Light-driven Enzymatische Decarboxylatie

Het algemene doel van dit experiment is om enzymatische reacties aan te sturen met behulp van zichtbaar licht. Bij deze benadering wordt licht gebruikt om vetzuren om te zetten in terminale alkyner onder milde reactieomstandigheden. Decarboxylering vereist het verbreken van CC-bindingen.

En deze binding is zeer stabiel, waardoor dit een zeer moeilijke reactie is. Het gebruik van licht is een duurzame benadering om een dergelijke moeilijke reactie te bewerkstelligen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we probeerden waterstofperoxide direct aan de reactie toe te voegen, wat leidde tot inactivatie van de enzymen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een constante hoeveelheid waterstofperoxide levert. Eerst hebben we gezuiverde OleT gebruikt voor lichtgestuurde biocatalyse om ons enzym te karakteriseren. Later hebben we ook ruw extract getest, wat van belang zou zijn voor de ontwikkeling van industriële toepassingen.

Nadat het synthetische OleT-gen in de expressievector is gekloneerd en het plasmide in E.Coli is getransformeerd zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de cellen geïnoculeerd in twee reageerbuisjes met drie milliliters LB-medium met 100 micrograms per milliliter ampicilline. Incubeer de preculturen 15 uur in een schudapparaat. Verdun twee milliliters van de cultuur in 200 milliliters LB met ampicilline in twee kolven van één liter.

Incubeer de kolven in een schudmachine bij 37 °C en 180 RPM totdat de culturen een optische dichtheid bij 600 nm bereiken tussen 0,6 en 0,8. Voeg vervolgens 0,5 mM delta-aminolevulinezuur toe aan de culturen. Induceer daarna de cellen door tetracycline in een concentratie van 0,2 µg/mL aan de kolven toe te voegen.

Incubeer de culturen gedurende 15 uur bij 20 degree celsius en 180 RPM. Giet na inductie de culturen over in centrifugebuizen en centrifugeer de buizen bij 12000 times G en four degree celsius gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant.

Resuspendeer de pellets door middel van pipetteren in 50 milliliters ijskoude Tris-buffer en breng de suspensie over naar een conische centrifugebuis. Centrifugeer vervolgens bij 4000 times G en vier degree celsius gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in drie milliliters buffer door herhaaldelijk te pipetteren.

lyseer de cellen door middel van sonicatie in drie cycli van 30 seconden, met een pauze van één minuut tussen de cycli. Centrifugeer het lysaat vervolgens bij 15000 ×g en 4 °C gedurende 20 minuten, en pipetteer daarna voorzichtig het celvrije extract in conische centrifugebuisjes. Voor de bereiding van het ruwe extract voor de lichtgestuurde biocatalyse worden 3 mL van het celvrije extract overgebracht naar een 10 kDa centrifugefilter en gecentrifugeerd bij 4000 ×g bij 4 °C om kleine moleculen te verwijderen.

Resuspendeer het eiwit in drie milliliter Tris. Om de activiteit van OleT in de lichtgestuurde biocatalyse te karakteriseren, moet het eiwit worden gezuiverd. Om te beginnen met de eiwitzuivering, brengt u drie milliliter van het celvrije extract aan op geëquilibreerde nikkel NTA spin-kolommen.

Sluit de kolommen af met bodempluggen en schroefdoppen. Schud ze vervolgens lichtjes totdat de hars gelijkmatig is verdeeld. Ga verder door de kolommen te incuberen in een overhead-shaker.

Centrifuge vervolgens de kolom. Was daarna de kolommen door één milliliter wasbuffer toe te voegen en deze twee minuten te centrifugeren bij 700 ×g. Herhaal de wasstap nog twee keer.

Plaats na het wassen de kolommen in conische centrifugebuizen en voeg één milliliter elutiebuffer toe aan elke kolom. Centrifugeer de buizen bij 700 ×g gedurende twee minuten en herhaal de elutie nog twee keer. Voeg de gecombineerde kolomextracten toe aan een 10 kilodalton centrifugefilter en centrifugeer dit bij 4000 ×g en 4 °C om het voor de elutie gebruikte imidazole van het enzym te scheiden.

Bepaal tot slot de eiwitzuiverheid en -concentratie zoals aangegeven in het tekstprotocol. Om de biotransformatieprocedure te starten, voegt u eerst 10% van een surfactant zoals tergitol en 28,4 milligram stearinezuur toe aan gedestilleerd water om 10 milliliter van een 10 millimolaire stamoplossing te maken. Verhit de oplossing in een verwarmingskamer bij 60 °C totdat het stearinezuur volledig is opgelost.

Gebruik deze oplossing om een reactiemengsel te bereiden volgens het volgende protocol. Voeg FMN, EDTA, buffer en stearinezuur toe aan twee heldere glazen buisjes en roer in een waterbad bij 25 degree Celsius. Ga verder door 200 micrograms per milliliter van het gezuiverde enzym of ruwe extract aan de buisjes toe te voegen.

En verlicht deze met een heldere LED-lamp op een afstand van twee centimeter. Neem vervolgens op specifieke tijdstippen monsters van 200 µL in buisjes die vooraf zijn gevuld met 20 µL 37% zoutzuur om de reacties te stoppen. Voeg daarna vijf µL van een 10 mM myristinezuuroplossing toe aan elk monster als interne standaard.

Voeg twee keer 500 microliters ethylacetaat toe aan de buisjes om de reactieproducten te analyseren. Keer de buisjes om om ze te mengen en centrifugeer één minuut bij 13, 000 ×g. Breng vervolgens 400 microliters van de supernatanten over naar microcentrifugebuisjes en laat deze volledig verdampen door voorzichtig met perslucht op de buisjes te blazen. Voeg 200 microliters MSTFA toe aan de buisjes.

Incubeer het mengsel 30 minuten bij 60 °C om de monsters te derivatiseren voorafgaand aan de analyse. Analyseer de reactieproducten door een monster van 4 µL te injecteren in een gaschromatograaf uitgerust met een vlamionisatiedetector, gebruikmakend van het temperatuurprofiel dat in het tekstprotocol wordt beschreven. Bepaal vervolgens de verhouding tussen 1-heptadecaan en het gevormde bèta-hydroxyzuur in elk reactiemonster met een gaschromatograaf gekoppeld aan een massaspectrometer.

Gebruik de oventemperatuur en de instellingen van de massaspectrometer zoals beschreven in het tekstprotocol. Injecteer één µL van elk monster in de gaschromatograaf en registreer het chromatogram. Monitor tot slot de GCMS-chromatogrammen van elk monster en analyseer deze volgens het protocol van de fabrikant.

De molecuulgewichten van de producten uit de enzymatische reacties werden bepaald met een gaschromatograaf gekoppeld aan een massaspectrometer. Voor vetzuren met langere acylketens katalyseert het enzym OleT bij voorkeur hun decarboxylering tot olefinen van verschillende lengtes. Monsters van de biotransformatiereactie werden geanalyseerd met een gaschromatograaf voorzien van een vlamionisatiedetector.

Er werd aangetoond dat de decarboxylering van stearinezuur drie keer sneller verloopt dan de hydroxyleringsreactie, waarbij 99% van het stearinezuur werd omgezet in een mengsel van heptadecaan en 2-hydroxystearinezuur in een verhouding van 3,3:1. Eenmaal onder de knie, kan de lichtgestuurde biocatalyse in enkele uren worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij lichtcatalyse ligt de uitdaging in het koppelen van nuttige reacties aan het opvangen van licht.

In ons geval fungeert het licht binnen het FMN-molecuul als fotosensibilisator en koppelen we deze aan ons enzym via een transfermolecuul, namelijk waterstofperoxide.