Bone Geconditioneerd Medium: Voorbereiding en Bioassay
8 juli 2015
We beschrijven hier hoe-bone geconditioneerd medium (BCM) voor te bereiden en te testen zijn activiteit in vitro.
Het algemene doel van deze video is om te beschrijven hoe bot-geconditioneerd medium wordt bereid en de activiteit ervan in vitro wordt getest. Dit wordt bereikt door eerst botchips te verzamelen van een varkensmandibel met behulp van een botschraper. De tweede stap is om de botchips te verwarmen of te demineraliseren of niets te doen voordat ze 24 uur in cultuurmedium worden geïncubeerd.
Vervolgens wordt het bot-geconditioneerde medium verzameld dat alle factoren bevat die vrijkomen uit de botchips. De laatste stap is om cellen te stimuleren met het bot-geconditioneerde medium of om een biomateriaal voor te incuberen met het bot-geconditioneerde medium en cellen erop te zaaien na de incubatieperiode. Uiteindelijk wordt kwantitatieve real-time PCR gebruikt om veranderingen in genexpressie van de cellen na behandeling te tonen.
Gebruik van autologe bottransplantaten alleen of in combinatie met andere biomaterialen stimuleert botregeneratie in peri-implant botdefecten en zorgt zo voor goede langetermijnresultaten. Deze video presenteert een in vitro bio-assay, die nuttig is om de genetische respons van massale cellen op de biomoleculen in botconditie te bepalen. Bot-geconditioneerd medium kan helpen antwoord te geven op belangrijke vragen op het gebied van trauma maxillofaciale en tandheelkunde, zoals waarom autoloog bot het doel is van standaardtransplantatie bij botregeneratie.
Het bereiden van conditiemedium van verwerkt bot, zoals thermisch behandeld bot-autograaf of gedemineraliseerd botmatrix, kan moeilijk te standaardiseren zijn. Daarom is het belangrijk om precies te zijn. Om te beginnen verkrijgt u verse varkensmandibulairen van een lokale slager en plaatst u ze op een stevige ondergrond.
Gebruik vervolgens een periosteum om een volledige dikte flap periosteum los te maken, terwijl u speciale aandacht besteedt om geen weke delen aan het bot te laten zitten. Zodra het periosteum is verwijderd, grijpt u stevig de botschraper en gebruikt u lange bewegingen om botchips van de buccale kant van de mandibulaire te verzamelen. Gooi alle botchips weg die kleiner zijn dan een millimeter in lengte.
Voorkom dat de botchips uitdrogen door ze snel te bedekken met cultuurmedium in een 10 centimeter Petri-schaal. Nadat er voldoende botchips zijn verzameld, bereidt u een thermische controlebatch voor door vijf gram van de botchips te pasteuriseren. Pasteuriseer de chips door ze 30 minuten op 80 graden Celsius te verwarmen of steriliseer ze gedurende 20 minuten op 121 graden Celsius.
Bereid vervolgens een gedemineraliseerde controle voor door vijf gram botchips toe te voegen aan een 1 molare oplossing van zoutzuur en ze vier tot zes uur op een shaker te plaatsen bij vier graden Celsius. Was vervolgens de botchips herhaaldelijk met cultuurmedium totdat een neutrale pH is bereikt. Plaats vijf gram verse botchips en vijf gram van elk van de controlebereidingen in afzonderlijke schalen en voeg 10 milliliter vers cultuurmedium toe aan elke schaal.
Vervolgens incubeert u de monsters in een bevochtigde atmosfeer bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur om het volgende dag het geconditioneerde medium te maken. Verwijder het medium uit elke schaal en plaats het in een 15 milliliter kegelbuis. Centrifugeer het bot-geconditioneerde medium gedurende 10 minuten bij 200 keer de zwaartekracht om eventueel afval te verwijderen.
Vervolgens verwijdert u het supernatant en leidt u het door een 0,2 micron steriele filter. Bewaar de Ali quads ingevroren bij min 80 graden Celsius totdat ze nodig zijn. Begin met het zaaien van humane mesenchymale cellen zoals botcellen of gingivale en parodontale ligamentfibroblasten in een 12-walvisplaat met een concentratie van 30.000 cellen per vierkante centimeter. Bedek de cellen met groeimedium en laat de cellen de volgende ochtend de hele nacht aan de plaat hechten.
Gooi het kweekmedium weg en was de cellen met voorverwarmd PBS bij 37 graden Celsius. Stimuleer vervolgens de cellen door voorverwarmd serumvrij kweekmedium toe te voegen met en zonder 20% bot-geconditioneerd medium. Als u ook de absorptiecapaciteit van een biomateriaal test, voegt u het bot-geconditioneerde medium, inclusief eventuele controles, toe aan buisjes met het biomateriaal van belang en incubeer de buisjes gedurende een uur bij 37 graden Celsius.
Spoel vervolgens het biomateriaal krachtig met voorverwarmd PBS en zaai humane mesenchymale cellen met een concentratie van 30.000 cellen per vierkante centimeter op het materiaal. Incubeer de cellen alleen of die op het biomateriaal zijn gezaaid in een bevochtigde atmosfeer bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Gooi vervolgens het kweekmedium weg.
Spoel de cellen met voorverwarmd PBS en extraheer het RNA van de cellen met behulp van een standaard RNA-isolatieprotocol. Zodra het RNA is geïsoleerd, bereidt u cd NA-monsters van elke behandelingsgroep voor door te beginnen met gelijke concentraties van het geëxtraheerde RNA en door een reverse transcriptase-reactie op elk monster uit te voeren. Voer vervolgens kwantitatieve real-time PCR uit op de monsters om naar niveaus van geselecteerde genen te zoeken met behulp van de primers en voorwaarden die in het bijbehorende tekstprotocol zijn vermeld.
Bereken tenslotte de kwaliteit van het bot-geconditioneerde medium op basis van de relatieve genexpressieniveaus door te normaliseren naar cyclische drempelniveaus van de genen naar het housekeeping-gen Gabb dh met behulp van de delta delta CT-methode. Hier zijn enkele typische resultaten die de veranderingen in genexpressie van orale fibroblasten tonen die gedurende 24 uur aan bot-geconditioneerd medium zijn blootgesteld. Twee genen, adrenalin en pent trax, en drie werden beide significant gedeactiveerd tot 40% van de oorspronkelijke niveaus, terwijl interleukinen 11 en 33, samen met N-A-D-P-H oxidase vier en proteoglycaan vier, allemaal tot wel 200 keer zijn opgereguleerd.
Interessant is dat collageenbarrièremembranen die worden gebruikt om de botchips te beschermen tegen het omringende weefsel, veel van het bot-geconditioneerde medium absorberen dat verantwoordelijk is voor de veranderingen in genexpressie. De collageenmembranen zijn er echter niet in geslaagd de factoren die de interleukine 33-expressie controleren te absorberen. Daarom wordt de interleukine 33-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video beschrijft de bereiding van bot-geconditioneerd medium (BCM) en het testen ervan in vitro. Het proces omvat het verzamelen van botchips, het behandelen ervan en het incuberen in kweekmedium om het BCM te verzamelen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Botbiologie
- Celcultuurtechnieken
- Genexpressieanalyse
Achtergrond
- Bot-geconditioneerd medium wordt gebruikt om de effecten van bot-afgeleide factoren op cellen te bestuderen.
- Het begrijpen van deze factoren kan inzichten bieden in botbiologie en weefselengineering.
- De methode maakt het mogelijk om cellulaire reacties op bot-afgeleide signalen te onderzoeken.
- Kwantitatieve real-time PCR wordt gebruikt om veranderingen in genexpressie te analyseren.
Doel van het onderzoek
- Om BCM te bereiden van varkensonderkaak botchips.
- Om de biologische activiteit van BCM op gekweekte cellen te testen.
- Om veranderingen in genexpressie te beoordelen na behandeling met BCM.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van botchips met behulp van een botkrabber.
- Warmtebehandeling of demineralisatie van de botchips.
- Incuberen van botchips in kweekmedium gedurende 24 uur.
- Verzamelen van het BCM voor daaropvolgende celstimulatie of biomateriaal pre-incubatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bereiding van BCM dat factoren bevat die zijn vrijgekomen van botchips.
- Demonstratie van cellulaire reacties op BCM-behandeling.
- Kwantitatieve real-time PCR resultaten die veranderingen in genexpressie laten zien.
- Inzichten in de biologische activiteit van bot-afgeleide factoren.
Conclusies
- BCM kan effectief worden bereid en gebruikt om cellulaire reacties te bestuderen.
- De methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoek naar botbiologie.
- Toekomstige studies kunnen het therapeutische potentieel van BCM in weefselengineering onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the paracrine signaling of bone grafts is critical for optimizing regenerative therapies in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and trauma reconstruction. This protocol enables mechanistic de-risking by isolating bone-derived molecular effects on mesenchymal cells, supporting target validation in bone regeneration pathways. The in vitro bioassay provides predictive confidence in evaluating biomaterial performance and biological activity before preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring gene expression changes in mesenchymal cells exposed to bone-derived factors.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative assessment of TGF-β regulated gene modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying bioactive bone preparations that drive desired molecular responses in regeneration-relevant cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized biological systems for downstream screening by generating consistent bone-conditioned medium from native, heat-treated, or demineralized bone.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through controlled incubation, debris removal via centrifugation, and sterile filtration of conditioned medium.
- Scalability Value: Enables platform reuse by allowing biomaterial pre-conditioning (e.g., collagen membranes) to assess absorption and retention of bioactive factors.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery to preclinical by modeling human mesenchymal cell responses to bone graft-derived signals relevant to bone regeneration.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway activity by demonstrating differential gene regulation (e.g., downregulation of adrenalin and pentraxin, upregulation of IL-11, IL-33, NOX4, and proteoglycan 4).
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by linking specific molecular outputs (e.g., IL-33) to functional biomaterial interactions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a reusable assay for assessing bone graft bioactivity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating the paracrine effects of bone grafts on mesenchymal cells.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via qPCR measurement of gene expression changes following BCM exposure.
- Analytics: Generates comparative data through delta-delta CT normalization to housekeeping genes, enabling condition-to-condition response analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling cellular responses in systems relevant to bone regeneration and reconstructive surgery.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular capability across bone sources (native, processed, demineralized) and biomaterial combinations, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in bone graft-mediated regeneration.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined steps for bone chip harvesting, treatment, incubation, and medium processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of biological activity, reducing late-stage failure risk in regenerative programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying bone preparations with strong molecular activity in relevant cell systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bone tissue handling, cell culture, and molecular biology techniques including RNA isolation and qPCR.
- Dependent on access to sterile tissue culture equipment, centrifuges, and real-time PCR instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of bone chip size (>1 mm), incubation time (24 hrs), and BCM concentration (20%) for reproducible results.
- Requires adaptation when applying to different cell types or biomaterials beyond collagen membranes and human mesenchymal cells.
- Limited by the current lack of established in vivo correlation for the observed gene expression changes, as noted in the source material.
