Simultane twee-foton

Alle hieronder beschreven experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Lokale Ethische Commissie van het Nenscki Institute of Experimental Biology van de Poolse Academie van Wetenschappen. Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van de muis mogelijk maakt met behulp van in vivo twee-foton microscopie in de thi one-G of feet transgene lijn. Deze aanpak is gecombineerd met de injectie van een mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus, AAV, in de dorsale hippocampus.

In combinatie maken deze technieken langetermijnmonitoring mogelijk van ervaren afhankelijkheid en structurele plasticiteit in de retrospleniale cortex. In dit artikel stellen wij de implantatie van het craniële venster boven de retrospleniale cortex voor als een mogelijke regio van interesse voor twee-foton in vivo microscopie. Om de morfologische veranderingen in neuronale structuren te visualiseren, gebruiken we thi one-G B-muizen met expressie van fluorescent GFP-eiwit in ongeveer 10 procent van de neuronen in de hersenen.

Een andere innovatie die wij voorstellen is de injectie van een AAV, waarbij een fluorescent eiwit mCherry onder een neuron-specifieke promotor tot expressie komt in de diepere structuren van de hersenen, zoals de hippocampus, om projecties van deze structuur naar de retrospleniale cortex te visualiseren. Steriliseer alle instrumenten, glazen vloeistofcontainers en wattenstaafjes in de autoclaaf. Gebruik wegwerphandschoenen.

Reinig de operatietafel, het stereotactisch frame en de gehele omgeving met 70% ethanol. Gebruik een steriel operatieveld om een steriele ruimte te creëren voor alle gesteriliseerde instrumenten. Snijd gel-foam in kleine stukjes en week deze in steriele zoutoplossing.

Plaats het dier in de inductiekamer en stel het isofluraanniveau in op 5% en de zuurstofstroom op twee liter per minuut. Deze procedure moet ongeveer drie minuten duren. Haal het dier uit de inductiekamer.

Gebruik knijpjes in de staart of tenen om te controleren of het dier volledig gesedeerd is. Scheer met een precieze trimmer het haar van de achterkant van de kop, tussen de oren, tot aan de ogen. Plaats het dier in het stereotactische frame en stabiliseer de kop met oorstaven.

Stel de anesthesieniveaus in op 1,5 tot 2% isofluraan en 0,3 liter per minuut zuurstof. Breng de oogzalf aan. Injecteer het dier subcutaan met tolfedine, 4 mg/kg, butomorfine, 2 mg/kg, en Baytril, 5 mg/kg om respectievelijk ontsteking, pijn en infectie te voorkomen.

Injecteer het dier intramusculair met dexamethason, 0,2 mg/kg, om hersenzwelling te voorkomen. Reinig de huid met steriele wattenstaafjes met betadine, gevolgd door 70% ethanol. Verschoon de handschoenen en bespuit deze met 70% ethanol.

Til de huid op met een pincet en maak met microscharen een horizontale incisie in de huid langs de basis van de kop en vervolgens een schuine incisie naar het frontale punt tussen de ogen. Verwijder de huidflap. Breng lidocaïne-zalf aan op het periosteum met een steriel wattenstaafje om overmatig bloeden en pijn te voorkomen.

Gebruik steriele wattenstaafjes of een scalpel om het periosteum te verwijderen. Droog de schedel af met steriele wattenstaafjes. Breng met een steriele naald een dichte cyanoacrylaatlijm aan op de huidranden om deze te immobiliseren en verder contact met tandcement te voorkomen.

Wacht tot de lijm is gedroogd. Plaats een steriel dekglas van drie millimeter over de schedel, anterieur ten opzichte van de lambdoide naad. Centreer het dekglas op de retrospleniale coördinaten: anterieur, posterior bregma -2,8, mediaal lateraal bregma 0.

Markeer de randen van het dekglas door met een steriele naald in het oppervlak van de schedel te krassen. Plaats het dekglas terug in de steriele container met 70% ethanol. Gebruik een hogesnelheids tandartsboor met een kleine diameter frees om een cirkel van drie millimeter diameter uit te steken.

Reinig de boorplaats van het botstof met steriele wattenstaafjes gedrenkt in zoutoplossing. Gebruik het gel-schuim en de wattenstaafjes om incidentele bloedingen te stoppen en het bot te reinigen. Controleer tussen het boren door de botdikte met een fijne pincet door voorzichtig de botcirkel aan te raken en de mobiliteit ervan te controleren.

Houd er rekening mee dat het bot dikker is bij de sutuurgebieden. Stop met boren zodra de botcirkel mobiel is en er slechts een gelijkmatige, dunne laag bot op de omtrek overblijft. Maak het operatieveld schoon van al het resterende botstof met wattenstaafjes gedrenkt in zoutoplossing.

Breng de steriele zoutoplossing aan op het boorgebied, zodat de geboorde cirkel bedekt is. Wrik de botcirkel voorzichtig los met een fijne pincet en verwijder het bot vervolgens voorzichtig maar stevig door het omhoog te tillen. Let erop dat de botcirkel tijdens het tillen niet scheef wordt getrokken om mogelijke beschadiging van de dura te voorkomen.

Breng het in steriele zoutoplossing gedrenkte gelfoam voorzichtig aan op de dura om de bloeding te stelpen. Wacht tot alle bloedingen volledig zijn gestopt. Verwijder de gelfoam zorgvuldig om het stollingsproces niet te verstoren.

Let op, het hechtgebied is sterk gevasculariseerd, waardoor het bloeden op dit punt aanzienlijk kan zijn. Het is essentieel om voldoende tijd af te wachten tot het bloeden is gestopt. Bevestig de infusiepomp aan de stereotactische toren en sluit de controller aan.

Plaats de naald van 35-gauge in de vulspuit. Spoel de spuit 10 keer met ethanol om deze te steriliseren en 10 keer met steriele zoutoplossing om resten ethanol te verwijderen. Verwijder luchtbellen uit de spuit.

Plaats de spuit in de pomp. Bereid een enkelvoudige dosis van de AV-preparaat voor en bewaar deze op ijs. Vul de spuit met de virusoplossing.

Centreer de naald op bregma en voer deze vervolgens voorzichtig in de hippocampus in met behulp van de volgende coördinaten: anterieur, posterieur -2, mediaal lateraal ±1, dorsaal ventraal -1. Deze coördinaten bevinden zich nabij de rand van het craniale domein. Wacht vijf minuten tot het weefsel is gestabiliseerd.

Injecteer 0,7 µL AV-oplossing met een snelheid van 50 nL per minuut. Wacht 10 minuten zodat het virus volledig kan worden geabsorbeerd. Verwijder voorzichtig de naald.

Dep met gel-schuim indien er bloedingen optreden. Herhaal dit aan de contralaterale zijde. Plaats het steriele droge dekglas bovenop de dura in het geboorde cirkelvormige frame.

Houd het dekglas met de pincet vast om de dura voorzichtig plat te drukken en de randen van het dekglas dichter bij het schedeloppervlak te brengen. Breng met een steriele naald een dichte cyanoacrylaatlijm aan op de randen van het dekglas om deze aan de schedel te bevestigen. Wacht tot de lijm is opgedroogd.

Plaats een fixatiebalk, anton-moer of een op maat gemaakt ontwerp in het voorste gedeelte van de schedel. Let op: de fixatiebalk moet in een positie worden geplaatst die een horizontale positionering van het schedelvenster tijdens de beeld acquisitiesessie mogelijk maakt. Breng de lijm aan over de randen van de balk.

Wacht tot de lijm droog is. Let op: de fixatiebalk moet zo ver mogelijk van het venster worden geplaatst. Als deze te dicht bij het venster wordt geplaatst, kunnen de balk en de schroef die deze met de op maat gemaakte houder verbindt, een obstakel vormen voor het objectief tijdens het beeldvormingsproces.

Bereid de tandheelkundige acryl voor en breng deze aan op het schedeloppervlak rondom het glas. Het is nuttig om een kraterachtige vorm rond het venster te maken. Dit creëert een holte voor het water dat later wordt aangebracht voor beeldvorming met het waterobjectief.

Maak een dopje met het dentaal acrylaat, waarbij de resterende randen van de huid in het operatiegebied en de fixatiebalk worden bedekt, ter versterking van de krater rond het craniële venster. Wacht tot het dentaal cement is uitgehard. Haal het dier uit het stereotactisch frame en plaats het in de herstelkamer.

Wacht tot het dier is hersteld van de operatie terwijl de fysiologische functies worden geobserveerd. Dien postoperatieve anesthesie cyroproferrin, 10 milligrams per kilogram, en antibioticabehandeling baytril, vijf milligrams per kilogram, toe gedurende 48 uur. Start de ti sapphire laser en zet de microscoop aan.

Het in dit experiment gebruikte systeem is uitgerust met een tweefotonenlaser, een OPO-systeem en een dubbele galliumarsenide-gebaseerde PMT. Plaats het dier in de inductiekamer en leid de anesthesie in. Haal het dier uit de inductiekamer en plaats het onder de microscoop in het gasanesthesiemasker.

Verlaag de zuurstofstroom naar 0,3 liters per minuut en de isofluraanconcentratie naar 1,52%. Fixeer het dier aan het op maat gemaakte microscoopframe met een MT-schroef of een ander op maat gemaakt systeem. Nivelleer het craniale venster. Let op: het is mogelijk om het hoofdfixatiesysteem van de microscoopfabrikant te gebruiken, hoewel het specifieke op maat gemaakte frame betere resultaten geeft, een verbeterde hoofdstabiliteit biedt en een constante positionering mogelijk maakt tijdens meerdere sessies gedurende een chronisch experiment.

Centreer het beeld met de instellingen van de breedveldmicroscoop en een objectief met lage vergroting op een van de zijden van de retrospleniale cortex en stel scherp op het oppervlak van het dekglas. Breng een druppel water aan in de kratervormige acrylkuil. Schakel over naar een waterimmersie-objectief voor lange werkafstand.

Beweeg het objectief naar het craniale venster totdat de watermeniscus het specimen en het objectief met elkaar verbindt. Schakel over naar de twee-fotoninstellingen en begin met het scannen van het specimen van boven naar beneden met de laagste zoom. Het kruisen van de dura mater zal zichtbaar zijn als een schittering van een hoog aspecifiek signaal.

Pas de acquisitie-instellingen van de microscoop in beide kanalen, GFP en mCherry, aan op basis van de signaalsterkte van de fluorescente cellen om het volledige dynamische bereik te bestrijken. Nadat een geschikt neuron is gevonden waarbij de dendritische boom gescheiden is van andere cellen, wordt een initiële scan uitgevoerd met uitsluitend GFP-filters, ingesteld op de laagste zoom en een Z-afstand van five microns. Genereer een maximale projectie van de scanstack en print deze met geïnverteerde kleuren voor annotaties.

Stel de zoom in op een waarde waarmee de gewenste morfologische details kunnen worden afgebeeld. Beeld de volledige dendritische boom af in het GFP- en mCherry-kanaal, waarbij de maximale projectie als leidraad dient. Met dit protocol is het mogelijk om herhaaldelijk zowel pre- als postsynaptische structuren in de retrospleniale cortex te monitoren.

Deze aanpak kan worden toegepast bij een chronisch experiment waarbij gedragsmanipulaties worden verwacht te correleren met veranderingen in de morfologie van dendrieten, synaptische spines of presynaptische neuronen. De beeldvormingssessies kunnen met elke gewenste frequentie worden uitgevoerd, maar een tijdsinterval van 24 uur heeft de voorkeur om een adequaat herstel van het dier mogelijk te maken en het effect van anesthesie te minimaliseren. Bij correcte toepassing maakt deze techniek het mogelijk om gedurende meerdere maanden meerdere beeldvormingssessies uit te voeren.