppels zichtbaar zijn. Definieer vervolgens op het tabblad Bestandsacquisitie de voorbeeldnaam en het aantal afbeeldingen dat u wilt aanschaffen en de juiste poort voor CD3-kleuring en klik op Acquire om de overname te beginnen.

Als u de verworven celafbeeldingen wilt analyseren, opent u de juiste analysesoftware. Volg de instructies in de vervolgkeuzelijst Compensatie, produceer een compensatiematrix en sla de matrix op als comp datum ctm. Open vervolgens een voorbeeld van een raw-afbeeldingsbestand en pas de comp-datum-ctm toe in het venster om de gecompenseerde afbeeldings- en standaardgegevensanalysebestanden te genereren.

Nadat u de gecompenseerde afbeeldingsbestanden hebt geopend, converteert u de afbeeldingen naar de kleurmodus. Pas de opzoektabellen aan om optimale zichtbare kleuren te verkrijgen op de werkbalk Eigenschappen van afbeeldingsgalerie. Open Maskerbeheer in het menu Analyse en definieer de T-cellen door een masker van 60%Drempelwaarde voor kanaal vijf te selecteren en het masker te vullen om het T-celmasker te maken.

Selecteer vervolgens Valley-masker voor kanaal twee met een breedte van drie pixels om het Valley-masker te maken en combineer de T-cel en valleimaskers om het T-celsynapsmasker te maken. Als u de totale CD3-expressie in T-cellen wilt berekenen, opent u Functiebeheer en maakt u de functie Intensiteit, T-cel en kanaal vijf. Als u de totale hoeveelheid F-actin in de T-cellen wilt berekenen, maakt u de functie Intensiteit, T-cellen, kanaal zes.

Om de CD3-hoeveelheid in immuunsynapsen te evalueren, maakt u de functie Intensiteit, T-celsynaps, kanaal vijf. Om de hoeveelheid F-actine in de immuunsynaps te bepalen, maakt u de functie Intensiteit, T-celsynaps, kanaal zes. Ten slotte, om de F-actine en CD3 verrijking te definiëren, berekent u de verhoudingen van F-actine of CD3 in respectievelijk de immuunsynaps en de totale expressie van het geselecteerde eiwit.

In deze grafieken wordt een overzicht getoond van de kritische gatingstrategie voor het kwantificeren van de eiwitverrijking in de immuunsynaps tussen de draagzuurhoudende cellen, of APC's, en de T-cellen in ongezuiverde pan-leukocyten uit een klein volume menselijk bloedmonster. Hier worden representatieve afbeeldingen getoond van T-cell-APC conjugaten met lage cd3- en F-actine-niveaus in hun immuunsynapsen bij afwezigheid van SEB, terwijl deze T-cel-APC-vervoeging een sterke CD3- en F-actinverrijking in aanwezigheid van SEB aantoont. Bij afwezigheid van superantigen vertoonde 15% van de T-cellen verrijking van zowel CD3 als F-actine bij de immuunsynaps, terwijl een verrijking van 29% wordt waargenomen in aanwezigheid van superantigenen.

Bij afwezigheid van superantigen hoopt minder dan 20% van de totale F-actine in de cellen zich op bij de immuunsynaps, met meer dan 30% waargenomen bij de synaps in aanwezigheid van superantigenen. Met name, CD3 accumuleert bij de immuunsynaps zelfs bij afwezigheid van superantigen, hoewel deze accumulatie ook aanzienlijk wordt verhoogd door de toevoeging van superantigen, waaruit blijkt dat de geschiktheid van deze methode voor het kwantificeren van eiwitaccumulatie bij de T-cel-APC immuunsynaps. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden voltooid in zes tot zeven uur indien goed uitgevoerd.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om alle relevante controles op te nemen, inclusief monsters zonder superantigen, omdat eiwitverrijking ook optreedt als APC's zonder SEB worden gebruikt. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals microscopie met superresolutie worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de fijne structuur van de immuunsynaps te beantwoorden. Na de ontwikkeling, deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van cellulaire communicatie om het immuunsysteem synaps bij de mens te verkennen voor fundamenteel onderzoek, klinische proeven, en translationele wetenschap.

Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe de T-cel-APC connective zone en het immuunsysteem synaps in menselijke T-cellen ex vivo te analyseren. Vergeet niet dat het werken met primaire menselijke materialen gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen of werken onder bioveiligheidsniveau twee voorwaarden altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.