Light-driven Enzymatische Decarboxylatie

Het algemene doel van dit experiment is om enzymatische reacties aan te drijven met behulp van zichtbaar licht. In deze benadering wordt licht gebruikt om vetzuren om te zetten in terminale alkynen onder milde reactieomstandigheden. Decarboxylering vereist het breken van CC-bindingen.

En deze binding is erg stabiel, wat deze reactie erg moeilijk maakt. Het gebruik van licht is een duurzame benadering om zo'n moeilijke reactie te bereiken. We hadden het idee voor deze methode voor het eerst toen we probeerden waterstofperoxide direct aan de reactie toe te voegen, wat leidde tot inactivering van de enzymen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een constante hoeveelheid waterstofperoxide levert. Eerst gebruikten we gezuiverde OleT voor lichtgedreven biokatalyse om ons enzym te karakteriseren. Later testten we ook ruw extract, wat belangrijk zou zijn voor de ontwikkeling van industriële toepassingen.

Na het klonen van het synthetische OleT-gen in de expressievector en het transformeren van het plasmide in E.Coli zoals beschreven in het tekstprotocol, inoculeer de cellen in twee testbuisjes met elk drie milliliter LB-medium met 100 microgram per milliliter ampicilline. Incubeer de voorculturen gedurende 15 uur in een shaker. Verdun twee milliliter van de cultuur in 200 milliliter LB met ampicilline in twee liter flacons.

Incubeer de flacons in een shaker bij 37 graden Celsius en 180 RPM tot de culturen een optische dichtheid bereiken bij 600 nanometer tussen 0,6 en 0,8. Voeg vervolgens 0,5 millimolair delta-aminolevulinezuur toe aan de culturen. En induceer vervolgens de cellen door tetracycline toe te voegen bij 0,2 microgram per milliliter aan de flacons.

Incubeer de culturen gedurende 15 uur bij 20 graden Celsius en 180 RPM. Na inductie, decant de culturen in centrifugeerbuisjes en centrifugeer de buisjes gedurende 20 minuten bij 12000 keer G en vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg.

Resuspendeer de pellets door pipettering in 50 milliliter ijskoud Tris-buffer en breng de suspensie over in een kegelvormig centrifugeerbuisje. Continueer door centrifugeren bij 4000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Gooi het supernatant weg en resuspendeer elke pellet in drie milliliter buffer door herhaalde pipettering.

Lyseer de cellen door te sonificeren met drie cycli van 30 seconden met een pauze van een minuut tussen de cycli. Centrifugeer vervolgens het lysate bij 15000 keer G en vier graden Celsius gedurende 20 minuten en pipet vervolgens het celvrije extract voorzichtig in kegelvormige centrifugeerbuisjes. Voor bereiding van het ruwe extract voor de lichtgedreven biokatalyse, breng drie milliliter van één celvrij extract over naar een 10 kilodalton centrifugeerfilter en centrifugeer bij 4000 keer G bij vier graden Celsius om kleine moleculen te verwijderen.

Resuspendeer het eiwit in drie milliliter Tris. Om de activiteit van OleT in de lichtgedreven biokatalyse te karakteriseren, moet het eiwit worden gezuiverd. Om de eiwitzuivering te starten, laad drie milliliter van het celvrije extract op geëquilibreerde nikkel NTA spin kolommen.

Versluit de kolommen met bodemplaten en schroefdoppen. En schud ze lichtjes tot het hars gelijkmatig verdeeld is. Continueer door de kolommen te incuberen in een overhead shaker.

Centrifugeer vervolgens de kolom. Was vervolgens de kolommen door één milliliter wasbuffer toe te voegen en ze bij 700 keer G gedurende twee minuten te centrifugeren. Herhaal het wassen nog twee keer.

Na het wassen, plaats de kolommen in kegelvormige centrifugeerbuisjes en voeg één milliliter elutiebuffer toe aan elke kolom. Centrifugeer de buisjes gedurende twee minuten bij 700 keer G en herhaal de elutie nog twee keer. Voeg de gecombineerde kolomextracten toe aan een 10 kilodalton centrifugeerfilter en centrifugeer het bij 4000 keer G en vier graden Celsius om het imidazool dat voor de elutie wordt gebruikt, te scheiden van het enzym.

Bepaal ten slotte de eiwitzuiverheid en concentratie zoals aangegeven in het tekstprotocol. Om de biotransformatieprocedure te starten, voeg eerst 10% van een oppervlakteactieve stof zoals tergitol en 28,4 milligram stearinezuur toe aan gedestilleerd water om 10 milliliter van een 10 millimolair stamoplossing te maken. Verwarm de oplossing in een verwarmingskamer bij 60 graden Celsius totdat het stearinezuur volledig is opgelost.

Gebruik deze oplossing om een reactiemengsel te bereiden volgens het volgende protocol. Voeg FMN, EDTA, buffer en stearinezuur toe aan twee heldere glazen buisjes en roer in een waterbad bij 25 graden Celsius. Continueer door 200 microgram per milliliter van het gezuiverde enzym of ruw extract aan de buisjes toe te voegen.

En verlicht ze met een heldere LED-lichtbron op een afstand van twee centimeter. Neem vervolgens 200 microliter monsters op specifieke tijdstippen in buisjes die vooraf gevuld zijn met 20 microliter 37% zoutzuur om de reacties te stoppen. Voeg vervolgens vijf microliter van een 10 millimolair myristinezuur oplossing toe aan elk monster als intern standaard.

Om de reactieproducten te analyseren, voeg tweemaal 500 microliter ethylacetaat toe aan de buisjes. Draai de buisjes om om ze te mengen en centrifugeer gedurende één minuut bij 13.000 keer G. Breng vervolgens 400 microliter van de supernatanten over naar microcentrifugebuisjes en laat ze volledig verdampen door voorzichtig op de buisjes te blazen met gecomprimeerde lucht. Voeg 200 microliter MSTFA toe aan de buisjes.

En incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 60 graden Celsius om de monsters te derivatiseren vóór analyse. Analyseer de reactieproducten door een monster van vier microliter in een gaschromatograaf te injecteren die is uitgerust met een vlamionisatiedetector met behulp van de temperatuurprofiel die in het tekstprotocol is beschreven. Bepaal vervolgens de verhouding van één heptadecaan en bèta-hydroxyzuur gevormd in elk reactiemonster met een gaschromatograaf gekoppeld aan een massaspectrometer.

Gebruik oventemperatuur en massaspectro