Name: Simultane twee-foton In Vivo Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Leer chronische in vivo twee-fotonmicroscopie van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen. Deze methode combineert craniotomie met AAV-injectie voor langetermijnmonitoring van structurele plasticiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag M. Steczkowski bedanken voor stemopnames, M. Borczyk voor tekeningen, A. Trąbczyńska voor virus productie, M. Ziókowska voor genotypering en A. Mirgos voor hulp bij het filmen. KR erkent de vriendelijke gift van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) tot expressie mCherry fluorescerend eiwit onder de controle van CaMK promoter van K. Deisseroth. Dit project werd uitgevoerd bij de kernfaciliteiten van Laboratorium diermodellen en Laboratorium voor Tissue Structure and Function, Centrum voor Neurobiologie, Nencki Institute of Experimental Biology uitgevoerd, met het gebruik van de CEPT de infrastructuur door de Europese Unie wordt gefinancierd - het Europees Fonds voor Regionale ontwikkeling binnen het operationeel programma &quot;innovatieve economie&quot; voor de periode 2007-2013. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00.861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00.691 tot KR en Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

Alle hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door Lokale Ethische Commissie aan de Nencki Institute of Experimental Biology, Poolse Academie van Wetenschappen. Opmerking: Sommige van de scènes in de bijbehorende video worden versneld. Snelheid factor wordt aangegeven in deze scènes. 1. chirurgie voorbereiding <ol><li> Steriliseren alle gereedschappen, glazen verpakkingen voor vloeistoffen en wattenstaafjes in de autoclaaf. Gebruik overbodig handschoenen. Reinig de operatietafel, het stereotactische frame en de omgeving met 70% ethanol. Gebruik een steriele chirurgische pad naar een steriele ruimte te creëren voor de gesteriliseerde apparatuur. Snijd gelfoam in kleine stukjes en week ze in een steriele zoutoplossing. Let op: Volgens de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren, ethanol is noch een sterilisatiemiddel, noch een hoog niveau ontsmettingsmiddel. Het mag alleen worden gebruikt als een reiniging / ontvetting agent op eerder gesteriliseerde oppervlakken. </li><li> Zet het dier the inductie kamer en stelt de isofluraan niveau 5% en zuurstoftoevoer tot 2 l / min. Deze procedure duurt ongeveer 3 minuten. </li><li> Neem het dier uit de inductie kamer. Gebruik tail of teen knijpt om te verzekeren dat het dier volledig verdoofd. </li><li> Met een nauwkeurige trimmer scheren het haar van de rug van de kop (tussen de oren) tot aan de ogen. </li><li> Plaats het dier in de stereotaxische frame en stabiliseert de kop met oor bars. </li><li> Stel anesthesie niveaus 1,5-2% isofluraan en 0,3 l / min zuurstof. </li><li> Breng de oogzalf. </li><li> Injecteer het dier subcutaan Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) en Baytril (5 mg / kg) ter voorkoming van ontsteking, pijn en infectie, respectievelijk. </li><li> Injecteer het dier intramusculair met dexamethason (0,2 mg / kg) aan hersenen zwelling te voorkomen. Opmerking: Het is mogelijk dexamethason subcutaan injecteren of intraperitoneaal spierschade voorkomen. </li><li> Reinig de huid met behulp van sterile wattenstaafjes met Betadine, gevolgd door 70% ethanol. </li><li> Verander de handschoenen en spuit ze met 70% ethanol. Opmerking: Tijdens het gebruik van wegwerphandschoenen hoeft het steriele veld niet aan. Raak het dier alleen met de toppen van steriele chirurgische instrumenten en steriele wattenstaafjes. </li></ol> 2. Cranial Window Surgery <ol><li> Til de huid met een tang via micro schaar incisie de huid horizontaal langs de basis van de kop en vervolgens schuin naar voren punt tussen de ogen. Verwijder de huid flap. </li><li> Toepassen lidocaïne zalf met een steriel wattenstaafje over de periosteum overmatig bloeden en pijn te voorkomen. </li><li> Gebruik steriele wattenstaafjes of een scalpel aan het beenvlies te verwijderen. Droog de schedel met steriele wattenstaafjes. </li><li> Met behulp van een steriele naald toepassen dichte cyanoacrylaat lijm op de huid randen te immobiliseren en te voorkomen dat het contact met tandheelkundig cement. Wacht tot de lijm te drogen. </li><li> Leg een steriele 3 mm dekglaasje op tHij schedel naar voren om de lambdoïde hechtdraad. Centreer het dekglaasje bij RSC coördinaten: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Mark de dekglaasje randen door krabben de schedel oppervlak met een steriele naald. Zet het dekglaasje terug in de steriele container met 70% ethanol. </li><li> Gebruik een high-speed tandheelkundige boor met kleine diameter braam een ​​cirkel met een diameter van 3 mm te schetsen. Maak de boorlocatie van het bot stof met een steriele zoutoplossing gedompeld swabs. Gebruik de Gelfoam en swabs om de occasionele bloeden te stoppen en het reinigen van de bot. </li><li> Tussen het boren te controleren op het bot dikte met fijne tang door zachtjes aanraken van de bot cirkel en het controleren van de mobiliteit. Houd in gedachten dat het bot dikker is op gebied van de hechtdraad&#39;s. Stop met het boren wanneer het bot cirkel mobiel is en slechts een gelijkmatige, dunne laag van het bot is links op de omtrek. Maak de operationele gebied van alle resterende bot stof met een zoutoplossing gedompeld swabs. </li><li> Laat de steriele zoutoplossing op het boren gebied, die het geboorde circle. Wrik voorzichtig het bot cirkel met fijn pincet en dan zachtjes maar stevig op het bot te verwijderen door naar boven te tillen. Wees voorzichtig het bot cirkel niet te scheef terwijl het opheffen van om mogelijke schade aan de dura te voorkomen. </li><li> Voorzichtig toe te passen de gelfoam gedrenkt in steriele zoutoplossing op de dura te helpen stoppen met het bloeden. Wacht tot alle bloeden volledig is gestopt. Haal de gelfoam niet om het stollingsproces verstoren. Opmerking: De hechtdraad gebied is zeer gevasculariseerde, zodat de bloeding op dit punt kunnen blijken diepgaand te zijn. Het is essentieel om te wachten op het wachten tot het bloeden stilstaan. Het is nuttig om de zoutoplossing gedrenkte Gelfoam gekoeld door het op ijs te houden. </li></ol> 3. Virusinjectie <ol><li> Bevestig de infuuspomp aan de stereotactische toren en sluit de controller. </li><li> Steek de 35G naald in de spuit. Spoel de injectiespuit 10 maal met ethanol te steriliseren en 10 maal met steriele zoutoplossing om sporen te verwijderen ethanol. Verwijder luchtbellen uit de spuit. Breng de spuit in de pomp. Opmerking: Overweeg het gebruik van andere desinfectiemiddelen. </li><li> Ontdooi een enkele dosis van rAAV2 / 1 mCherry bereiding (10 12 pfu wordt aanbevolen) en houd het op ijs. Vul de spuit met de virusoplossing. </li><li> Centreer de naald op de bregma en vervolgens voorzichtig te voegen in de hippocampus met de volgende coördinaten: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Deze coördinaten worden in de buurt van de rand van de craniotomie. Wacht 5 minuten om het weefsel te stabiliseren. </li><li> Injecteer 0,7 ul van de rAAV2 / 1 mCherry oplossing met een snelheid van 50 nl / min. Wacht 10 min voor het virus volledig te adsorberen. Verwijder voorzichtig de naald. Blot met gelfoam als bloeden optreedt. Herhaal dit met de contralaterale website. </li></ol> 4. Cranial Window Implantatie <ol><li> Leg de steriele, gedroogd dekglaasje op de top van de dura in de geboorde cirkellijst. Houd de dekglaasje met de krachteeps om voorzichtig plat de dura en breng coverglass &#39;randen dichter bij de schedel oppervlak. Opmerking: Het is mogelijk dat de dekglaasje verstoort het stolsel en het bloeden hervat. Als dat het geval is, tilt u de dekglaasje, plaats hem in alcohol, droog en terug te keren naar stap 2.9. </li><li> Met behulp van een steriele naald gelden de dichte cyanoacrylaat lijm op de dekglaasje randen om ze te hechten aan de schedel. Wacht tot de lijm te drogen. </li><li> Plaats een fixatiesteunen (M2 bout of een custom made ontwerp) in het voorste deel van de schedel. Breng de cyanoacrylaat lijm over de randen van de bar. Wacht tot de lijm te drogen. <ol><li> Plaats de fixatie bar in een positie die horizontaal positioneren van de craniale venster bij beeldvormend sessie mogelijk. Plaats deze zo ver mogelijk van het venster. Als het te dicht bij het raam is geplaatst, kan de bar en de schroef te verbinden met de op maat gemaakte houder zich voordoen als een obstakel voor het doel tijdens het beeldvormingsproces. </li></ol></li><li&gt; Bereid de tandheelkundige acryl en toe te passen op de schedel oppervlak rond het glas. Het is nuttig om een ​​krater-achtige vorm rond het venster vormen. Het zal een holte voor het water later aangevraagd voor beeldvorming, met als doel water te creëren. </li><li> Maak een pet met de tandheelkundige acryl, die de rest van de operationele omgeving, de huid randen, fixatie bar, de versterking van de krater rond de craniale venster. Wacht tot het tandheelkundig cement uitharden. </li><li> Verwijder het dier uit de stereotaxische frame en zet het in het herstel kamer. </li><li> Wacht totdat het dier herstellen van de operatie met inachtneming van de fysiologische functies. </li><li> Toepassen postoperatieve analgesie (carprofen, 10 mg / kg) en behandeling met antibiotica (Baytril, 5 mg / kg) gedurende 48 uur. </li></ol> 5. Imaging <ol><li> Start de Ti: Sapphire laser, de macht van de microscoop. Het systeem dat in dit experiment is uitgerust met een twee-foton laser OPO systeem en dubbele GaAsP PMT. </li><li> Zet het dier in de inductie kamer en induceren anesthesie. </li><li> Verwijder het dier uit de inductie kamer en plaats in de gas anesthesie masker onder de microscoop. Verlaag de zuurstoftoevoer naar 0,3 l / min en de isofluraan concentratie 1,5-2%. </li><li> Bevestig het dier aan de aangepaste microscoop frame met een M2 schroef (of een ander aangepast systeem). Niveau van de craniale venster. Opmerking: Het is mogelijk om het hoofd fixatie de microscoop fabrikant systeem, hoewel het specifieke custom lijst geeft betere resultaten (verhoogde schuimkraag stabiliteit constante positionering in meerdere sessies chronisch experiment). </li><li> Met de groothoek microscoop instellingen en lage vergroting doelstelling center het uitzicht op een van de zijden van de retrospleniale cortex en focussen op het dekglaasje oppervlak. </li><li> Breng een druppel water in de krater-achtige acryl ook. Overschakelen naar een lange afstand water immersie objectief. Verplaats het doel de richting van de craniale venster totdat het water meniscus connects het monster en objectief. </li><li> Schakel over naar twee-foton instellingen en beginnen met het scannen van het monster boven naar beneden met de laagste zoom. De oversteek van de dura mater wordt zichtbaar als een schittering van hoge niet-specifieke signaal. </li><li> Pas de microscoop acquisitie instellingen in beide kanalen (GFP en mCherry) volgens de signaalsterkte van fluorescerende cellen om het gehele dynamische bereik dekken. </li><li> Na het vinden van een geschikte neuron (met de dendritische boom gescheiden van andere cellen) uitvoeren van een eerste scan met alleen de GFP filterset met de laagste zoom en z-afstand van 5 micron. </li><li> Zorg voor een maximale projectie van de gescande stack en print het voor annotaties (met behulp van omgekeerde kleuren). </li><li> Stel zoom in op een waarde die het mogelijk maakt om het beeld van de gewenste morfologische details. Het imago van de gehele dendritische boom in het GFP en mCherry kanalen met een maximale projectie als gids. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

De auteurs (KL, MR, KR) rechten hebben voor patent pending (PL410001) voor Holder kader gebruikt in dit artikel.

In het huidige artikel presenteren we een protocol voor simultane twee-foton in vivo beeldvorming van de synaptische ingangen en postsynaptische targets in RSC door een craniale raam. De implantatieprocedure bestaan ​​uit een aantal belangrijke stappen. Eerst wordt het dier verdoofd en diep in de stereotactische raamwerk aangebrachte vervolgens de schedel over RSC verdund met een boor langs de gemarkeerde cirkellijnen en de cirkelvormige bot wordt verwijderd. Nadat het bloeden is gestopt, wordt de rAAV2 / 1 <su...

Twee-foton microscopie een revolutie in de observatie van de hersenactiviteit in levende en gedragen dieren. Sinds de introductie in 1990 al snel aan populariteit gewonnen en wordt nu geïmplementeerd als een van de meest interessante en innovatieve benaderingen in de richting van het onderzoek van een groot aantal aspecten van de hersenactiviteit in vivo 1,2. Deze toepassingen omvatten metingen van de bloedstroming, neuronale activering (bijvoorbeeld met behulp van calcium niveau-indicatoren of onmiddellijke vroege genen expressie) en de morfologie van neuronale cellen. Steeds laboratoria twee-foton microscopen, waarmee de techniek gehele wetenschap als een nieuwe standaard voor in vivo beeldvorming van de hersenen. De standaard aanpak omvat de implantatie van het craniale venster (een rond gat in de schedel bedekt met een deksel glas) over het vat of de visuele cortex van de hersenen van muizen 3. Volgende, afhankelijk van de experimentele protocol, het mouse ondergaat een reeks visualisatie en gedragsmatige trainingen, zodat de veranderingen in de hersenactiviteit en neuronale morfologie tijd 4,5 volgen. In beide gevallen craniotomie alleen invloed op de pariëtale botten, zonder over de hechtingen. Het is grotendeels aangenomen dat de belangrijkste nadeel van deze techniek is de beperkte toepassing er eenvoudig cortex als het vat of visuele cortex. Implantatie van het craniale raam over andere gebieden vormt veel moeilijkheden vanwege overmatig bloeden en / of ruimtelijke belemmering. In dit artikel stellen we de inplanting van de craniale raam boven de retrospleniale cortex (RSC) als een andere mogelijke regio van belang voor twee-foton in vivo microscopie 6. RSC is een belangrijk onderdeel van de hersenen circuit verantwoordelijk voor ruimtelijke geheugenvorming. Anatomisch, RSC is een onderdeel van een neuronaal netwerk tussen corticale, hippocampus en thalamus regio&#39;s 7. Het issterk betrokken bij een reeks van gedrag, zoals ruimtelijke leren en uitsterven, evenals ruimtelijke navigatie 6. Om de morfologische veranderingen van de neuronen te visualiseren gebruiken we een transgene muis tot expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) onder de thy1 promoter. In deze muizen wordt GFP tot expressie gebracht in ongeveer 10% van de neuronen in de hersenen waardoor duidelijke visualisatie van de corticale axons en dendrieten behulp van twee-foton microscopie 8. Een andere innovatie die we voorstellen is de injectie van een recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 2/1 (rAAV2 / 1) codeert een rood fluorescerend eiwit (mCherry) onder een neuron-specifieke promoter 9 CaMKII in de diepere structuren van de hersenen projecteert RSC zoals de hippocampus. De expressie van rAAV2 / 1 mCherry in de hippocampus van Thy1-GFP muis maakt gelijktijdige visualisatie van pre- en postsynaptische elementen van de Hippocampo-Cortical synapsen 10. De rAAV-gestuurde expressie van mCherry vereist twee tot drie weken voor het eiwit voldoende niveau te bereiken in het axonale terminals. Deze periode is niet ongebruikelijk vereiste tijd voor herstel van craniotomie.

<table><tbody><tr><td>Drug</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pre-operatief</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1,5-2% tijdens operatie</td></tr><tr><td>Dexametason</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0,2 mg/kg intramusculair</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2,50%</td><td>5 mg/kg subcutaan</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subcutaan</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg subcutaan</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg subcutaan</td></tr><tr><td>Lidocaïne</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topisch</td></tr><tr><td>Lidocaïne</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>topisch</td></tr><tr><td>Chirurgie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan tandheelkundig; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topisch</td></tr><tr><td>CA-lijm</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Tandheelkundig acryl</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactisch frame</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Gereedschap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm diameter</td></tr><tr><td>Tandboor</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixatiestange</td><td>Op maat gemaakt</td><td>N/A</td><td>M2 of M3 schroefmoeren kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Microschaar</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvorming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Houderframe</td><td>Op maat gemaakt</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Twee-foton microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Lasereenheid: Coherent Chameleon 690-1040nm met Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectieven: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 en LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detectie: Zeiss bandpassfilters BP 500-550 (GFP) en BP 570-610 (mCherry) gescheiden door een beam splitter op 560nm en gekoppeld aan twee GaAsP fotodetectoren.&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>cadeau van K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) dat fluorescent eiwit mCherry tot expressie brengt onder controle van CaMK-promotor</td></tr></tbody></table>

simultane twee-foton<em&gt; in vivo</em&gt; beeldvorming van synaptic in- en postsynaptische doelen op mouse retrospleniale cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex (RSC) van muizen mogelijk maakt met behulp van in vivo twee-fotonmicroscopie in de Thy1-GFP transgene muizenlijn. Deze aanpak creëert een mogelijkheid om de correlatie van gedragsmanipulaties met veranderingen in neuronale morfologie in vivo te onderzoeken.
De procedure voor de implantatie van een craniumvenster werd beschouwd als beperkt tot de gemakkelijk toegankelijke cortexgebieden zoals het barrelveld. Onze aanpak maakt visualisatie van neuronen in de sterk gevasculariseerde RSC mogelijk. RSC is een belangrijk element van de hersencircuit verantwoordelijk voor ruimtelijk geheugen, dat eerder als problematisch werd beschouwd voor in vivo twee-fotonbeeldvorming.
De implantatie van het craniumvenster over de RSC wordt gecombineerd met een injectie van mCherry-expresserend recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAVmCherry) in de dorsale hippocampus. Het uitgedrukte mCherry verspreidt zich naar axonale projecties van de hippocampus naar de RSC, waardoor visualisatie van veranderingen in zowel presynaptische axonale boutons als postsynaptische dendritische stekels in de cortex mogelijk wordt.
Deze techniek maakt langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in de RSC mogelijk.

De expressie van GFP in een subset van neuronen in de Thy1-GFP reporter muis maakt in vivo beeldvorming van de corticale dendrieten en lokale axonale projecties RSC. Figuur 1A toont maximale projectie van een stapel van beelden met meerdere GFP-positieve dendrieten toegankelijk. De cel lichaam wordt verduisterd door een slagader. Figuur 1B toont een enkel vlak ingezoomd beeld (digitale zoom 3x) van de dendritische tak aangegeven in 1A. Details v...

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Alle hieronder beschreven experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Lokale Ethische Commissie van het Nenscki Institute of Experimental Biology van de Poolse Academie van Wetenschappen. Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van de muis mogelijk maakt met behulp van in vivo twee-foton microscopie in de thi one-G of feet transgene lijn. Deze aanpak is gecombineerd met de injectie van een mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus, AAV, in de dorsale hippocampus.In combinatie maken deze technieken langetermijnmonitoring mogelijk van ervaren afhankelijkheid en structurele plasticiteit in de retrospleniale cortex. In dit artikel stellen wij de implantatie van het craniële venster boven de retrospleniale cortex voor als een mogelijke regio van interesse voor twee-foton in vivo microscopie. Om de morfologische veranderingen in neuronale structuren te visualiseren, gebruiken we thi one-G B-muizen met expressie van fluorescent GFP-eiwit in ongeveer 10 procent van de neuronen in de hersenen.Een andere innovatie die wij voorstellen is de injectie van een AAV, waarbij een fluorescent eiwit mCherry onder een neuron-specifieke promotor tot expressie komt in de diepere structuren van de hersenen, zoals de hippocampus, om projecties van deze structuur naar de retrospleniale cortex te visualiseren. Steriliseer alle instrumenten, glazen vloeistofcontainers en wattenstaafjes in de autoclaaf. Gebruik wegwerphandschoenen.Reinig de operatietafel, het stereotactisch frame en de gehele omgeving met 70% ethanol. Gebruik een steriel operatieveld om een steriele ruimte te creëren voor alle gesteriliseerde instrumenten. Snijd gel-foam in kleine stukjes en week deze in steriele zoutoplossing.Plaats het dier in de inductiekamer en stel het isofluraanniveau in op 5% en de zuurstofstroom op twee liter per minuut. Deze procedure moet ongeveer drie minuten duren. Haal het dier uit de inductiekamer.Gebruik knijpjes in de staart of tenen om te controleren of het dier volledig gesedeerd is. Scheer met een precieze trimmer het haar van de achterkant van de kop, tussen de oren, tot aan de ogen. Plaats het dier in het stereotactische frame en stabiliseer de kop met oorstaven.Stel de anesthesieniveaus in op 1,5 tot 2% isofluraan en 0,3 liter per minuut zuurstof. Breng de oogzalf aan. Injecteer het dier subcutaan met tolfedine, 4 mg/kg, butomorfine, 2 mg/kg, en Baytril, 5 mg/kg om respectievelijk ontsteking, pijn en infectie te voorkomen.Injecteer het dier intramusculair met dexamethason, 0,2 mg/kg, om hersenzwelling te voorkomen. Reinig de huid met steriele wattenstaafjes met betadine, gevolgd door 70% ethanol. Verschoon de handschoenen en bespuit deze met 70% ethanol.Til de huid op met een pincet en maak met microscharen een horizontale incisie in de huid langs de basis van de kop en vervolgens een schuine incisie naar het frontale punt tussen de ogen. Verwijder de huidflap. Breng lidocaïne-zalf aan op het periosteum met een steriel wattenstaafje om overmatig bloeden en pijn te voorkomen.Gebruik steriele wattenstaafjes of een scalpel om het periosteum te verwijderen. Droog de schedel af met steriele wattenstaafjes. Breng met een steriele naald een dichte cyanoacrylaatlijm aan op de huidranden om deze te immobiliseren en verder contact met tandcement te voorkomen.Wacht tot de lijm is gedroogd. Plaats een steriel dekglas van drie millimeter over de schedel, anterieur ten opzichte van de lambdoide naad. Centreer het dekglas op de retrospleniale coördinaten: anterieur, posterior bregma -2,8, mediaal lateraal bregma 0.Markeer de randen van het dekglas door met een steriele naald in het oppervlak van de schedel te krassen. Plaats het dekglas terug in de steriele container met 70% ethanol. Gebruik een hogesnelheids tandartsboor met een kleine diameter frees om een cirkel van drie millimeter diameter uit te steken.Reinig de boorplaats van het botstof met steriele wattenstaafjes gedrenkt in zoutoplossing. Gebruik het gel-schuim en de wattenstaafjes om incidentele bloedingen te stoppen en het bot te reinigen. Controleer tussen het boren door de botdikte met een fijne pincet door voorzichtig de botcirkel aan te raken en de mobiliteit ervan te controleren.Houd er rekening mee dat het bot dikker is bij de sutuurgebieden. Stop met boren zodra de botcirkel mobiel is en er slechts een gelijkmatige, dunne laag bot op de omtrek overblijft. Maak het operatieveld schoon van al het resterende botstof met wattenstaafjes gedrenkt in zoutoplossing.Breng de steriele zoutoplossing aan op het boorgebied, zodat de geboorde cirkel bedekt is. Wrik de botcirkel voorzichtig los met een fijne pincet en verwijder het bot vervolgens voorzichtig maar stevig door het omhoog te tillen. Let erop dat de botcirkel tijdens het tillen niet scheef wordt getrokken om mogelijke beschadiging van de dura te voorkomen.Breng het in steriele zoutoplossing gedrenkte gelfoam voorzichtig aan op de dura om de bloeding te stelpen. Wacht tot alle bloedingen volledig zijn gestopt. Verwijder de gelfoam zorgvuldig om het stollingsproces niet te verstoren.Let op, het hechtgebied is sterk gevasculariseerd, waardoor het bloeden op dit punt aanzienlijk kan zijn. Het is essentieel om voldoende tijd af te wachten tot het bloeden is gestopt. Bevestig de infusiepomp aan de stereotactische toren en sluit de controller aan.Plaats de naald van 35-gauge in de vulspuit. Spoel de spuit 10 keer met ethanol om deze te steriliseren en 10 keer met steriele zoutoplossing om resten ethanol te verwijderen. Verwijder luchtbellen uit de spuit.Plaats de spuit in de pomp. Bereid een enkelvoudige dosis van de AV-preparaat voor en bewaar deze op ijs. Vul de spuit met de virusoplossing.Centreer de naald op bregma en voer deze vervolgens voorzichtig in de hippocampus in met behulp van de volgende coördinaten: anterieur, posterieur -2, mediaal lateraal ±1, dorsaal ventraal -1. Deze coördinaten bevinden zich nabij de rand van het craniale domein. Wacht vijf minuten tot het weefsel is gestabiliseerd.Injecteer 0,7 µL AV-oplossing met een snelheid van 50 nL per minuut. Wacht 10 minuten zodat het virus volledig kan worden geabsorbeerd. Verwijder voorzichtig de naald.Dep met gel-schuim indien er bloedingen optreden. Herhaal dit aan de contralaterale zijde. Plaats het steriele droge dekglas bovenop de dura in het geboorde cirkelvormige frame.Houd het dekglas met de pincet vast om de dura voorzichtig plat te drukken en de randen van het dekglas dichter bij het schedeloppervlak te brengen. Breng met een steriele naald een dichte cyanoacrylaatlijm aan op de randen van het dekglas om deze aan de schedel te bevestigen. Wacht tot de lijm is opgedroogd.Plaats een fixatiebalk, anton-moer of een op maat gemaakt ontwerp in het voorste gedeelte van de schedel. Let op: de fixatiebalk moet in een positie worden geplaatst die een horizontale positionering van het schedelvenster tijdens de beeld acquisitiesessie mogelijk maakt. Breng de lijm aan over de randen van de balk.Wacht tot de lijm droog is. Let op: de fixatiebalk moet zo ver mogelijk van het venster worden geplaatst. Als deze te dicht bij het venster wordt geplaatst, kunnen de balk en de schroef die deze met de op maat gemaakte houder verbindt, een obstakel vormen voor het objectief tijdens het beeldvormingsproces.Bereid de tandheelkundige acryl voor en breng deze aan op het schedeloppervlak rondom het glas. Het is nuttig om een kraterachtige vorm rond het venster te maken. Dit creëert een holte voor het water dat later wordt aangebracht voor beeldvorming met het waterobjectief.Maak een dopje met het dentaal acrylaat, waarbij de resterende randen van de huid in het operatiegebied en de fixatiebalk worden bedekt, ter versterking van de krater rond het craniële venster. Wacht tot het dentaal cement is uitgehard. Haal het dier uit het stereotactisch frame en plaats het in de herstelkamer.Wacht tot het dier is hersteld van de operatie terwijl de fysiologische functies worden geobserveerd. Dien postoperatieve anesthesie cyroproferrin, 10 milligrams per kilogram, en antibioticabehandeling baytril, vijf milligrams per kilogram, toe gedurende 48 uur. Start de ti sapphire laser en zet de microscoop aan.Het in dit experiment gebruikte systeem is uitgerust met een tweefotonenlaser, een OPO-systeem en een dubbele galliumarsenide-gebaseerde PMT. Plaats het dier in de inductiekamer en leid de anesthesie in. Haal het dier uit de inductiekamer en plaats het onder de microscoop in het gasanesthesiemasker.Verlaag de zuurstofstroom naar 0,3 liters per minuut en de isofluraanconcentratie naar 1,52%. Fixeer het dier aan het op maat gemaakte microscoopframe met een MT-schroef of een ander op maat gemaakt systeem. Nivelleer het craniale venster. Let op: het is mogelijk om het hoofdfixatiesysteem van de microscoopfabrikant te gebruiken, hoewel het specifieke op maat gemaakte frame betere resultaten geeft, een verbeterde hoofdstabiliteit biedt en een constante positionering mogelijk maakt tijdens meerdere sessies gedurende een chronisch experiment.Centreer het beeld met de instellingen van de breedveldmicroscoop en een objectief met lage vergroting op een van de zijden van de retrospleniale cortex en stel scherp op het oppervlak van het dekglas. Breng een druppel water aan in de kratervormige acrylkuil. Schakel over naar een waterimmersie-objectief voor lange werkafstand.Beweeg het objectief naar het craniale venster totdat de watermeniscus het specimen en het objectief met elkaar verbindt. Schakel over naar de twee-fotoninstellingen en begin met het scannen van het specimen van boven naar beneden met de laagste zoom. Het kruisen van de dura mater zal zichtbaar zijn als een schittering van een hoog aspecifiek signaal.Pas de acquisitie-instellingen van de microscoop in beide kanalen, GFP en mCherry, aan op basis van de signaalsterkte van de fluorescente cellen om het volledige dynamische bereik te bestrijken. Nadat een geschikt neuron is gevonden waarbij de dendritische boom gescheiden is van andere cellen, wordt een initiële scan uitgevoerd met uitsluitend GFP-filters, ingesteld op de laagste zoom en een Z-afstand van five microns. Genereer een maximale projectie van de scanstack en print deze met geïnverteerde kleuren voor annotaties.Stel de zoom in op een waarde waarmee de gewenste morfologische details kunnen worden afgebeeld. Beeld de volledige dendritische boom af in het GFP- en mCherry-kanaal, waarbij de maximale projectie als leidraad dient. Met dit protocol is het mogelijk om herhaaldelijk zowel pre- als postsynaptische structuren in de retrospleniale cortex te monitoren.Deze aanpak kan worden toegepast bij een chronisch experiment waarbij gedragsmanipulaties worden verwacht te correleren met veranderingen in de morfologie van dendrieten, synaptische spines of presynaptische neuronen. De beeldvormingssessies kunnen met elke gewenste frequentie worden uitgevoerd, maar een tijdsinterval van 24 uur heeft de voorkeur om een adequaat herstel van het dier mogelijk te maken en het effect van anesthesie te minimaliseren. Bij correcte toepassing maakt deze techniek het mogelijk om gedurende meerdere maanden meerdere beeldvormingssessies uit te voeren.

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed,...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Source: Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates the setup and imaging process for in vivo two-photon microscopy of microglial dynamics in the hippocampal CA1 (Cornu ammonis 1) and dentate gyrus, ensuring optimal optical alignment and structural integrity assessment.

In Vivo Two-Photon Imaging of Microglial Dynamics in the Mouse Hippocampus

Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een ​​functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

We beschrijven een experimentele procedure voor het meten van neuronale activiteit door dual optische ramen boven bilaterale primaire somatosensorische corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2-foton (2 P) microscopie in vivo.

Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Leer chronische in vivo twee-fotonmicroscopie van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen. Deze methode combineert craniotomie met AAV-injectie voor langetermijnmonitoring van structurele plasticiteit.

Simultane twee-foton

Meer video's verkennen