Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden
December 28th, 2015
We beschrijven twee complementaire methoden met behulp van de fluorescentie ubiquitinatie celcyclus indicator (FUCCI) en beeldanalyse of flowcytometrie om cellen in de binnenste G1-gearresteerde en buitenste proliferatieve regio's van 3D-sferoïden te identificeren en isoleren.
Het algemene doel van deze methode is om cellen uit een meercellig steroid te identificeren, te karakteriseren en te isoleren met betrekking tot hun celcyclusstatus en positie binnen het steroid in vergelijking met 2D-celcultuur. Het 3D OID-model herstelt de biologie van kanker in vivo omdat het de tumorarchitectuur en zijn micro-omgeving nabootst Door spheros te koppelen met flowcytometrie en beeldvormingstechnieken. Deze methode kan cruciale vragen in het kankerveld beantwoorden, zoals hoe de tumormicro-omgeving de gevoeligheid voor geneesmiddelen, celmotiliteit en proliferatie verandert.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het een realtime visualisatie van de celcyclus mogelijk maakt en het mogelijk maakt om levende cellen te zuiveren uit een specifiek steroidgebied, wat aantoont dat de procedure zal worden uitgevoerd. Een scherp, een onderzoeksassistent van ons laboratorium Begin met het voorbereiden van de 3D-steroidvorming door 1,5% aros gedurende drie tot vijf minuten intermitterend in een magnetron te verwarmen in 100 milliliter Hank's balans zout oplossing of HBSS. Draai vervolgens onmiddellijk 100 microliter van de aros-oplossing in elke put van een platte bodem 96-wels weefselkweekplaat. Incubeer de plaat gedurende een uur op kamertemperatuur om de aros te laten stollen.
Verwijder vervolgens een 80% confluente celcultuur van melanoomcellen die de FCI-constructies tot expressie brengen uit de celkweekincubator. Was de cellen met 10 milliliter HBSS. Voeg 1,5 milliliter 0,05% in EDTA toe en incubeer vervolgens de cellen gedurende ongeveer twee minuten bij 37 graden Celsius.
Zodra de cellen zijn losgemaakt, suspendeer ze in 10 milliliter celkweekmedium. Tel de cellen handmatig met een hemocytometer en omgekeerde microscoop en verdun ze tot 25.000 cellen per milliliter in celkweekmedium. Pipetteer vervolgens 200 microliter van de celsuspensie om elke put van de 96-wels aros-plaat te bedekken.
Incubeer de plaat gedurende ongeveer drie dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om celsferoïden te vormen. Na incubatie worden de sferoiden geïmageed op een omgekeerde microscoop met behulp van een Forex-objectief en een fasecontrastfilter. Sferoïden zouden moeten verschijnen als compacte, ongeveer sferische celaggregaten om de celsteroid voor sectie en beeldvorming voor te bereiden.
Gebruik een enkele milliliter pipet om ze naar een falconbuis te verplaatsen. Laat vervolgens het steroid op de bodem van de kegel bezinken. Verwijder vervolgens het medium door middel van zuiging en fixeer vervolgens de sferoiden door ze gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur in 10% neutraal gebufferde formine te incuberen.
SP kan vervolgens in HBSS bij vier graden Celsius gedurende enkele dagen worden bewaard na sectie en beeldvorming van de cel. Open de beeldanalysesoftware en kies de configuratie voor kwantificering alleen. Maak vervolgens een nieuwe bibliotheek aan en importeer het sferische confocale beeldbestand door het ruwe databestand naar de bibliotheek te slepen.
Ga vervolgens naar het meettabblad om een beeldanalyseprotocol te bouwen door opdrachten in de juiste volgorde in het protocolvenster te slepen en te neerzetten. Om objecten in het groene kanaal te vinden, sleept u de opdracht objecten vinden uit de sectie vinden naar het protocolvenster en selecteert u het juiste kanaal. Voeg een open opdracht toe die onder verwerking is te vinden en voeg vervolgens een aparte opdracht voor aanrakende objecten toe om de cellen te scheiden.
Voeg vervolgens vanuit het filtergedeelte objecten toe en sluit deze uit op basis van grootte. Opdracht voor objecten kleiner dan 50 micrometer om kleine niet-cellulaire objecten uit te sluiten. Sleep vervolgens een nieuwe opdracht objecten vinden naar het protocolvenster.
Volg dezelfde stappen, selecteer het rode kanaal en pas alle volgende opdrachten toe. Zodra objecten zijn gevonden, gebruikt u de opdrachten kanaal verbergen of kanaal tonen om visueel te controleren of rode en groene objecten overeenkomen met rode en groene kernen. Indien nodig, klikt u op metingen en vervolgens op feedbackopties om het uiterlijk van de objectmaskers aan te passen.
Om gele objecten te vinden die overeenkomen met vroege S-fase cellen, gebruikt u de intersectieopdracht in de sectie combineren en kiest u rode objecten te intersecteren met groene objecten. Sluit opnieuw objecten uit door de grootte minder dan 50 micrometer. Om G een-fase cellen te identificeren, gebruikt u de aftrekkingsopdracht in de sectie combineren en kiest u geel object aftrekken van rode objecten om exclusief rode objecten te vinden.
Gelijkaardig, trekt u gele objecten af van groene objecten om exclusief groene objecten te identificeren die correleren met SG twee en MPH fase cellen voor zowel de exclusief rode als exclusief groene objecten. Verwijder niet-cellulaire objecten indien nodig door een filterpopulatieopdracht toe te passen uit het filtergedeelte met een vormfactor groter dan 0,25. Zoek vervolgens de S-sferoïde omtrek.
Gebruik een objecten zoeken opdracht uit de sectie zoeken in het groene of rode kanaal. Gebruik een gesloten opdracht uit de verwerkingssectie om de individuele cellen in één object samen te voegen. Voeg vervolgens een opdracht toe om gaten in objecten te vullen om gaten in de sfeer te vullen.
Gebruik vervolgens een fijne filter om ruis van het sferische object te verwijderen. Voltooi het vinden van de sferische omtrek door objecten uit te sluiten op basis van grootte om objecten kleiner dan 30.000 micrometer te verwijderen. Zodra alle objecten zijn gedefinieerd, voegt u afstand meten toe uit de sectie relatie om de afstand van elke OID tot de rand van de S-sferoïde omtrek te bepalen.
Dit doet u in elk van de gele, exclusief rode en exclusief groene populaties. Om de minimale afstanden van de cel tot de dichtstbijzijnde S-sferoïde rand te visualiseren, opent u het meettabblad en selecteert u feedbackopties gevolgd door relaties. Kies vervolgens afstanden tonen.
Sla ten slotte het protocol op om de door het protocol gemaakte gegevens op te slaan. Kies het item meting maken uit de meetsectie. Selecteer vervol
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert twee complementaire methoden die gebruik maken van de fluorescentie ubiquitinatie celcyclus indicator (FUCCI) naast beeldanalyse en flowcytometrie. Deze technieken zijn ontworpen om cellen te identificeren en isoleren op basis van hun celcyclusstatus binnen 3D sferoïden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
- 3D Celcultuur
Achtergrond
- 3D sferoïden bootsen tumorarchitectuur en micro-omgeving na.
- Begrip van de celcyclusstatus is cruciaal voor kankeronderzoek.
- Traditionele 2D culturen vertegenwoordigen de in vivo omstandigheden niet nauwkeurig.
- Flowcytometrie en beeldtechnieken verbeteren analysemogelijkheden.
Doel van het onderzoek
- Om cellen in verschillende celcyclusfasen te identificeren en te karakteriseren.
- Om specifieke celpopulaties van 3D sferoïden te isoleren.
- Om de impact van de tumormicro-omgeving op celgedrag te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Fluorescentie ubiquitinatie celcyclus indicator (FUCCI) voor visualisatie.
- Beeldanalyse om de celcyclusstatus te beoordelen.
- Flowcytometrie voor celisolatie.
- Bereiding van 3D sferoïden met behulp van aros in weefselkweekplaten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van inner G1 gearresteerde en outer proliferende cellen.
- Real-time visualisatie van celcyclusdynamica bereikt.
- Isolatie van levende cellen uit specifieke regio's van sferoïden gedemonstreerd.
- Inzichten in hoe de tumormicro-omgeving drugsgevoeligheid en proliferatie beïnvloedt.
Conclusies
- De methoden bieden een robuuste benadering voor het bestuderen van kankerbiologie.
- Real-time analyse verbetert het begrip van celgedrag in 3D modellen.
- Deze technieken kunnen therapeutische strategieën in kankerbehandeling informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding spatial heterogeneity in tumor spheroids enables mechanistic de-risking of target validation by linking cell cycle status to microenvironmental cues. This approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying proliferation gradients and quiescent niches relevant to drug penetration and resistance. It informs portfolio triage by identifying subpopulations most likely to drive recurrence or therapeutic escape.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping G1 arrest and proliferation to spheroid regions, clarifying pathway dependencies in hypoxic versus nutrient-rich zones.
- Operational Value: Enables isolation of live cells from defined zones for downstream functional assays, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantifiable cell cycle readouts for compound screening, ensuring assay relevance to 3D architecture.
- Operational Value: Standardizes spatial and phenotypic outputs via image analysis, improving reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling necrosis, quiescence, and proliferation gradients observed in vivo.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking position-dependent phenotypes to microenvironmental stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of microenvironmental effects on cell cycle, proceeds to screening via standardized spheroid-based assays, and supports translational research through spatially resolved biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating cell position with cell cycle phases to clarify drug response mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable red/green cell ratios in inner/outer spheroid regions, enabling compound effect tracking.
- Analytics: Provides distance-from-edge measurements and phase-specific masks as quantitative outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling oxygen/nutrient gradients that influence cancer cell phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal tracking of cell viability, gene expression, or drug response across multiple spheroid generations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through spatial resolution of proliferation and quiescence, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization and scalability via semi-automated image analysis and flow cytometry isolation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by de-risking targets based on microenvironmental responsiveness.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds that penetrate quiescent niches or target cycling cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FUCCI transduction, spheroid culture, and confocal imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy and image analysis software capable of channel segmentation and morphometric filtering.
- Necessitates standardization across cell lines and matrix conditions for reproducible spheroid formation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-melanoma or stromal co-culture systems.
- Limited by sectioning depth and signal penetration in larger spheroids, affecting core region resolution.
