Name: Light-driven Enzymatische Decarboxylatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Ontdek lichtgedreven enzymatische decarboxylering van vetzuren tot terminale alkynen met het OleT-enzym. Deze methode genereert waterstofperoxide via zichtbaar licht voor duurzame biocatalytische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.K. en F.H. zijn de EU-commissie dankbaar voor de financiële steun in het kader van het Marie-Sklodowska ITN Biocascades (nr. 634200).

Let op: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Verscheidene van de chemicaliën die in deze syntheses zijn acuut giftig en carcinogeen. Alle stappen met betrekking tot schadelijke organische oplosmiddelen, in het bijzonder de extractie van de reactieproducten en de derivatisering van vetzuren moet plaatsvinden onder een zuurkast worden uitgevoerd met behulp van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, full-length broek, dichte schoenen ). Alle handelingen met genetisch gemodificeerde organismen in dit werk vereisen installaties die zijn goedgekeurd voor de behandeling van genetisch gemodificeerde organismen van het veiligheidsniveau S1. 1. expressie van het recombinante Decarboxylase olet JE in E. coli <ol><li> Bereiding van de productiestam <ol><li> Bereid een synthetisch gen olet JE van Jeotgalicoccus en gekloneerd in de expressie vector pASK-IBA37plus beschreven. 8 </sup&gt; OPMERKING: Om de afbraak van vetzuren door enzymen van het metabolisme van bacteriën, E. voorkomen coli stam JW5020 uit de Keio collectie met een disfunctioneel route voor vetzuur afbraak werd gebruikt. </li></ol></li><li> Teelt en inductie van enzym expressie <ol><li> Bereid een pre-cultuur door het enten van de E. coli JW5020 Olet mutant uit een LB-plaat (met 100 ug ml -1 ampicilline) in twee 3 ml LB-medium in reageerbuizen. Pipet ampicilline (100 ug ml-1) uit een voorraadoplossing in het medium voor selectie en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 uur in een schudincubator bij 180 rpm. </li><li> Voeg 2 ml van de pre-kweken twee 200 ml LB-medium dat ampicilline (100 ug ml-1), in 1 L schudflessen. Incubatie verloopt bij 37 ° C en 180 rpm. </li><li> Bewaken van de verandering in de OD 600 nm na de inoculatie. Toen de OD 600 een waarde tussen 0,6 een bereiktd 0,8 induceren de expressie door toevoeging van tetracycline (0,2 ug ml-1). Incubeer de kweken gedurende 15 uur bij 20 ° C en 180 rpm. OPMERKING: Aangezien olet JE bevat een heem cofactor, is toevoeging van δ-amino levulinezuur (0,5 mM) vóór inductie nodig om de kweek te voorzien van een precursor voor de synthese cofactor. </li></ol></li><li> cellysis <ol><li> Voer de volgende stappen op het ijs. Breng de culturen door decanteren of pipetteren in centrifugebuizen en gebruik maken van een schaal om gelijke verdeling te garanderen. Centrifugeer de kweken gedurende 20 min bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellets in 50 ml buffer (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) door pipetteren en breng de suspensie in een conische centrifugebuis. </li><li> Na centrifugatie gedurende 15 minuten bij 4000 xg bij 4 ° C gooi het supernatant, resuspendeer elke pellet in 3 ml buffer door pipetteren. </li><li> Voer cellysis door zoniceren de oplossingen op ijs (drie cycli x 30 sec) waardoor een 1 min pauze tussen de cycli. Centrifugeer de oplossing gedurende 20 min bij 15.000 xg bij 4 ° C om celresten te verwijderen en breng het supernatans in een conische centrifugebuis zonder de pellet te verstoren door pipetteren. Gooi de pellet. LET OP: Een oplosmiddel fractie zal rechtstreeks worden gebruikt voor biokatalyse na kleine moleculen worden verwijderd. De tweede fractie wordt gebruikt voor de zuivering van de His-tag olet JE. </li></ol></li><li> Verwijderen van kleine moleculen van cel- extracten <ol><li> Alvorens het ruwe extract in biokatalyse verwijderen kleine moleculen storende vorming van waterstofperoxide of elektronenoverdracht pipetteren 3 ml celvrije extract in een centrifuge filter unit met een 10 kDa membraan en centrifugeer bij 4000 xg bij 4 ° C. Resuspendeer de resterende eiwit in 3 ml Tris-HCl-buffer. </li></ol></li><li> Zuivering van Olet </strong&gt; <ol><li> Toepassen 3 ml van de tweede celextract Zijn Pur Ni-NTA spin-kolommen, die eerder geëquilibreerd met equilibratiebuffer (20 mM Tris, NaCl 300 mM, 10 mM imidazool). </li><li> Sluit de kolommen met de onderste pluggen en bovenste schroef-caps en schud ze zachtjes tot het hars gelijkmatig wordt verdeeld met de cel-extract. Incubeer de kolommen geladen voor 30 minuten per overhead schudder bij 4 ° C. </li><li> Was de kolom met 1 ml wasbuffer (20 mM Tris, NaCl 300 mM, 20 mM imidazool, pH 7,4) door centrifugeren bij 700 g gedurende 2 min. Herhaal deze stap twee keer. </li><li> Plaats de kolommen in een schoon conische centrifugebuis en voeg 1 ml elutiebuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, 250 mM imidazool, pH 7,4) olet JE. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 2 minuten en herhaal deze stap tweemaal. LET OP: Imidazool zal binden aan nikkel en dus verwijderen olet JE uit de kolom. </li><li> Breng de elutie een centrifuge filtereenheid (10 kDa membraan) en centrifugeer bij 4000 xg bij 4 ° C verwijderen van imidazol. </li><li> Controleer de zuiverheid van het enzym door een SDS-PAGE (15%). 9 Meng 3 ul van de elutie met een SDS-buffer (eindconcentratie 1x) en incubeer de oplossing bij 95 ° C gedurende 5 minuten voor denaturatie. Vervolgens toegepast het totale bedrag op een SDS-PAGE. Voer de elektroforese bij 35 mA onder toepassing van een commercieel eiwitstandaard. Detecteren eiwit bij 50 kDa. </li><li> Het bepalen van de eiwitconcentratie gebruikt een commercieel beschikbare BSA-kit. Pipetteer 50 ul verdunde proteïne monsters (1: 100, 1: 200, 1: 500) en BSA standaard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml-1) in een 96-putjesplaat . Voeg 200 ul van Bradford-reagens, meet de absorptie bij 595 nm na 15 min met een fluorimeter en berekend de gebruikmaking van de standaardkromme. </li></ol></li></ol> 2. Licht-gekatalyseerde Biotransformatie <ol><li> Biokatalytische reacties zonder waterstofperoxide aanvulling<ol><li> Bereid een 10 ml voorraadoplossing van 10 mM stearinezuur (Mr 284,5 g mol -1) door toevoeging van 10% (v / v) Tergitol en 0,0284 g stearinezuur gedistilleerd water. Verwarm de oplossing in een droogstoof op 60 ° C totdat het vetzuur volledig opgelost. </li><li> Biokatalyse en bemonstering <ol><li> Bereid twee 2 ml reactiemengsels die 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM stearinezuur in Tris-HCl-buffer. Voeg een magnetische roerstaaf voldoende zuurstoftoevoer en plaats de glazen buizen in een waterbad verwarmd tot 25 ° C. </li><li> Voeg 200 ug ml-1 gezuiverd enzym of 10% (v / v) celvrij extract aan elk van de reactiemengsels en verlichten ze namelijk glazen lamp (120 W) op 15 cm afstand van de reactiebuizen. </li><li> Neem 200 ul monsters op specifieke tijdstippen (0, 10, 30, 60 en 120 min en overnacht) stoppen van de reactie met 20 ul 37% HCl. Voeg 5 ul myristinezuur (10 mM voorraad, zodatlutie) als interne standaard. </li></ol></li></ol></li><li> Analyse van de reactieproducten <ol><li> Voor extractie voeg 500 pl ethylacetaat om de monsters tweemaal inverteren en centrifugeer gedurende 1 min bij 13.000 x g. </li><li> Take off 400 ul van de bovenstaande vloeistof en laat het oplosmiddel helemaal verdampen. </li><li> Derivatiseren de carbonzuren in trimethylsilylcarboxylic zuur door toevoeging van 200 pl N-methyl-N - (trimethylsilyl) trifluor aceetamide (MSTFA). Incubeer de oplossing bij 60 ° C gedurende 30 min teneinde hydroxylgroepen trimethylsilyl ethers zetten. </li><li> Bepaling van conversie door GC / FID OPMERKING: Bepaal de vorming van 1-heptadeceen (RT: 8,34 min), α- en β-hydroxystearinezuur (RT: 12,05 en 12,1 min) en afname van het substraat (RT: 11,15 min) met behulp van GC / FID. <ol><li> Stel het temperatuurprofiel onderstaande beschreven de injectietemperatuur tot 340 ° C. Greepde initiële oventemperatuur bij 90 ° C gedurende 3,5 minuten en vervolgens toenemen met 45 ° C min -1. Bij 220 ° C, houd de temperatuur gedurende 2 minuten. Na herhaalde toename van 45 ° C min -1 Houd de temperatuur op 280 ° C gedurende 2 minuten en verhoog met 60 ° C min -1. LET OP: Maximale temperatuur van 330 ° C wordt gehouden voor 1,44 min. </li><li> Injecteer 4 pl van het monster, met een splitsingsverhouding van 5 tot snelle verdamping en homogeen mengen het dragergas helium krijgen. Opmerking: In afhankelijkheid van de stijgende temperatuur zal het substraat en de producten van de gas- fase. De stoffen worden gedetecteerd door de GC / FID detector na het passeren van de kolom bij specifieke retentietijden en worden als pieken op het scherm. Let op de formatie piek op de monitor. </li><li> Bereken de concentratie van gevormde product door de volgende formule: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg"/&gt; OPMERKING: De kalibratiefactor is specifiek voor deze kolom voor elk substraat en product door het berekenen van de standaardkromme van bekende hoeveelheden van het gederivatiseerde stoffen en de overeenkomstige piekoppervlak. </li></ol></li><li> Identificeer olefine en β-hydroxyzuur pieken met GC / MS. <ol><li> Identificeer olefine en β-hydroxyzuur pieken met GC / MS. Stel de temperatuur profiel. Stel de injectietemperatuur tot 250 ° C. Houd de oventemperatuur bij 100 ° C gedurende 5 min en vervolgens toenemen met 20 ° C min -1. LET OP: Maximale temperatuur wordt gehouden gedurende 7,5 min. </li><li> Stel de massaspectrometer detector temperatuur tot 250 ° C en scannen 50 tot 500 m / z met elektronimpact modus. OPMERKING: Electron effect ionisatie verwijdert een enkel elektron resulteert in de vorming van een radicaal kation die voorwaarts wordt doorgegeven voor massa-analyse. Door de hoge energie intramolar covalente bindingen binnen demolecule break creëren van fragmenten van lagere m / z. Deze fragmenten vormen een vingerafdruk specifiek voor een stof. </li><li> Injecteer 1 ul van het monster. Detect 1-heptadeceen na 11,4 min retentietijd de overeenkomstige fingerprint (figuur 2). </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kourist, R., Domìnguez de Marìa, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li>
<li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taming+of+oxygen%3A+biocatalytic+oxyfunctionalisations%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Comm%22%5BJournal%5D)">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li>
<li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ang.+Chem.+In.+Ed%22%5BJournal%5D)">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li>
<li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis%3A+Nonconventional+Regeneration+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li>
<li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li>
<li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell.+Fact%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53(2015).</li>
<li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+olefin+%281-alkene%29+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li>
<li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide-independent+production+of+%CE%B1-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide-independent production of α-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28(2014).</li>
<li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De light-driven generatie van waterstofperoxide kan worden toegepast voor een reeks redox transformaties, waaronder peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 en P450 monooxygenases 5. Het is een eenvoudig en uitvoerbaar aanpak. Op lange termijn is het gebruik van zichtbaar licht opent het perspectief zonlicht chemische transformaties, die een duurzaam alternatief voor energierijk reacties gebruiken. De methode is toepasbaar met gezuiverd enzym of met celvrij extract. Terwijl de laatste lagere kosten en werk vereist, moet worden opgemerkt dat kleine moleculen in het ruwe extract kan interfereren met het licht gekatalyseerde omzetting. Een praktisch bruikbare aanpak is om deze kleine onderdelen verwijderen met een micromembraan (dat wil zeggen, door centrifugeren in een centrifugaal filter eenheid of door dialyse). De concentratie van de licht-harvesting molecule FMN bepaalt de concentratie van het waterstofperoxide. Afhankelijk van de Affinity van het oxidoreductase, deze concentratie is bepalend voor de enzymatische activiteit. Een andere belangrijke factor is de concentratie van het te offeren elektronendonor EDTA. De belangrijkste parameter is echter de operationele stabiliteit en activiteit van het enzym. De olefinization van vetzuren is een elegante reactie voor de omzetting van bio-based vetzuren in alkenen die behoren tot de belangrijkste grondstoffen voor de chemische industrie. Het licht aangedreven biokatalytische decarboxylering kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur en bij een neutrale pH-waarde, die in het gebied van duurzaamheid duidelijke voordelen biedt worden uitgevoerd. Onze resultaten tonen aan dat in situ vorming van waterstof peroxide is een strategie om de cofactor te leveren zonder afbreuk enzymstabiliteit, wat leidt tot een hoge conversie. Present methoden voor cofactorregeneratiesysteem gebruiken landbouwproducten of benzine gebaseerde chemicaliën. Light-driven reacties zijn in opkomst als duurzame alternatief. Toekomstonderzoek zal worden gewijd aan methoden voor de vervanging van het offer reagens EDTA door goedkopere moleculen en het bedrag van de licht-harvesting molecule FMN verminderen.

De klimaatverandering en de te verwachten uitputting van hernieuwbare bronnen vormt een ernstige bedreiging voor onze samenleving. In deze context, enzym katalyse is een nog niet ten volle benut potentieel voor de ontwikkeling van een duurzame en &#39;groener&#39; chemie 1. Oxidoreductasen hebben de capaciteit om de invoering en wijziging van functionele groepen onder milde omstandigheden reacties katalyseren en behoren tot de belangrijkste biokatalysatoren 2. Meest redox transformaties vereisen de toevoer van externe co- factoren zoals NAD (P) H. Methoden voor cofactorregeneratiesysteem zijn toegepast op industriële schaal. Echter, ze nog steeds leiden tot hoge proceskosten, die hun verzoek meestal beperkt tot hoogwaardige producten. Interessant verschillende peroxidasen 3,4 en P450 monooxygenases 5 accepteren elektronen van waterstofperoxide via de zogenaamde peroxide shunt. Terwijl H 2 O 2 is een goedkope co-reagens, is naar verluidt harmful voor veel enzymen. Een gestage in situ vorming lage concentraties waterstofperoxide een mogelijke aanpak om de reactie te rijden zonder dat de operationele stabiliteit van het enzym. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" /> Figuur 1. Experimentele set-up van de photobiocatalytic decarboxylering van vetzuren door olet JE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> De toepassing van licht als energiebron voor chemische en biologische processen is toenemende interesse in de afgelopen jaren 6. Licht gedreven generatie waterstofperoxide ontstaan ​​als een eenvoudige en robuuste methode waterstofperoxide redox transformaties (figuur 1) te leveren. Een fotokatalysator zoals flavine adenine maandagonucleotide (FMN) kan de reductie van moleculaire zuurstof tot waterstofperoxide, dat vervolgens wordt gebruikt als cofactor voor de enzymatische reactie oxyfunctionalization. Mogelijke elektronendonoren zijn ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), ascorbaat of goedkope formiaat. De werkwijze is algemeen toepasbaar voor H 2 O 2 afhankelijke enzymen, waaronder peroxidasen 3,4 en P450 monooxygenases 5. We hebben onlangs onderzocht de toepassing van een nieuwe bacteriële decarboxylase 7 voor de omzetting van natuurlijke vetten tot 8 olefinen. Dit zou een duurzame route voor de synthese van veel gebruikte platform chemische stoffen uit een bio-based bron. De decarboxylase Olet JE van het gram-positieve bacterie Jeotgalicoccus sp. katalyseert de oxidatieve decarboxylering van vetzuren en vormt 1-alkenen als producten. Olet JE is nauw verwant aan bacteriële P450 monooxygenases en dient elektronen from waterstofperoxide voor de reactie. Helaas, toevoeging van H 2 O 2 aan een oplossing van substraat en enzym resulteerde in lage omzettingen en een slechte reproduceerbaarheid van de resultaten, vermoedelijk als gevolg van een schadelijke werking van waterstofperoxide op de stabiliteit van olet JE. Genereren van een fusie-eiwit met de NADPH-reductase RhFred maakte een NADPH-afhankelijke decarboxylering mogelijk. 9 echter de hoge prijs van NADPH en de huidige beperkte mogelijkheden voor een kostenefficiënte regeneratie bracht ons ertoe goedkopere elektronendonoren onderzoeken. Geïnspireerd door de gelijkenis van Olet JE met P450 monooxygenases, gebruikten we de licht-gekatalyseerde generatie van H 2 O 2. We waren blij om hoge omzettingen te verkrijgen (tot&gt; 95%) met behulp van celvrije extracten of gezuiverde enzym oplossingen. Met het voorbeeld van vetzuur decarboxylering presenteren we een algemeen protocol voor licht gestuurde enzymatic redox transformaties met behulp van FMN als fotokatalysator en waterstofperoxide als cofactor. De gepresenteerde werkwijzen omvatten de productie van het enzym in recombinante cel van E. coli, zuivering van het enzym, het verzoek voor de synthese van 1-alkenen en de analyse van de reactieproducten.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochlorid acid 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&delta;-Amino levulinic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>Myristic acid >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Stearic acid >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugation rotors</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-FID&nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0.25&nbsp;mm x 0.25 &micro;m)&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Column GC-MS</td><td>FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>GC-FID</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>Spectral photometer</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity chromatography column</td><td>His Pur Ni-NTA spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Centricon</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>96 Well Multiply&reg;PCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

light-driven enzymatische decarboxylatie

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases behoren tot de meest toegepaste industriële enzymen. Toch moeten ze externe elektronen waarvan de levering is vaak kostbaar en uitdagend. Recycling van de elektronendonoren NADH of NADPH vereist het gebruik van andere enzymen en substraten offer. Interessant meerdere oxidoreductasen accepteren waterstofperoxide als elektronendonor. Terwijl ze goedkoop, dit reagens verlaagt vaak de stabiliteit van enzymen. Een oplossing voor dit probleem is de in situ vorming van de cofactor. De continue toevoer van de cofactor bij lage concentratie drijft de reactie zonder afbreuk enzymestabiliteit. Dit demonstreert een werkwijze voor het licht-gekatalyseerde in situ productie van waterstofperoxide met het voorbeeld van het heem-afhankelijke vetzuur decarboxylase olet JE. Het vetzuur decarboxylase olet JE ontdekt dankzij de unieke mogelijkheid om lange-keten 1-alkenen uit vetzuren, een ongekende enzymatische producerenreactie. 1-alkenen verspreide additieven voor smeermiddelen en weekmakers. Olet JE is aangetoond dat elektronen van waterstofperoxide aanvaarden de oxidatieve decarboxylering. Terwijl toevoeging van waterstofperoxide schade het enzym en resulteert in lage opbrengsten, in situ vorming van de cofactor omzeilt dit probleem. Het photobiocatalytic systeem toont duidelijke voordelen op het gebied enzymactiviteit en opbrengst, waardoor een eenvoudig en efficiënt systeem voor het vetzuur decarboxylering.

Terwijl de toevoeging van waterstofperoxide aan het reactiemengsel geleid tot een lage tot matige omzettingen (&lt;10%), in situ vorming van waterstof peroxide verhoogde de omzetting tot 80% omzetting. Analyse met GC / MS gaf de vorming van alkenen uit vetzuren (figuur 2). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" /> Figuur 2. (A) temperatuurprofiel voor GC / MS metingen. (B) vingerafdruk van de 1-heptadeceen eluerende na 11,4 min. (C) Kenmerk secundaire CnH2n-1 fragment ionen van terminale alkenen voorbeeldige getoond voor 1-heptadeceen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> E. coli. Een gezuiverde enzymoplossing vertoonde een duidelijke correlatie tussen de enzymconcentratie en conversie. Verhogen van de concentratie van de licht-harvesting molecule FMN leiden tot hogere conversies. Het verhogen van de concentratie boven 10 mM niet verder de reacties te versnellen, wat aangeeft dat de hoeveelheid waterstofperoxide is voldoende beschikbaar en niet meer de beperkende factor. Naast de decarboxylering van vetzuren, olet JE katalyseert ook hydroxylering in β-plaats. Bij de omzetting van stearinezuur, de decarboxylering ongeveer drie keer sneller dan de hydroxylering. In een typisch experiment met een oplossing van 0,5 mM stearinezuur en 10 uM FMN, 99% van het substraat omgezet naar een mengsel van 1-heptadeceen en 2-hydroxystearinezuur met een verhouding van3,3: 1 (Figuur 3) 8. Een onderzoek van het substraat spectrum van het licht gedreven biokatalyse bleek dat vetzuren met langere acylketens, olet JE voorkeur katalyseert de decarboxylering, terwijl de relatieve hoeveelheid hydroxyl-vetzuren in het productmengsel toe met kortere ketenlengte. Vetzuren korter dan myristinezuur (C14) niet decarboxylering onderworpen. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" /> Figuur 3. Gaschromatografische analyse van olet JE gemedieerde decarboxylering stearinezuur (11,15 min) in 1-heptadeceen (8,4 min), α-hydroxystearinezuur (12,04 min) β-hydroxystearinezuur (12,1 min). De verandering van de piek gebieden uit monsters genomen over een tijdsverloop van 2 uur wordt getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om vie</a>wa grotere versie van dit cijfer. Verrassend is dat de onverzadigde vetzuren oliezuur (C18: 1D9 cis) en linolzuur (C18: 2d9d12) niet geaccepteerd als substraten, wat aangeeft dat de getwiste configuratie cis dubbele bindingen niet kunnen worden ondergebracht in een productieve bindingsmodus in het enzym. Toevoeging van oliezuur (10%) ook voorkomen dat de omzetting van stearinezuur. Interessant, stearinezuur (C18: 1D9 trans) omgezet door olet JE, maar met iets lagere activiteit dan stearinezuur.

We beschrijven een protocol voor het licht-gekatalyseerde vorming van waterstofperoxide - een cofactor voor oxidatieve transformaties.

Light-driven Enzymatische Decarboxylatie

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Het algemene doel van dit experiment is om enzymatische reacties aan te sturen met behulp van zichtbaar licht. Bij deze benadering wordt licht gebruikt om vetzuren om te zetten in terminale alkyner onder milde reactieomstandigheden. Decarboxylering vereist het verbreken van CC-bindingen.En deze binding is zeer stabiel, waardoor dit een zeer moeilijke reactie is. Het gebruik van licht is een duurzame benadering om een dergelijke moeilijke reactie te bewerkstelligen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we probeerden waterstofperoxide direct aan de reactie toe te voegen, wat leidde tot inactivatie van de enzymen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een constante hoeveelheid waterstofperoxide levert. Eerst hebben we gezuiverde OleT gebruikt voor lichtgestuurde biocatalyse om ons enzym te karakteriseren. Later hebben we ook ruw extract getest, wat van belang zou zijn voor de ontwikkeling van industriële toepassingen.Nadat het synthetische OleT-gen in de expressievector is gekloneerd en het plasmide in E.Coli is getransformeerd zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de cellen geïnoculeerd in twee reageerbuisjes met drie milliliters LB-medium met 100 micrograms per milliliter ampicilline. Incubeer de preculturen 15 uur in een schudapparaat. Verdun twee milliliters van de cultuur in 200 milliliters LB met ampicilline in twee kolven van één liter.Incubeer de kolven in een schudmachine bij 37 °C en 180 RPM totdat de culturen een optische dichtheid bij 600 nm bereiken tussen 0,6 en 0,8. Voeg vervolgens 0,5 mM delta-aminolevulinezuur toe aan de culturen. Induceer daarna de cellen door tetracycline in een concentratie van 0,2 µg/mL aan de kolven toe te voegen.Incubeer de culturen gedurende 15 uur bij 20 degree celsius en 180 RPM. Giet na inductie de culturen over in centrifugebuizen en centrifugeer de buizen bij 12000 times G en four degree celsius gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant.Resuspendeer de pellets door middel van pipetteren in 50 milliliters ijskoude Tris-buffer en breng de suspensie over naar een conische centrifugebuis. Centrifugeer vervolgens bij 4000 times G en vier degree celsius gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in drie milliliters buffer door herhaaldelijk te pipetteren.lyseer de cellen door middel van sonicatie in drie cycli van 30 seconden, met een pauze van één minuut tussen de cycli. Centrifugeer het lysaat vervolgens bij 15000 ×g en 4 °C gedurende 20 minuten, en pipetteer daarna voorzichtig het celvrije extract in conische centrifugebuisjes. Voor de bereiding van het ruwe extract voor de lichtgestuurde biocatalyse worden 3 mL van het celvrije extract overgebracht naar een 10 kDa centrifugefilter en gecentrifugeerd bij 4000 ×g bij 4 °C om kleine moleculen te verwijderen.Resuspendeer het eiwit in drie milliliter Tris. Om de activiteit van OleT in de lichtgestuurde biocatalyse te karakteriseren, moet het eiwit worden gezuiverd. Om te beginnen met de eiwitzuivering, brengt u drie milliliter van het celvrije extract aan op geëquilibreerde nikkel NTA spin-kolommen.Sluit de kolommen af met bodempluggen en schroefdoppen. Schud ze vervolgens lichtjes totdat de hars gelijkmatig is verdeeld. Ga verder door de kolommen te incuberen in een overhead-shaker.Centrifuge vervolgens de kolom. Was daarna de kolommen door één milliliter wasbuffer toe te voegen en deze twee minuten te centrifugeren bij 700 ×g. Herhaal de wasstap nog twee keer.Plaats na het wassen de kolommen in conische centrifugebuizen en voeg één milliliter elutiebuffer toe aan elke kolom. Centrifugeer de buizen bij 700 ×g gedurende twee minuten en herhaal de elutie nog twee keer. Voeg de gecombineerde kolomextracten toe aan een 10 kilodalton centrifugefilter en centrifugeer dit bij 4000 ×g en 4 °C om het voor de elutie gebruikte imidazole van het enzym te scheiden.Bepaal tot slot de eiwitzuiverheid en -concentratie zoals aangegeven in het tekstprotocol. Om de biotransformatieprocedure te starten, voegt u eerst 10% van een surfactant zoals tergitol en 28,4 milligram stearinezuur toe aan gedestilleerd water om 10 milliliter van een 10 millimolaire stamoplossing te maken. Verhit de oplossing in een verwarmingskamer bij 60 °C totdat het stearinezuur volledig is opgelost.Gebruik deze oplossing om een reactiemengsel te bereiden volgens het volgende protocol. Voeg FMN, EDTA, buffer en stearinezuur toe aan twee heldere glazen buisjes en roer in een waterbad bij 25 degree Celsius. Ga verder door 200 micrograms per milliliter van het gezuiverde enzym of ruwe extract aan de buisjes toe te voegen.En verlicht deze met een heldere LED-lamp op een afstand van twee centimeter. Neem vervolgens op specifieke tijdstippen monsters van 200 µL in buisjes die vooraf zijn gevuld met 20 µL 37% zoutzuur om de reacties te stoppen. Voeg daarna vijf µL van een 10 mM myristinezuuroplossing toe aan elk monster als interne standaard.Voeg twee keer 500 microliters ethylacetaat toe aan de buisjes om de reactieproducten te analyseren. Keer de buisjes om om ze te mengen en centrifugeer één minuut bij 13, 000 ×g. Breng vervolgens 400 microliters van de supernatanten over naar microcentrifugebuisjes en laat deze volledig verdampen door voorzichtig met perslucht op de buisjes te blazen. Voeg 200 microliters MSTFA toe aan de buisjes.Incubeer het mengsel 30 minuten bij 60 °C om de monsters te derivatiseren voorafgaand aan de analyse. Analyseer de reactieproducten door een monster van 4 µL te injecteren in een gaschromatograaf uitgerust met een vlamionisatiedetector, gebruikmakend van het temperatuurprofiel dat in het tekstprotocol wordt beschreven. Bepaal vervolgens de verhouding tussen 1-heptadecaan en het gevormde bèta-hydroxyzuur in elk reactiemonster met een gaschromatograaf gekoppeld aan een massaspectrometer.Gebruik de oventemperatuur en de instellingen van de massaspectrometer zoals beschreven in het tekstprotocol. Injecteer één µL van elk monster in de gaschromatograaf en registreer het chromatogram. Monitor tot slot de GCMS-chromatogrammen van elk monster en analyseer deze volgens het protocol van de fabrikant.De molecuulgewichten van de producten uit de enzymatische reacties werden bepaald met een gaschromatograaf gekoppeld aan een massaspectrometer. Voor vetzuren met langere acylketens katalyseert het enzym OleT bij voorkeur hun decarboxylering tot olefinen van verschillende lengtes. Monsters van de biotransformatiereactie werden geanalyseerd met een gaschromatograaf voorzien van een vlamionisatiedetector.Er werd aangetoond dat de decarboxylering van stearinezuur drie keer sneller verloopt dan de hydroxyleringsreactie, waarbij 99% van het stearinezuur werd omgezet in een mengsel van heptadecaan en 2-hydroxystearinezuur in een verhouding van 3,3:1. Eenmaal onder de knie, kan de lichtgestuurde biocatalyse in enkele uren worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij lichtcatalyse ligt de uitdaging in het koppelen van nuttige reacties aan het opvangen van licht.In ons geval fungeert het licht binnen het FMN-molecuul als fotosensibilisator en koppelen we deze aan ons enzym via een transfermolecuul, namelijk waterstofperoxide.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

De activiteit van de induceerbare lysine decarboxylase wordt gecontroleerd door de reactie van het substraat L-lysine en het product cadaverine met 2,4,6-trinitrobenzensulfonic zuur te adducten dat differentiële oplosbaarheid hebben in tolueen vorm.

Een test voor het meten van de activiteit van de Escherichia coli Induceerbare Lysine Decarboxyase

Een methode voor de bepaling van acetaat kinase activiteit is beschreven. Deze test maakt gebruik van een directe reactie voor het bepalen van enzymactiviteit en de kinetiek van acetaat kinase in de acetaat-vormende richting met verschillende fosforyl acceptoren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor het testen van andere acetyl fosfaat of acetyl-CoA gebruik te maken van enzymen.

Directe detectie van de acetaat-vormende activiteit van het enzym acetaat Kinase

Een duurzame auto regelen van bacterieel systeem voor de sanering van olieverontreinigingen werd ontworpen met behulp van standaard verwisselbare DNA delen (BioBricks). Een...

Een toolkit voor de omzetting van koolwaterstoffen inschakelen in waterige milieus

Een tweedelige procedure voor de synthese van farmaceutisch actieve indole-derivaten door C-H functionalisering met aniline, met behulp van foto- en Brønsted zuurkatalyse, wordt beschreven.

Synthese van Antivirale tetrahydrocarbazool Derivaten door fotochemische en Zuur-gekatalyseerde CH Functionalisering via Intermediate peroxiden (CHIPS)

Hier presenteren we een protocol dat kan worden gebruikt om microscopisch visualiseren en kwantificeren van de activiteit van dehydrogenases in cellen en weefsels en kinetiek, functie en subcellular localisatie.

Metabole Mapping: Kwantitatieve enzym cytochemie en histochemie te bepalen van de activiteit van Dehydrogenases in cellen en weefsels

Chirale amino alcoholen zijn veelzijdige moleculen voor gebruik als steigers in de organische synthese. Vanaf L-lysine, synthetiseren we amino alcoholen door een reactie van de enzymatische trapsgewijs combineren diastereoselective C-H oxidatie gekatalyseerd door dioxygenase gevolgd door splitsing van het carbonzuur deel van het overeenkomstige aminozuur van de hydroxyl door een decarboxylase.

Enzymatische Cascade reacties voor de synthese van chirale Amino alcoholen van L-lysine

Hier presenteren we een protocol voor anaërobe EiwitReiniging, anaërobe eiwitconcentratie en latere kinetische karakterisering met behulp van een zuurstof-elektrode-systeem. De methode wordt geïllustreerd met behulp van het enzym DesB, een dioxygenase enzym die meer stabiel actief en wanneer gezuiverd en in een anaëroob milieu opgeslagen.

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Expressie en zuivering van fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten wordt beschreven met voorbeelden (expressie in E. coli, FPLC). De gezuiverde proteïnen worden gebruikt voor kristallisatie en antilichamenproductie en in dienst genomen voor enzym analyses. De geselecteerde fotometrische analyses worden voorgesteld om de multi-functionaliteit van FAHD1 als Oxaloacetaat decarboxylase en acylpyruvate hydrolase te tonen.

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Optogenetische controle van microbieel metabolisme biedt flexibele dynamische controle over fermentatieprocessen. Het protocol hier laat zien hoe blauw licht-gereguleerde fermentaties voor chemische en eiwitproductie op verschillende volumetrische schalen kunnen worden opgezet.

Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

Isothermische titratiecalorimetrie maatregelen warmtestroom vrijgelaten of geabsorbeerd in chemische reacties. Deze methode kan worden gebruikt voor enzym-katalyse kwantificeren. In deze paper, het protocol voor instrumentale setup, experiment loopt, en data-analyse wordt in het algemeen beschreven en toegepast op de karakterisering van enzymatische hydrolyse van ureum door jack bean urease.

Hot Biologische Katalyse: Isothermisch titratiecalorimetrie om enzymatische reacties karakteriseren

Ontdek lichtgedreven enzymatische decarboxylering van vetzuren tot terminale alkynen met het OleT-enzym. Deze methode genereert waterstofperoxide via zichtbaar licht voor duurzame biocatalytische processen.

Light-driven Enzymatische Decarboxylatie

Meer video's verkennen