Name: Reconstructie van Basic Mitotische Assen in Sferische emulsiedruppeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Leer hoe je mitotische spoelachtige structuren reconstitueert in water-in-olie emulsiedruppeltjes met geometrische confinement. Deze bottom-up methode onthult de assemblage en positionering van spindels in een celbiologische context.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de leden van het Dogterom-lab bedanken voor waardevolle discussies. We danken Stefan Diez en Marcel Janson voor reagentia, en Samara Reck-Peterson voor hulp bij de zuivering van dyneïne. Dit werk werd ondersteund door financiering van de European Research Council (ERC Synergy-subsidie: MODEL-CELL).

<ol><li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+spindle+positioning%3A+cortical+force+generators+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li>
<li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+divisions%2C+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li>
<li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li>
<li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers%3A+the+role+of+catastrophes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li>
<li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li>
<li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li>
<li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li>
<li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li>
<li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li>
<li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+production+by+disassembling+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li>
<li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li>
<li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li>
<li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
<li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li>
<li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+function+of+Ase1p%3A+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li>
<li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li>
<li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li>
<li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li>
<li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li>
<li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division%2C+meiotic+nuclear+oscillation%2C+and+cytokinesis+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li>
<li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cortical+Dynein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li>
<li>Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoudjou%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li>
<li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li>
<li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li>
<li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li>
<li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De werkwijzen hier beschreven onderhavige recente inspanningen om te mitotische spoelen reconstitueren in water-in-olie-emulsie druppeltjes. Studeren spileenheid binnen geometrische grenzen biedt tal van voordelen. Belangrijke terugkoppelingsmechanismen bestaan ​​tussen microtubuli van de mitotische spoel en de geometrische beperkingen waarin zij worden geassembleerd. Microtubuli kan genereren duwkrachten als ze groeien in geometrische grenzen, wat kan leiden tot mitotische spindle verplaatsing. Bovendien groeien tot een fysieke barrière kan microtubule rampen induceren. Ook kan spileenheid in een beperkte geometrie leidt tot een geleidelijke uitputting van afzonderlijke componenten, zoals tubuline, waardoor de microtubule groei 36 rechtstreeks beïnvloedt. Dit zijn allemaal essentiële determinanten van spileenheid, die kunnen worden bestudeerd met de hier beschreven bepalingen. De beschreven testen zijn zeer gevoelig voor kleine concentratie differences van de druppel componenten. Dit geldt voor tubuline, waarbij geringe concentratieverschillen kunnen tot een te laag of te snelle groei van microtubuli. In dit geval microtubule groei kan vaak nog worden gecorrigeerd door de temperatuur tijdens de eerste ~ 30 minuten van het experiment. Mitotische spoel montage en positionering is ook zeer gevoelig voor variaties in de concentratie (corticaal) kracht generators. Dit hangt waarschijnlijk af van de concentratie, zuiverheid en activiteit van de gezuiverde componenten en moet zorgvuldig worden getitreerd voor elk nieuw gezuiverd eiwit. Bovendien zijn bepaalde compromissen moeten worden gemaakt in imaging instellingen, afhankelijk van de aard van de test. Aanvankelijk hoge niveaus van oplosbare fluorescerende tubuline dimeren bemoeilijken beeld individuele microtubules. Zoals microtubuli langer groeien en oplosbare tubuline langzaam uitgeput, de signaal-ruisverhouding geleidelijk hoger en kan de beeldvorming van individual microtubules. In tegenstelling tot opstellingen met open systemen, de geometrische beperking verhindert de uitwisseling van fluorescerende moleculen en zuurstof scavenger systeemcomponenten binnen een massareservoir, wat resulteert in aanzienlijke bleking. Speciaal voor bewaking spil montage en positionering in de tijd, is het vereist om beeld met lage lichtintensiteiten, zelfs in aanwezigheid van een sterke zuurstofwegvanger systeem. Deze methoden maken het mogelijk bottom-up reconstructie van vereenvoudigde spindel-achtige structuren in vitro. Naast de genoemde componenten geïntroduceerd zijn vele andere factoren beschreven bipolaire spindle vorming, positionering, oriëntatie, vormen, enz 3 beïnvloeden. Dit systeem kan verder worden uitgebreid naar de afzonderlijke en gecombineerde effect van aanvullende kracht generatoren bestuderen. Belangrijke bijdragen aan spindel formatie die momenteel afwezig in dit systeem zijn de mitotische chromosomen. Mitotische chromatine is aangetoonddirecte vorming spindel door (1) chromokinesins die kan genereren zogenaamde polar-ejectie krachten &#39;3, (2) de vorming van een RanGTP gradiënt door de chromatine gebonden RanGEF RCC1 38, (3) kinetochoren die kunnen communiceren met (depolymeriseren ) microtubules 39 en (4) het chromatine zelf, die kan functioneren als een mechanische veer daartussen tegengestelde microtubuli 40. Tot slot, het beschreven systeem biedt momenteel beperkte ruimtelijke en temporele controle over de activiteit en de lokalisatie van introduceerde force-generatoren. In cellen, vele spileenheid factoren lokaliseren specifieke compartimenten of zijn actief binnen een beperkte tijd-venster. Een treffend voorbeeld is de activiteit van dyneine, die specifiek aan de postérieure zijde van de C. verrijkt elegans één-cellig stadium embryo asymmetrische Spilpositionering en celdeling bevorderen. In dit systeem zijn we momenteel het verkennen van de mogelijkheid van het nabootsen van een dergelijke temporal en asymmetrische activiteit met behulp van methoden geleend van opto-genetische technieken. Bovendien, zoals het geval is voor C. elegans embryo en cellen met een rigide celwand, veel cellen niet afronden in mitose. De vorm van de geometrische opsluiting zal van wezenlijk belang voor de krachten die op de as 41 hebben. Het zal dus belangrijk zijn om assemblage van de spoel en positionering in niet-sferische druppeltjes reconstrueren zo goed, mogelijk met behulp van meer complexe microfluïdische systemen die het mogelijk maken de vormgeving en opslag van emulsie druppeltjes 42,43. Tenslotte, in weefsels, cel-cel en cel-substraat signalering en bevestiging bieden externe stimuli die kunnen worden omgezet in gericht spiloriëntatie, zoals vaak waargenomen in epitheel cellen en stamcellen. Al deze gespecialiseerde aspecten geen rekening is gehouden in de huidige studie en wellicht toekomstige uitdagingen om te bouwen naar meer in vivo-achtige reconstructies van mitotische spindle assemb biedenly en positionering.

Tijdens mitose worden de chromosomen van de gerepliceerde genoom georganiseerd in de cel evenaar tot gelijke verdeling van zusterchromatiden over de nieuw gevormde dochter cellen te waarborgen. Chromosoom positionering en segregatie wordt gemedieerd door hun gehechtheid aan spindle microtubules afkomstig van twee tegengestelde centrosomes. Afgezien van het getrouwe chromosoom distributie, de oriëntatie van de mitotische spoel bepaalt eveneens de celdeling vlak 1. Gecoördineerde oriëntatie van de celdeling is van essentieel belang tijdens de vele stadia van ontwikkeling en voor het weefsel homeostase 2. Specifiek kan geregeld mitotische spoel positionering leiden tot een asymmetrische verdeling van celinhoud of zelfs produceren dochtercellen van verschillende grootte 2. Mitotische spoel assemblage en oriëntatie start in profase en wordt georkestreerd door een complex samenspel tussen samenwerkende en tegenwerken van kracht generatoren 3,4. De optredende krachten bestaan ​​uit both trekken en duwen krachten. Deze komen voort zowel spindel contacten met de cel cortex en vanuit de spil en kan worden gegenereerd door microtubule dynamiek en door moleculaire motoren en cross-linkers (figuur 1). Duwkrachten kunnen worden gegenereerd wanneer microtubuli groeien tegen rigide structuren zoals de cel cortex. Afhankelijk van de totale weerstand kracht gegenereerd binnen het systeem, kan dit leiden tot een herpositionering van de mitotische spindel (lage krachten) of triggeren microtubule knik of catastrofe (grote krachten) 5-8. De hoeveelheid kracht die kan worden opgewekt door op afhankelijk van microtubuli lengte, omdat lengte bepaalt in grote mate van microtubule-knik 9. Bovendien kan microtubules afkomstig van de ene centrosome duwen tegen elkaar centrosome, een mechanisme dat is voorgesteld om centrosoom scheiding rijden vroege profase 3,10. in addition te duwen krachten die ontstaan ​​door groeiende microtubuli, microtubule eindigt in contact brengen van de cel cortex kan ook bemiddelen trekkrachten 11. Onderzoeken van meerdere laboratoria hebben aangetoond dat de beheerste activiteit van de corticale kracht generatoren nodig voor de asymmetrische positionering van mitotische spoelen in vivo 1. Essentieel voor deze trekkrachten is-cortex gelokaliseerd cytoplasmatisch dyneine (hierna &quot;dynein &#39;), een min-end gerichte microtubule eiwit motor 8,12,13. Bijvoorbeeld in gist, laterale corticale interacties van dynein de crotubulusrooster resultaat motor-afhankelijke microtubule glijden langs de 14 cortex. Echter, corticale trekkrachten worden opgewekt door het vermogen van dynein end-on aanhangsels samen te depolymeriseren microtubuli 8. De energie van microtubule krimp kan leiden tot krachten die over het algemeen een orde van grootte hoger (~ 50 pN (referentienummer 15 </sup&gt;)) dan de krachten die ontstaan ​​door individuele motor-eiwitten (~ 7-8 PN (ref. 16)). End-on attachment van corticale dynein te depolymeriseren microtubuli stimuleert spindel positionering in gist 17 ​​en C. 13 elegans. Of beide afhankelijk van de motor te schuiven en microtubule depolymerisatie gedreven corticale trekkrachten kunnen samenwerken of elkaar uitsluiten in vivo is op dit moment onbekend. Naast de microtubule duwkrachten en dyneine gemedieerd corticale trekkrachten, wordt centrosome positionering gecontroleerd vanuit de mitotische spindel door tal van andere eiwitten. Kinesine-5 motoren bijvoorbeeld bestaan ​​tetrameren die verknopen antiparallel interpolaire microtubules, resulterend in het genereren van uitgaande schuifkrachten 18-20. Leden van het kinesine-5 motor familie zijn vereist voor centrosoom scheiding en bipolaire spileenheid in alle eukaryoten bestudeerd, met uitzondering van C. elegans<html> (besproken in referentie 21). Bovendien worden diffundeerbare vernettingsmiddelen van de ASE1 / PRC1 familie ook bekend lokaliseren overlappende gebieden van microtubule interpolaire microtubuli in vivo en in vitro 22-27. De krachten die ontstaan ​​door ASE1 aangedreven expansie van de overlappende microtubule-gebied zijn groot genoeg om kinesine-14 gemedieerde schuifkrachten tegenwicht in vitro 28,29. In de cel wordt ASE1 / PRC1 nodig voor stabiele vorming van microtubule overlappende gebieden in de spindel Midzone 25-27,30, wat suggereert dat de krachten die door diffundeerbare vernettingsmiddelen aanzienlijk kunnen bijdragen tot spil organisatie. Tenslotte krachten uit de mitotische chromatine en kinetochoren beïnvloeden mitotische spoel montage en positionering via verschillende wegen 3. Aangezien deze componenten niet tot de reconstitutie assays beschreven, worden deze niet in detail besproken. jove_content &quot;&gt; Verschillende theorieën bestaan ​​over de manier waarop de verschillende moleculaire componenten en krachten hierboven beschreven werken in assemblage van de spoel en positionering, maar we zijn nog ver verwijderd van een kwantitatief begrip. Naast experimenten in levende cellen, in vitro experimenten met gezuiverde componenten zorgen voor een krachtige route om dit doel te bereiken. Hier presenteren we een visuele gids een aangepaste en uitgebreide versie van de onlangs gepubliceerde methoden (Roth et al. 31), waarin elementaire spindels worden gereconstitueerd in water-in-olie-emulsie druppeltjes, beginnend met een minimaal aantal onderdelen. met microfluïdische technieken, worden bolvormige druppeltjes gegenereerd met afmetingen die vergelijkbaar mitotische cellen. Binnen deze druppeltjes, kunnen gezuiverd centrosomes en tubuline worden gecombineerd om microtubuli aster dynamica te bestuderen, krachtgeneratie en aster-aster interacties. By invoering van corticale (zoals dynein) en inter-polaire (zoals kinesine-5 / ASE1) force-generatoren, wereconstitueren steeds complexer spindel-achtige structuren die beginnen met de in vivo situatie lijken.

<table><tbody><tr><td>1. Preparatie van microfluïdische chips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotomasker (Fotomasker op filmsubstraat)</td><td>Selba S.A. Zwitserland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siliciumwafer (4 inch siliciumwafer p/Boron &lt;1-0-0>10-20 &Omega;-cm, 500-550 &mu;m, SSP, met 2 vlakken)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater&nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS-voorpolymeer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Coronabehandelaar</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. Microfluïdische opstelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glazen pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuumpomp</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumkamer</td><td>Kartell</td><td>Polypropyleen Vacuum Desiccator</td><td></td></tr><tr><td>Mineraaloliën</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Tensioactieve stof (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Dekvlakken</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, dikte 1,5</td></tr><tr><td>Glazen objectglazen</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Puncher</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriumafdichtingsfolie</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaseline, lanoline, paraffinewas gesmolten in gelijke concentraties)</td><td></td><td></td><td>Zelf gemaakt</td></tr><tr><td>Brightfield-microscoop</td><td>Leica</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>Elke omgekeerde brightfield zou volstaan</td></tr><tr><td>Drukregelaar</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK-buis</td><td>Cluzeau Info. Labo, Frankrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluïdische flesjes (Tubes Micrew 0,5 ml en 1 ml)</td><td>VWR, Nederland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. Reconstitutie van spindelvorming en positionering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10.000 MW, anionisch, fixeerbaar)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Rundeserumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase van Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-dithiotheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase van runderlever)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline (Tubuline van rundershersenen)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubuline-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-gelabeld tubuline uit varkenshersenen)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine-'5-trifosfaat, natriumzouthydraat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa;-caseïne (&kappa;-caseïne van rundermelk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (luchtdrijvende ultracentrifuge)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>4. Introductie van spindel-assemblagefactoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine-'5-trifosfaat, dinatriumzouthydraat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (fosfo(enol)pyruvaatzuurmono-natriumzouthydraat &ge;97% (enzymatisch))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Pyrovaatkinase/melkzuurdehydrogenase enzymen uit konijnspier)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstructie van basic mitotische assen in sferische emulsiedruppeltjes

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

De assemblage, positionering en oriëntatie van de mitotische spindel zijn afhankelijk van de gecombineerde krachten die worden gegenereerd door microtubulusdynamica, microtubulus-motoreiwitten en cross-linkers. Groeiende microtubuli kunnen duwkrachten genereren, terwijl depolymeriserende microtubuli de energie van microtubuluskrimp kunnen omzetten in trekkrachten, wanneer ze bijvoorbeeld zijn bevestigd aan corticale dyneïne of chromosomen. Bovendien dragen motoreiwitten en diffusibele cross-linkers binnen de spindel bij aan de spierdearchitectuur door anti-parallelle microtubuli met elkaar te verbinden en te laten glijden. In vivo heeft het moeilijk gebleken om de relatieve bijdrage van individuele spelers aan het algehele krachtevenwicht te ontrafelen. Hier presenteren we de methoden die we recentelijk hebben ontwikkeld in onze inspanningen om basale mitotische spildelen van onderaf te reconstrueren in vitro. Met behulp van microfluïdische technieken worden centrosomen en tubuline ingekapseld in water-in-olie emulsiedruppels, wat leidt tot de vorming van geometrisch beperkte (dubbele) microtubulus asters. Door bovendien corticaal verankerd dyneïne, plus-end-gerichte microtubulus-motoren en diffusibele cross-linkers te introduceren, wordt dit systeem gebruikt om spindel-achtige structuren te reconstrueren. De hier gepresenteerde methoden vormen een startpunt voor de reconstituurtie van meer complete mitotische spildelen, waardoor een gedetailleerd onderzoek naar de bijdrage van elke individuele component mogelijk wordt, en om een geïntegreerde kwantitatieve kijk op het krachtevenwicht binnen de mitotische spildel te verkrijgen.

De in de vorige delen methoden is het mogelijk de reconstructie van de spil-achtige structuren met toenemende complexiteit met behulp van de geometrische opsluiting van water-in-olie-emulsie druppels. Dit deel beschrijft representatieve resultaten die kwalitatief demonstreren het vermogen van deze assays. Tijdens mitose, wanneer de bipolaire spil gemonteerd, cellen afronden tot bolletjes vormen met een diameter van ongeveer 15 urn, zoals gemeten voor menselijke cellen. Dit karakteristieke mitotische cel vorm zorgt voor een geometrische grens die zowel beperkt u en regisseert spindel formaat en de richting 35,36. Microfluïdische technieken zorgen voor een niveau van geometrische opsluiting dat precies lijkt op de situatie waargenomen in levende cellen en daarom maakt het bottom-up reconstructie van mitotische spindels in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; microtubuli asters zijn op zich al in staat complexe gedrag wanneer microtubule groei wordt beperkt door geometrische grenzen. Zoals microtubules groeien drukkrachten opgewekt door het opnemen van nieuwe tubuline dimeren drijven beide centrosomes aan tegenoverliggende zijden van de emulsiedruppeltjes. In eerste instantie centrosomes vrij verspreiden binnen het beperkte volume (figuur 4a, linkerpaneel). Na ongeveer 20-30 min, de eerste microtubules zichtbaar en centrosome diffusie beperkt wordt als microtubuli groeien tegen de cortex in alle richtingen. Asters met microtubuli van tussenstuk (ongeveer 50% van de druppel diameter) kan (sterisch) elkaar afstoten andere, met microtubuli duwen tegen elkaar, de andere centrosomes en de cortex. Dit leidt tot een typische &#39;bipolaire&#39; spindel-achtige regeling met de twee centrosomes tegenover elkaar (figuur 4a, middelste paneel). Wanneer microtubuli groeien meer dan ~ 50% van de druppel-diameter, krijgt de centrosomes verder geduwd om tegengestelde grenzen van de druppel, met microtubuli groeien langs de druppel cortex (figuur 4a, rechter paneel). Het is belangrijk op te merken dat microtubule groei in deze testen zijn zeer gevoelig voor de temperatuur en tubuline-concentraties. Deze parameters zullen dus sterk van invloed op de tijd waarin nucleatie voor het eerst wordt waargenomen en bij steady-state aster posities worden bereikt. In cellen, worden corticale trekkrachten opgewekt door de vorming van dragende bevestigingen tussen microtubuli plus-uiteinden en geassocieerde cortex dyneine. In dierlijke cellen, deze associatie afhankelijk van Gai / LGN / NuMA complex dat is gericht op het plasmamembraan via N-terminale myristoylering of Gai 1. In deze reconstructie testen, is de eis van de Gai / LGN / NuMA complex omzeild door rechtstreeks koppelen dynein om gebiotinyleerde lipiden door devorming van biotine-streptavidine-biotine complexen. Deze obligaties zijn relatief stabiel (K D ~ 10 -14 M) 37 en vormen snel (meestal binnen 10 minuten na emulsie druppelvorming, voordat microtubule nucleatie blijkt) (Figuur 4b). In aanwezigheid van de corticale dynein, centrosomes doen vaak een meer centrale positie, terwijl in de afwezigheid van dyneine, centrosomes worden geduwd om weerszijden van de druppel cortex (Figuur 4c). We beredeneren dit is het resultaat van twee effecten, die verhinderen en tegengaan microtubule duwkrachten. (1) Dynein direct microtubulus rampen, waardoor microtubule lengte beperkt en waardoor buitensporige microtubuli knikken, en (2) corticale trekkrachten tot net centrerende krachten op de afzonderlijke asters 8, waarbij de aster aster-afstotende krachten tegenwerken. De diffundeerbare cross-linker ASE1 induceert forces die de neiging hebben het overlappende gebied van anti-parallelle microtubuli 29 verhogen. In overeenstemming hiermee, in aanwezigheid van ASE1 (en afwezigheid van dynein) centrosomes dicht bij elkaar gevonden ASE1 lokaliseren aan interpolaire microtubuli (figuur 4d) gebundeld. De leden van de kinesine-5 familie rijden centrosome scheiding door te duwen krachten vanuit de as (zie inleiding). In aanwezigheid van Cut7 (het S. pombe kinesine-ortholoog 5) worden geduwd om centrosomes weerszijden van de emulsie druppeltjes, zelfs in aanwezigheid van ASE1 (figuur 4e). Door het combineren van corticale en inter-polaire kracht generatoren, kan de complexiteit verder worden verhoogd in deze experimenten, uiteindelijk leidend tot een beter begrip van bipolaire mitotische spindle assembly. Een gedetailleerde beschrijving van deze kwantitatieve resultaten zullen in de toekomst (Roth et al., Manuscript in voorbereiding). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Naast het waarnemen van de positie van de centrosomes op vaste tijdstippen, en hun gedrag met betrekking tot de waargenomen lengte van de microtubuli, waardevolle informatie kan worden verkregen door de positioneerproces boven tijd. Door het verminderen belichtingstijden en laserintensiteiten, is het nu mogelijk om aster positionering volgen op 2 minuten intervallen gedurende ten minste 1 uur met slechts ~ 30% bleken. Dit zorgt voor de opvolging van de aster montage en positionering van vrij diffunderen centrosomes (0 min.) Via gecentraliseerd (12 min.) Naar decentrale asters (36 min en verder) (Figuur 5c). Dit vergemakkelijkt het onderzoek van zowel steady-state gedrag spileenheid kinetiek. Door het combineren van druppeltjes met verschillende inhoud in hetzelfde monster is bijvoorbeeld mogelijk om direct centrosome positionering en spileenheid kinetiek vergelijken druppeltjes met en zonder corticale kracht generatoren (figuur 5b). Figuur 1: krachten op de mitotische spoel Verschillende krachtgenererende moleculen werken op microtubuli van de mitotische spindel vorming en positionering spindel bevorderen.. Microtubuli die groeien in de cel cortex genereren van een duwkracht op de centrosome. Corticale dynein (paarse) vangt depolymeriseren van microtubuli en genereert een trekkracht op de centrosomes. Binnen de spindel, Kinesin-5 / Cut7 motor-eiwitten zorgen voor een naar buiten glijden werking op anti-parallelle microtubuli, terwijl cross-linkers van de familie PRC1 / ASE1 genereren een tegengestelde naar buiten schuiven van kracht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Figuur 2:. Microfluïdische chip design (A) Ontwerp van 4 inch fotomasker met 4 microfluïdische chips. (B) De gedetailleerde weergave van een enkele chip. Chips bevatten één afvoerkanaal en drie inlaatkanalen gevolgd door een stof-filter. Inlaatkanaal 1 bevat de waterfase, kan kanaal 2 het lipide / olie-fase en kanaal 3 worden de gevormde druppels extra lipide / oliefase verdunnen. (C) gedetailleerde weergave van de splitsing waar de lipide / olie-fase (vanuit de bovenste en onderste) voldoet aan de waterfase (die van links). Bij de kruising zullen druppeltjes en stromen naar het uitlaatkanaal rechts. (D) Gedetailleerde weergave van een stof-filter met 2 micrometer kanalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Figuur 3:. Methodologie voor water-in-olie emulsie druppelvorming (A) microfluïdische chip en microfluidics slang op een helder-veld microscoop. Zowel de water- en lipide / oliefase buizen zijn verbonden met de chip inlaten 1 en 2 respectievelijk. (B) Beperking van microfluidics chip waar de water- en lipide / olie-fase te voldoen. Door de druk, kunnen druppels maat worden gecontroleerd. (C) Het ontwerpen van PDMS gecoate stroom-cellen. Na het laden van de druppels in de stroom-cel, worden de open einden afgesloten met extra valap. (D) Schematische voorstelling van druppelvorming. Druppels worden gebruikt om centrosomes, tubuline en aanvullende componenten nodig voor mitotische spindle vorming kapselen. (E) Schematische voorstelling van corticale dyneine targeting. Gebiotinyleerd (Bio) dynein is gericht op gebiotinyleerde lipiden door middel van streptavidine (Strp). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Figuur 4:. Representatieve resultaten van de As-reconstructies met toenemende complexiteit (A) Maximale intensiteit projecties van druppeltjes met twee centrosomes toont voorbeelden van korte, tussenliggende en lange microtubuli. Centrosomes en microtubuli worden zichtbaar gemaakt door de toevoeging van 10% HiLyte-488 gelabeld tubuline. Schaalbalken = 10 urn. (B) Lokalisatie van GFP-biotine dyneine-TMR in afwezigheid (-, links) en met (+, rechts) van streptavidine (Strp). (C) microtubules aster positionering in de afwezigheid (-, links) of aanwezigheid (+, rechts) Corticale GFP-biotine dyneine-TMR. (D) van microtubuli aster (linker paneel, grEen) positionering in de aanwezigheid van ASE1 (middenpaneel rood). (E) van microtubuli aster (linker paneel, groen) positionering in de aanwezigheid van ASE1 en Cut7 (kinesine-5) (middelste paneel, red). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Figuur 5: Positionering Imaging Aster Dynamics in vitro (A) Ontwerp van een PDMS beker die druppel beeldvorming toelaat gedurende verschillende uren.. (B) Generation, de opslag en de beeldvorming van druppels (overdraagbare) met verschillende inhoud, geïllustreerd door afwezigheid (links) integratie (rechts) van TL-dextran (Alexa 647). (C) enkel vlak beelden van een 60 min time-lapse (2 min intervallen) genomen van een z-stack (2 urn afstanden) van adroplet met een enkele centrosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

De assemblage en positionering van de mitotische spindel zijn afhankelijk van de gecombineerde krachten die worden gegenereerd door microtubulusdynamiek, motoreiwitten en cross-linkers. Hier presenteren we onze recent ontwikkelde methoden waarin de geometrische beperking van sferische emulsiedruppels wordt gebruikt voor de bottom-up reconstituitie van basische mitotische spindels.

Reconstructie van Basic Mitotische Assen in Sferische emulsiedruppeltjes

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Het algemene doel van deze procedure is om mitotische spoellichamen-achtige structuren te reconstitueren binnen de geometrische beperking van water-in-olie emulsiedruppels. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de assemblage van de mitotische spoel, zoals hoe spoelen worden gepositioneerd en geassembleerd, en wat de specifieke bijdrage is van individuele componenten aan deze processen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een bottom-up benadering gebruiken om spoellichamen-achtige structuren te reconstitueren binnen een geometrische beperking die de vorm van een mitotische cel nabootst.Deze methode kan ook worden gebruikt om andere processen te bestuderen die afhankelijk zijn van cellulaire opsluiting. Meng 10 delen PDMS-prepolymeer met één deel uithardingsmiddel tot een totale massa van ongeveer 40 gram. Plaats het mengsel vervolgens gedurende ongeveer 30 minuten in een vacuümkamer om luchtbellen te verwijderen.Wikkel ondertussen aluminiumfolie om de mal om een kommetje te maken met een diepte van één centimeter en een diameter van vier inch. Giet vervolgens, zodra dit gereed is, ongeveer 3/4 van het PDMS-mengsel in de mal. Plaats het PDMS daarna nogmaals 30 minuten in een vacuümkamer.Na het ontluchten wordt het PDMS gedurende een uur uitgehard bij 100 °C. Bereid ondertussen enkele glazen objectglaasjes voor op spin-coating door ze af te stoffen met perslucht. Breng vervolgens het resterende PDMS-mengsel via spin-coating aan op de glaasjes.Hard deze slides een uur lang uit bij 100 graden Celsius om het PDMS te harden. Pel vervolgens voorzichtig het PDMS af met een scheermesje en pons de benodigde gaten uit de PDMS-strips om microfluidische chips te maken. Behandel nu de microfluidische chip en een met PDMS gecoate glasplaat enkele seconden lang met een coronabehandeling.Plaats tot slot op elke glazen objectglas een microfluïdische chip met de kanalen naar beneden en bak de chips een nacht bij 100 degrees Celsius. Bereid eerst ongeveer 250 micrograms in chloroform opgeloste lipiden voor met behulp van met chloroform gewassen glaswerk. Droog het lipidenmengsel voorzichtig met een inert gas.Plaats het vervolgens een uur in een vacuümkamer. Los daarna de lipiden op in minerale olie en 2,5% surfactant tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter, wat ongeveer 500 microliters is. Om de lipiden volledig op te lossen, wordt het mengsel 30 minuten gesoneerd bij 40 kilohertz.Spoor vervolgens PDMS op dekglasplaatjes met een dikte die overeenkomt met het objectief van de microscoop. Spin-coat daarna PDMS op glazen objectglazen. Cure nu de met PDMS gecoate dekglasplaatjes en objectglazen gedurende een uur bij 100 °C.Maak vervolgens de flowcellen door dunne stroken laboratoriumafdichtingsfolie met kleine tussenruimtes op de met PDMS gecoate glazen objectglazen te plaatsen. Positioneer stroken van drie millimeter met een tussenruimte van ongeveer twee millimeter. Dek de flowcellen daarna af met een met PDMS gecoat dekglas en verzegel het geheel door de folie gedurende een korte minuut bij 100 °C te smelten.Druk na het verhitten het dekglas voorzichtig aan en verzegel dit met Valap. Bereid vervolgens een PDMS-cup voor langetermijnbeeldvorming. Pons een gat met een diameter van 4 mm in een 3 mm dikke plak PDMS.Behandel vervolgens de PDMS-schijf en een PDMS-gecoat dekglas met corona. Plaats ze na de behandeling op elkaar en bak het geheel een nacht bij 100 graden Celsius. Controleer de vorming van druppels met een omgekeerde brightfield-microscoop.Verbind de lipide-oliefase met de drukregelaar en verhoog de druk totdat er een olie-druppel uit de peak-tubing komt. Verbind de peak-tubing met inlaat twee van de microfluidische chip. Vul vervolgens de microfluidische chips volledig met de lipide-oliefase via inlaat twee.Voeg vervolgens de MRB-80 gebaseerde waterfase toe via inlaat één. Controleer de druppelgrootte door de druk van de lipide-oliefase en de waterfase aan te passen om druppels met een diameter van ongeveer 15 micron te creëren. Ongeveer 800 millibar voor de lipide-oliefase en 200 millibar voor de waterfase is een goed startpunt.Nadat de gewenste druppelgrootte is bereikt, wordt de flowcell volledig gevuld met druppels. Deze druppels worden gevormd met behulp van kleine volumes van de waterfase. Dit betekent dat de microfluidische opstelling snel moet draaien om te voorkomen dat de gehele waterfase verloren gaat voordat druppels van de juiste grootte zijn gevormd.Zodra deze is gevuld, worden de uiteinden van de flowcell voorzichtig gesloten met Valap. Als de druppels niet stoppen met bewegen, is de afdichting niet volledig of zijn er luchtbellen geïntroduceerd. Voor beeldvorming op de lange termijn worden de druppels overgebracht naar een PDMS-cup en bedekt met een laag olie-lipidenmengsel.Ontdooi de centrosomen bij kamertemperatuur en plaats ze 20 minuten bij 37 °C om een correcte microtubuli-nucleatie te waarborgen. Bereid tijdens het wachten het assay-mengsel op ijs voor. Dit moet tubuline, GTP, een zuurstofvanger-systeem, moleculaire krachtgeneratoren zoals microtubuli-crosslinkers, ATP en een ATP-regeneratiesysteem bevatten.Zodra het mengsel is bereid, wordt het monster gecentrifugeerd in de gekoelde Airfuge-rotor bij 30 psi gedurende drie minuten. Voeg vervolgens de vooraf verwarmde centrosomen toe aan het mengsel. Optimaliseer de hoeveelheid toegevoegde centrosomen om één of twee centrosomen per druppel te verkrijgen.Gebruik vervolgens dit mengsel om emulsiedruppels te produceren zoals eerder beschreven. Om dyneïne te rekruteren naar gebiotineerde lipiden aan de cortex van de druppel, voegt u GFP-dynein TMR en streptavidine toe aan de waterfase. Visualiseer de groei van microtubuli na 30 minuten bij 26 °C met een spinning disk confocale microscoop.Tijdens het beelden kan de groei van microtubuli worden gestimuleerd door de temperatuur te verhogen naar 28 of zelfs 30 °C. Maak voor Z-projecties stacks met intervallen van één micron, wat ongeveer 20 beelden per druppel zou vereisen. Ga naar het hoofdcamera-paneel, klik op Edit Z en stel de Z Step in op 1.0.Klik op Volgende om de instellingen op te slaan. Stel vervolgens de maximale lineaire EM Gain in door op het tabblad Camera in het acquisitiepaneel te klikken en de EM Gain-schuifregelaar naar 300 te slepen. Stel daarna in hetzelfde tabblad de belichtingstijd in op 200 milliseconden.Klik op Record om de instellingen op te slaan. Maak bij live-imagingexperimenten elke twee minuten Z-projecties gedurende twee uur door de belichtingstijden te verminderen tot ongeveer 100 milliseconden en de Z-intervallen te verhogen naar twee micron. Gebruik bij live-imagingexperimenten een PDMS-cup in plaats van een reguliere flowcell voor maximale immobilisatie van het monster.Met behulp van de beschreven protocollen werd de aster-vorming bestudeerd in emulsiedruppels van water en olie die centrosomen bevatten. Aanvankelijk diffunderen de centrosomen vrij binnen de beperkte volumes. Na ongeveer 20 tot 30 minuten worden de eerste microtubuli zichtbaar en wordt de diffusie van de centrosomen beperkt doordat microtubuli in alle richtingen richting de cortex groeien.Wanneer de microtubuli langer worden dan de helft van de diameter van de druppel, worden de centrosomen naar tegenovergestelde randen geduwd, waarbij de microtubuli langs de cortex van de druppel groeien. Zonder streptavidine is dyneïne diffuus verspreid binnen de druppel. Echter, in aanwezigheid van streptavidine wordt dyneïne binnen ongeveer 10 minuten na de vorming van de druppel gekoppeld aan de gebiotineerde lipiden.Bij het bekijken van fluorescerend tubuline in aanwezigheid van corticaal dyneïne is duidelijk dat de centrosomen centraal gepositioneerd zijn. Terwijl in afwezigheid van dyneïne de centrosomen naar tegenovergestelde zijden van de druppel worden geduwd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat dyneïne microtubule-catastrofes en corticale trekkrachten bevordert, wat resulteert in het centreren van de asters.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe microfluïdische technologieën kunnen worden gebruikt om spoelvormige structuren te creëren in sferische emulsiedruppels. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen druppelvorming en beeldvorming in twee tot drie uur worden voltooid wanneer dit correct wordt uitgevoerd. Met behulp van deze procedure kunnen andere factoren voor spoelvorming worden ingekapseld om hun effect op de morfologie en positionering van de spoel te bestuderen.Voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, moeten altijd worden genomen bij het gebruik van chloroform of PDMS.

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the technique of studying the septin protein assembly on microspheres coated with lipid bilayers. This technique helps in understanding the curvature-dependent assemblies of protein on curved surfaces.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: A Technique to Observe the Septin Assembly on Microspheres

Reusachtige blaasjes die micrometergrote componenten bevatten, zijn nuttige celmodellen. De centrifugatiemethode voor water-in-olie-emulsie is een eenvoudige, krachtige tool voor de bereiding van reusachtige blaasjes met ingekapselde materialen.

Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

Het huidige werk beschrijft een methode om te fabriceren micellaire nanokristallen, een opkomende grote klasse van nanobiomaterials. Deze methode combineert topdown electrospray, onderop zelf-assemblage, en op basis van oplosmiddel structuur controle. De fabricage methode is grotendeels continu kan produceren hoogwaardige producten en bezit een goedkoop middel structuur controle.

Fabricage van bolvormig en Worm-vormige micellaire nanokristallen door het combineren van Electrospray, zelf-assemblage en controle van de structuur op basis van oplosmiddel

Door encapsulating ei extracten van Xenopus laevis in water-in-olie micro presenteren we een methode voor het genereren van in vitro zichzelf onderhoudende mitotische oscillaties op het niveau van eencellige.

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Water-in-olie druppels testen zijn nuttig voor analytische chemie, enzymevolutie en eencellige analyse, maar vereisen meestal microfluïdica om de druppels te vormen. Hier beschrijven we deeltjessjabloonemulgering, een microfluïdische benadering om druppeltests uit te voeren.

Deeltjessjabloonemulgering maakt microfluïdische druppeltests mogelijk

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten in gedefinieerde proteoliposomen.

Reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Dit protocol biedt een experimenteel kader om de fysieke impact van het cytoskelet op de nucleaire vorm en de interne membraanloze organellen in het eicelsysteem van muizen te documenteren. Het raamwerk kan worden aangepast voor gebruik in andere celtypen en contexten.

Het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen

Dit artikel introduceert een eenvoudige reconstitutie in één pot van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden reuzenblaasjes. De methode kan worden veralgemeend en toegepast op inkapseling of opsluiting van een breed scala aan biomoleculen.

In vitro Reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's)

Leer hoe je mitotische spoelachtige structuren reconstitueert in water-in-olie emulsiedruppeltjes met geometrische confinement. Deze bottom-up methode onthult de assemblage en positionering van spindels in een celbiologische context.

Reconstructie van Basic Mitotische Assen in Sferische emulsiedruppeltjes

Meer video's verkennen