Simultane twee-foton In Vivo Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex
March 13th, 2016
Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.
Alle experimentele procedures die hieronder worden beschreven, zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie van het Nencki Instituut voor Experimentele Biologie, Poolse Academie van Wetenschappen. Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met behulp van in vivo twee-foton microscopie in de thi een-G van voeten transgene lijn. Deze aanpak wordt gecombineerd met injectie van mCherry expresserend adeno-geassocieerd virus, AAV, in de dorsale hippocampus.
Gezamenlijk laten deze technieken langdurige monitoring toe van ervaringsafhankelijkheid, structurele plasticiteit in de retrospleniale cortex. In dit artikel stellen we voor om het schedelvenster boven de retrospleniale cortex te implanteren als niet een mogelijke regio van belang voor de twee-foton in vivo microscopie. Om de morfologische veranderingen in neuronale structuren te visualiseren, gebruiken we thi een-G van B muizen met de expressie van fluorescent GFP-eiwit in ongeveer 10 procent van de neuronen in de hersenen.
Een andere innovatie die we voorstellen is de injectie van een AAV, expressie van een fluorescente mCherry-eiwit onder een neuron-specifiek promotor in de diepere structuren in de hersenen, zoals hippocampus, om projecties van de structuur in de retrospleniale cortex te visualiseren. Steriliseer alle gereedschappen, glazen containers voor vloeistoffen en wattenstaafjes in de autoclaaf. Uw wegwerp handschoenen.
Maak de operatietafel, het stereotactische frame en alle omringende ruimte schoon met 70%ethanol. Gebruik een steriele chirurgische pad om een steriele ruimte te creëren voor alle gesteriliseerde apparatuur. Snijd het gelfoam in kleine stukjes en week ze in steriel zoutrouw.
Plaats het dier in de inductiekamer en stel het isofluraankleur op 5% en zuurstofstroom op twee liter per minuut. Deze procedure duurt ongeveer drie minuten. Haal het dier uit de inductiekamer.
Gebruik staart- of teenprikjes om ervoor te zorgen dat het dier volledig gerust is. Gebruik precieze trimmers om het haar van de achterkant van het hoofd te scheren, tussen de oren, tot aan de ogen. Plaats het dier in het stereotactische frame en stabiliseer het hoofd met oorbars.
Stel anesthesiegebieden in op 1,5 tot 2%isofluraan en nulpunt drie liter per minuut zuurstof. Breng de oogzalf aan. Injecteer het dier subcutaan met tolfedine, vier milligram per kilogram, butomidor, twee milligram per kilogram, en Baytril, vijf milligram per kilogram om ontsteking, pijn en infectie te voorkomen, respectievelijk.
Injecteer het dier intramusculair met dexamethason, nulpunt twee milligram per kilogram, om zwelling van de hersenen te voorkomen. Reinig de huid met steriele wattenstaafjes met betadine gevolgd door 70%ethanol. Verander de handschoenen en besproei ze met 70%ethanol.
Til de huid op met pincetten en gebruik microschaar om de huid horizontaal langs de basis van het hoofd in te snijden en vervolgens schuin naar de voorkant tussen de ogen. Verwijder de huidflap. Breng lidocaïne zalf aan met een steriele swab op het periosteum om overmatige bloeding en pijn te voorkomen.
Gebruik steriele wattenstaafjes of scalpel om het periosteum te verwijderen. Droog de schedel met steriele swabs. Gebruik een steriele naald om dichte cyanoacrylaatlijm aan te brengen op de huidranden om ze te immobiliseren en te voorkomen dat ze verder in contact komen met tandheelkundig cement.
Wacht tot de lijm droog is. Leg een steriele drie millimeter dekglas over de schedel vooraan tot de lambdoïde naad. Centreer het dekglas op de retrospleniale coördinaten, vooraan, achterachter bregma min-twee punt acht, mediaal lateraal bregma nul.
Markeer de randen van het dekglas door de schedeloppervlak te krassen met een steriele naald. Plaats het dekglas terug in de steriele container met 70%ethanol. Gebruik een snel draaiende tandheelkundige boor met een klein diameter boer om een cirkel met een diameter van drie millimeter te omlijnen.
Reiniging van de boorplek van het botgruis met steriele zwabbers met zoutrouw. Gebruik het gelfoam en de zwabbers om het incidentele bloeden te stoppen en het bot schoon te maken. Tussen het boren door, controleer de dikte van het bot met fijne pincetten door voorzichtig de botcirkel aan te raken en de beweegbaarheid ervan te controleren.
Houd er rekening mee dat het bot dikker is in het gebied van de naden. Stop met boren wanneer de botcirkel beweegbaar is en er alleen nog een gelijkmatige dunne laag bot over is op de omtrek. Reinig het operatieveld van al het resterende botgruis met zwabbers met zoutrouw.
Druppel steriele zoutrouw op het gebied van de boor, de geboorde cirkel bedekkend. Prik voorzichtig de botcirkel met een fijne pincet en verwijder vervolgens voorzichtig maar stevig het bot door het omhoog te tillen. Wees voorzichtig om de botcirkel niet te scheef te tillen om mogelijk schade aan de dura te voorkomen.
Breng voorzichtig het gelfoam gedrenkt in steriele zoutrouw aan op de dura om het bloeden te helpen stoppen. Wacht tot al het bloeden volledig is gestopt. Verwijder voorzichtig het gelfoam om het stollingsproces niet te verstoren.
Opgemerkt moet worden dat het naadgebied sterk gevasculariseerd is, dus het bloeden op dit punt kan aanzienlijk zijn. Het is essentieel om voldoende tijd te wachten tot het bloeden is gestopt. Bevestig de infusiepomp aan de stereotactische toren en sluit de controller aan.
Plaats de 35-gauge naald in de vulslang. Spoel de spuit tien keer met ethanol om het te steriliseren en tien keer met steriele zoutrouw om sporen van ethanol te verwijderen. Verwijder luchtbellen uit de spuit.
Plaats de spuit in de pomp. Vul een enkele dosis AV-preparaat en bewaar het op ijs. Vul de spuit met virusoplossing.
Centreer de naald op bregma en steek deze voorzichtig in de hippocampus met behulp van de volgende coördinaten: Vooraan, achteraan min-twee, mediaal lateraal plus min-een, dorsaal ventraal min-een. De
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze video toont de craniotomie-procedure voor chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen met behulp van in vivo twee-foton microscopie. De methode omvat de injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus, waardoor langdurige monitoring van structurele plasticiteit mogelijk wordt.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Structurele Plasticiteit
Achtergrond
- Chronische beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van neuronale veranderingen in de tijd.
- De retrospleniale cortex is een cruciaal gebied voor het begrijpen van ruimtelijke navigatie en geheugen.
- Twee-foton microscopie maakt hoog-resolutie beeldvorming van neuronale structuren mogelijk.
- Adeno-geassocieerde virussen worden veel gebruikt voor genoverdracht in neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om morfologische veranderingen in neuronale structuren in de tijd te visualiseren.
- Om de rol van de retrospleniale cortex in ervaringsafhankelijke plasticiteit te verkennen.
- Om een betrouwbare methode voor chronische beeldvorming in levende dieren te vestigen.
Gebruikte methoden
- Craniotomie-procedure voor toegang tot de retrospleniale cortex.
- In vivo twee-foton microscopie voor beeldvorming van neuronale activiteit.
- Injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus.
- Gebruik van Thy1-GFP transgene muizen voor visualisatie van specifieke neuronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle implantatie van een craniumraam voor beeldvorming.
- Langdurige monitoring van structurele veranderingen in de retrospleniale cortex.
- Demonstratie van ervaringsafhankelijke plasticiteit in neuronale structuren.
- Validatie van de methode voor toekomstige studies in levende diermodellen.
Conclusies
- De craniotomie en beeldvormingstechnieken bieden waardevolle inzichten in neuronale plasticiteit.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende studies die de retrospleniale cortex betreffen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methoden om andere hersengebieden te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex enables direct, longitudinal assessment of structural plasticity in a brain region critical for spatial memory. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation, especially for pathways involving hippocampal-cortical connectivity. The method's chronic imaging design positions it as a reusable platform for experience-dependent plasticity studies across discovery and preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of synaptic and dendritic structural changes in response to behavioral or pharmacological manipulations.
- Supports functional target validation by correlating morphological plasticity with specific interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking for CNS targets by providing high-resolution, longitudinal data in a disease-relevant brain region.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated in vivo imaging system for quantifying synaptic and dendritic changes over time.
- Provides reproducible, quantitative outputs suitable for screening compounds that modulate structural plasticity.
- Enables assay standardization and platform reuse for multiple CNS research programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling monitoring of experience-dependent plasticity in a region implicated in memory and cognition.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by allowing repeated, non-terminal measurements in the same animal.
- Reduces biological risk by providing predictive, longitudinal data on synaptic remodeling relevant to disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform integrates into the CNS discovery continuum from early mechanistic studies through preclinical validation, supporting both hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of synaptic and dendritic remodeling in response to defined manipulations.
- Screening: Provides quantitative, reproducible imaging outputs for compound or genetic screening in vivo.
- Analytics: Delivers high-content morphological measurements for statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting longitudinal studies in a memory-relevant brain region.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, chronic imaging workflow adaptable to diverse CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes chronic imaging procedures for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing longitudinal, quantitative data on synaptic plasticity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and interventions based on in vivo structural outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, in vivo imaging, and viral vector delivery.
- Demands access to two-photon microscopy and advanced image analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of surgical and imaging protocols.
- Adaptation to other brain regions or disease models may require protocol optimization.
- High vascularization of the retrosplenial cortex presents practical challenges for window implantation and imaging stability.
