Beeldverwerking en flowcytometrie-gebaseerde analyse van de Cel standpunt en de celcyclus in 3D Melanoom Sferoïden

Het algemene doel van deze methode is om cellen uit een multicellular steroid te identificeren, te karakteriseren en te isoleren met betrekking tot hun celcyclusstatus en positie binnen het steroid in vergelijking met 2D-celkweek. Het 3D OID-model recapituleert de biologie van kanker in vivo, aangezien het de tumorarchitectuur en de micro-omgeving ervan nabootst. Door sferoïden te combineren met flowcytometrie en beeldvormingstechnieken, kan deze methode cruciale vragen in het kankeronderzoek beantwoorden, zoals de wijze waarop de tumormicro-omgeving de gevoeligheid voor medicijnen, celmotiliteit en proliferatie beïnvloedt.

Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het real-time visualisatie van de celcyclus mogelijk maakt en de zuivering van levende cellen uit een specifieke steroïde regio toelaat. Ter demonstratie van de procedure zal een onderzoeksassistent uit ons laboratorium de voorbereidingen treffen voor de vorming van 3D-steroïden door 1,5% agarose in 100 milliliters Hank's balanced salt solution (HBSS) drie tot vijf minuten in de magnetron te verhitten, waarbij de fles af en toe wordt geschud om te garanderen dat de agarose volledig is opgelost. Pipetteer vervolgens onmiddellijk 100 µL van de agarose-oplossing in elke put van een 96-well tissue culture plate met een platte bodem. Incubeer de plaat één uur bij kamertemperatuur om de agarose te laten stollen.

Verwijder vervolgens een celkweek van melanomcellen die de FCI-constructen tot een confluentie van 80% tot expressie brengen uit de celkweekincubator. Was de cellen met 10 milliliters HBSS. Voeg 1,5 milliliters 0,05% EDTA toe en incubeer de cellen vervolgens gedurende ongeveer twee minuten bij 37 graden Celsius.

Zodra de cellen zijn losgekoppeld, worden ze gesuspendeerd in 10 milliliter celkweekmedium. Tel de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer en een omgekeerde microscoop en verdun ze tot 25 000 cellen per milliliter in celkweekmedium. Pipetteer vervolgens 200 microliter van de celsuspensie over elke put van de 96-wells aros-plaat.

Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ongeveer drie dagen om celsferoïden te vormen. Beeld na incubatie de sferoïden af met een geïnverteerde microscoop met een Forex-objectief en een fasecontrastfilter. De sferoïden moeten verschijnen als compacte, ruwweg bolvormige celaggregaten om de celsferoïde voor te bereiden op sectiebehandeling en beeldvorming.

Gebruik een pipet van één milliliter om ze over te brengen naar een falcon-buis. Laat het steroïde vervolgens bezinken op de bodem van de conische buis. Verwijder daarna het medium via vacuümsuictie en fixeer de sferoïden door ze gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur te incuberen in 10% neutraal gebufferde formaline.

SP kan vervolgens in HBSS bij vier graden Celsius gedurende enkele dagen worden bewaard na het doorsnijden en afbeelden van de cel. Open de software voor beeldanalyse en kies de configuratie voor enkel kwantificering. Maak vervolgens een nieuwe bibliotheek aan en importeer het confocale beeldbestand van de sferoïde door het rawdata-bestand naar de bibliotheek te slepen.

Ga vervolgens naar het tabblad met metingen om een protocol voor beeldanalyse op te stellen door commando's in de juiste volgorde naar het protocolvenster te slepen. Om objecten in het groene kanaal te vinden, sleept u het commando 'find objects' uit de sectie 'finding' naar het protocolvenster en selecteert u het juiste kanaal. Voeg een 'open'-commando toe, te vinden onder 'processing', en voeg vervolgens een apart commando 'touching objects' toe om de cellen te scheiden.

Voeg tenslotte in het filtergedeelte een commando toe om objecten op basis van grootte in of uit te sluiten. Stel een commando in voor objecten kleiner dan 50 µm om kleine niet-cellulaire objecten uit te sluiten. Sleep vervolgens een nieuw 'find objects'-commando naar het protocolvenster.

Volg dezelfde stappen, selecteer het rode kanaal en pas alle daaropvolgende commando's toe. Zodra de objecten zijn gevonden, gebruikt u de commando's 'kanaal verbergen' of 'kanaal tonen' om visueel te controleren of de rode en groene objecten overeenkomen met de rode en groene kernen. Klik indien nodig op 'metingen' en vervolgens op 'feedbackopties' om het uiterlijk van de objectmaskers aan te passen.

Om nu gele objecten te vinden die corresponderen met cellen in de vroege S-fase, gebruikt u het commando 'intersect' in de sectie 'combining' en kiest u voor 'intersect red objects with green objects'. Sluit opnieuw objecten uit met een grootte van minder dan 50 micrometers. Om cellen in de G1-fase te identificeren, gebruikt u het commando 'subtract' in de sectie 'combining' en kiest u voor 'subtract yellow object from red objects' om uitsluitend rode objecten te vinden.

Trek op dezelfde manier de gele objecten af van de groene objecten om uitsluitend groene objecten te identificeren die correleren met SG twee en MPH-fasecellen voor zowel de uitsluitend rode als de uitsluitend groene objecten. Verwijder indien nodig niet-cellulaire objecten door een filter population-commando uit de filteringsectie toe te passen met een vormfactor groter dan 0,25. Bepaal vervolgens de S-sferoïde-omtrek.

Gebruik een 'find objects'-commando uit het gedeelte 'finding' in zowel het groene als het rode kanaal. Gebruik een 'closed'-commando uit het gedeelte 'processing' om de individuele cellen samen te voegen tot één object. Voeg vervolgens een 'fill holes in objects'-commando toe om gaten in de sfeer op te vullen.

Gebruik vervolgens een fijn filter om ruis uit het Sphero-object te verwijderen. Voltooi het bepalen van de omtrek van de sferoïde door de optie 'objecten uitsluiten op basis van grootte' te kiezen om objecten kleiner dan 30 000 micrometer te verwijderen. Zodra alle objecten zijn gedefinieerd, voegt u 'afstanden meten' toe vanuit de bijbehorende sectie om de afstand van elke OID tot de rand van de S-sferoïde-omtrek te bepalen.

Voer dit uit voor elk van de gele, uitsluitend rode en uitsluitend groene populaties. Om de minimale afstanden van de cel tot de dichtstbijzijnde rand van de S-sferoïde te visualiseren, opent u het tabblad met metingen en selecteert u feedbackopties, gevolgd door relaties. Kies vervolgens voor toon afstanden.

Sla ten slotte het protocol op om de door het protocol gecreëerde gegevens te bewaren. Kies het item make measurement in het gedeelte measurement. Selecteer vervolgens om de gegevens te interpreteren het measurement-item, ga naar het tabblad analysis in het gedeelte measurement en kies Analyze onder het analysis-menu om de cellen te tellen die zich op een bepaalde afstand van de rand van het steroïde bevinden.

Maak een filter door 'filter' te selecteren in het tabblad analyse. Toon bijvoorbeeld alleen gegevens waarbij de afstand tot de rand van de sfeer minder dan 100 microns is. Om de ruwe gegevens te exporteren, selecteert u 'export' in het tabblad bestand en slaat u de gegevens vervolgens op als kommagescheiden of tab-beperkte tekst.

Deze gegevens kunnen worden geopend in een spreadsheetprogramma voor verdere analyse. Celsferen gegenereerd uit C 8 1 16 1. Humane melanomcellen die waren getransduceerd met het Fuji-systeem werden gefixeerd en in coupes gesneden.

Er werd confocale beeldvorming uitgevoerd voor AZA green, dat cellen in de S- en M-fase van de celcyclus markeert, en Berra orange, dat cellen in de G1-fase markeert. Wanneer deze beelden over elkaar worden gelegd, kunnen belangrijke kenmerken, zoals een necrotische kern, zoals verwacht worden waargenomen. Rode G1-gearresteerde cellen overheersen dichter bij deze necrotische kern, terwijl rode en groene prolifererende cellen in een gradiënt toenemen richting de buitenrand van het sferoïde, waar de toegang tot zuurstof en voedingsstoffen het grootst is.

Na semi-geautomatiseerde beeldanalyse kunnen de fucci-celmaskers en de omtrek van de S-sferoïde worden gedefinieerd. Beeldverwerkingssoftware werd gebruikt om de rode en groene cellen in de binnenste of buitenste regio van de S-sferoïde te kwantificeren. Deze analyse toonde aan dat cellen die zijn gearresteerd in de G1-fase verrijkt zijn in de binnenste regio, terwijl prolifererende cellen overheersen dichter bij de rand van de sferoïde.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één tot twee weken worden uitgevoerd, een tijdsbestek dat het kweken van het organoïde, de beeldvorming en de analyse omvat. Na deze procedure kunnen de organoïden in een collageenmatrix worden geïmplanteerd en vervolgens via TimeLapse-microscopie worden afgebeeld. Ze kunnen vervolgens worden onderworpen aan eiwit- of RNA-analyse, wat kan helpen bij het beantwoorden van vragen zoals of de positie in het organoïde en de toegang tot zuurstof en voedingsstoffen de fenotypes van kankercellen kunnen veranderen.