Reconstructie van Basic Mitotische Assen in Sferische emulsiedruppeltjes
August 13th, 2016
De assemblage en positionering van de mitotische spindel zijn afhankelijk van de gecombineerde krachten die worden gegenereerd door microtubulusdynamiek, motoreiwitten en cross-linkers. Hier presenteren we onze recent ontwikkelde methoden waarin de geometrische beperking van sferische emulsiedruppels wordt gebruikt voor de bottom-up reconstituitie van basische mitotische spindels.
Het algemene doel van deze procedure is om mitotisch spindel-achtige structuren te reconstrueren binnen de geometrische beperking van water-in-olie emulsie druppeltjes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van mitotische spindelassemblage, zoals hoe spindels worden gepositioneerd en geassembleerd, en wat is de specifieke bijdrage van individuele componenten aan deze processen? Het grote voordeel van deze techniek is dat we een bottom-up benadering gebruiken om spindel-achtige structuren te reconstrueren binnen de geometrische beperking die de vorm van een mitotische cel nabootst.
Deze methode kan ook worden gebruikt om andere processen te bestuderen die afhankelijk zijn van cellulaire beperking. Meng 10 delen PDMS-pre-polymeer met één deel van hardingsmiddel in een totale massa van ongeveer 40 gram. Plaats vervolgens het mengsel in een vacuümkamer gedurende ongeveer 30 minuten om luchtbellen te verwijderen.
Gelijktijdig, wikkel aluminiumfolie rond de mal om een kom van één centimeter diep te maken met een diameter van vier inch. Wanneer klaar, giet ongeveer 3/4 van de PDMS-mix in de mal. Breng vervolgens de PDMS terug naar een vacuümkamer voor nog eens 30 minuten.
Na het ontgassen, genees de PDMS gedurende een uur op 100 graden Celsius. Bereid ondertussen enkele glasplaten voor spincoating voor door ze af te stoven met perslucht. Spuit vervolgens de resterende PDMS-mix op de platen.
Genees deze platen gedurende een uur op 100 graden Celsius om de PDMS te verharden. Verwijder vervolgens voorzichtig de PDMS met een scheermesje en prik de vereiste gaten uit de PDMS-strips om microfluïdische chips te maken. Behandel nu de microfluïdische chip en een PDMS-gecoate glasplaat gedurende enkele seconden met een corona.
Plaats tenslotte een microfluïdische chip op elke glasplaat met de kanalen naar beneden en bak de chips een nacht lang op 100 graden Celsius. Bereid eerst, met behulp van met chloroform gewassen glaswerk, ongeveer 250 microgram chloroform-opgeloste lipiden. Droog het lipidenmengsel voorzichtig met inert gas.
En plaats het vervolgens een uur lang in een vacuümkamer. Los vervolgens de lipiden op in minerale olie en 2,5% oppervlakte-actieve stof tot 0,5 milligram per milliliter, dat is ongeveer 500 microliter. Om de lipiden volledig op te lossen, soniceer het mengsel gedurende 30 minuten bij 40 kilohertz.
Spincoat vervolgens PDMS op dekglas met een dikte die overeenkomt met het microscoopobjectief. Spuit vervolgens PDMS op glasplaten. Genees de PDMS-gecoate dekglazen en glasplaten gedurende een uur op 100 graden Celsius.
Maak vervolgens de flowcellen door dunne plakjes laboratoriumafdichtingsfolie op de PDMS-gecoate glasplaten nauw te plaatsen. Plaats strips van drie millimeter ongeveer twee millimeter uit elkaar. Bedek vervolgens de flowcellen met een PDMS-gecoate dekglazen en verzegel de assemblage door de folie gedurende een minuut op 100 graden Celsius te smelten.
Eenmaal verwarmd, druk voorzichtig de dekglazen naar beneden en verzegel ze met Valap. Bereid vervolgens een PDMS-beker voor langdurige beeldvorming voor. Prik een gat van vier millimeter diameter in een snede van drie millimeter dik PDMS.
Behandel vervolgens de PDMS-snede en een PDMS-gecoat dekglas met een corona. Na behandeling, plaats ze bovenop elkaar en bak de assemblage een nacht lang op 100 graden Celsius. Bewaak de vorming van druppeltjes op een omgekeerde lichtveldmicroscoop.
Verbind de lipide-olie fase met de drukregelaar en verhoog de druk totdat een druppel olie uit de piekbuis uitkomt. Verbind de piekbuis met inlaat twee van de microfluïdische chip. Vul vervolgens de microfluïdische chips volledig met de lipide-olie fase van inlaat twee.
Introduceer vervolgens een op MRB-80 gebaseerde waterfase van inlaat één. Beheer de druppelgrootte door de druk van de lipide-olie fase en de waterfase te veranderen om druppels met een diameter van ongeveer 15 micrometer te creëren. Ongeveer 800 millibar voor de lipide-olie fase en 200 millibar voor de waterfase is een goed startpunt.
Nadat de gewenste druppelgrootte is verkregen, vul de flowcel volledig met druppeltjes. Deze druppeltjes worden gevormd met behulp van kleine volumes van de waterfase. Dit betekent dat de microfluïdische setup snel moet draaien om niet de volledige waterfase te verliezen voordat druppels van de juiste grootte zijn gevormd.
Eenmaal gevuld, sluit u de uiteinden van de flowcel voorzichtig met Valap. Als de druppeltjes niet stoppen met bewegen, is de verzegeling niet compleet of kunnen er luchtbellen zijn geïntroduceerd. Voor langdurige beeldvorming, breng de druppeltjes over in een PDMS-beker en bedek ze met een laag olie-lipide mengsel.
Ontdooi de centrosomen op kamertemperatuur en plaats ze gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius om een goede microtubulusnucleatie te garanderen. Terwijl u wacht, bereid u de assay-mix op ijs voor. Deze zou tubuline, GTP, een zuurstofscavengersysteem, moleculaire krachtgeneratoren zoals microtubulusverbindingen, ATP en ATP-regeneratiesysteem moeten bevatten.
Eenmaal gemengd, centrifugeer het monster in de gekoelde Airfuge rotor gedurende drie minuten op 30 psi. Voeg vervolgens de voorverwarmde centrosomen toe aan de mix. Optimaliseer de hoeveelheid centrosomen die wordt toegevoegd om één of twee centrosomen per druppel te krijgen.
Gebruik vervolgens dit mengsel om emulsie-druppeltjes te produceren zoals eerder beschreven. Om dyneine te rekruteren naar gebiotineerde lipiden in de druppelcortex, neemt u GFP-dyneine TMR en streptavidin op in de waterfase. Visualiseer microtubulusgroei op een spinning disk confocale microscoop na 30 minuten bij 26 graden Celsius.
Tijdens het beeldvormen kan microtubulusgroei worden bevorderd door de temperatuur te verhogen tot 28 of zelfs 30 graden Celsius. Voor Z-projecties, neemt u stapels met tussenpozen van één micrometer, wat ongeveer 20 beelden per druppel
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het reconstitueren van mitotische spindel-achtige structuren binnen geometrische beperkingen met behulp van water-in-olie emulsie druppels. De benadering is bedoeld om de assemblage- en positioneringsmechanismen van mitotische spindels te verduidelijken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Biofysica
Achtergrond
- Mitotische spindels zijn cruciaal voor celdeling.
- Begrip van spindeldynamica kan inzichten geven in cellulaire processen.
- Geometrische beperking imiteert cellulaire omgevingen.
- Vorige methoden ontbraken effectieve reconstitutietechnieken.
Doel van studie
- Om een bottom-up benadering te ontwikkelen voor het bestuderen van spindelassemblage.
- Om de bijdragen van individuele componenten in spindeldynamica te onderzoeken.
- Om de effecten van beperking op cellulaire processen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van PDMS mallen voor microfluïdische chips.
- Vorming van lipidedruppels met behulp van gecontroleerde drukken.
- Incorporatie van centrosomen en microtubulicomponenten.
- Live beeldvorming van microtubuligroei met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle reconstitutie van spindel-achtige structuren in druppels.
- Observatie van microtubulidynamica onder beperking.
- Inzichten in de rol van individuele componenten in spindelassemblage.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op andere cellulaire processen.
Conclusies
- De methode biedt een nieuw platform voor het bestuderen van mitotische spindels.
- Geometrische beperking is essentieel voor het imiteren van cellulaire omstandigheden.
- Verder onderzoek kan het begrip van spindeldynamica uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reconstituting mitotic spindle-like structures in geometrically confined emulsion droplets enables precise dissection of force-generating components critical for cell division. This bottom-up system provides a controlled platform for mechanistic de-risking and target validation in early discovery, supporting predictive confidence in cytoskeletal drug target portfolios. The approach bridges the gap between in vitro reconstitution and disease-relevant cellular complexity, informing risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of individual spindle assembly factors under defined conditions.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of microtubule motors, cross-linkers, and cortical anchors.
- Facilitates functional target validation by recapitulating cellular confinement and force-balance.
- Provides a platform for hypothesis-driven testing of cytoskeletal modulators.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, confined biological systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative outputs on microtubule dynamics and spindle positioning.
- Enables assay standardization and scalability for compound evaluation targeting spindle components.
- Supports platform reuse for diverse cytoskeletal perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro force-balance measurements with disease-relevant mitotic defects.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical model validation of spindle-targeting agents.
- Informs translational biomarker development by quantifying spindle assembly phenotypes.
- Reduces late-stage biological risk by clarifying mechanistic underpinnings of mitotic failure.
Pipeline & Workflow Integration
This reconstitution method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation for cytoskeletal targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on force generation and spindle assembly mechanisms.
- Screening: Provides assay-ready, confined systems with reproducible quantitative readouts.
- Analytics: Enables measurement of spindle positioning, microtubule dynamics, and force-balance outputs.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant mitotic phenotypes and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various spindle assembly factors and perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spindle-targeting programs.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible assay systems for cytoskeletal research.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitotic and cytoskeletal targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, cytoskeletal biochemistry, and advanced imaging.
- Demands access to microfabrication, confocal microscopy, and pressure-controlled droplet generation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of droplet formation and imaging protocols.
- Adaptation to other model systems may require optimization of confinement and component concentrations.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise control of component stoichiometry.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Microfluidic Chips
2:37
Microfluidic Setup: Lipid Preparation and Making PDMS Items
4:38
Microfluidic Setup: Emulsion-droplet Formation
6:15
Reconstituting Basic Microtubule Asters
7:27
Imaging
8:48
Results: Microtubule Aster Visualization
10:07
Conclusion
