Reconstructie van Basic Mitotische Assen in Sferische emulsiedruppeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om mitotische spoellichamen-achtige structuren te reconstitueren binnen de geometrische beperking van water-in-olie emulsiedruppels. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de assemblage van de mitotische spoel, zoals hoe spoelen worden gepositioneerd en geassembleerd, en wat de specifieke bijdrage is van individuele componenten aan deze processen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een bottom-up benadering gebruiken om spoellichamen-achtige structuren te reconstitueren binnen een geometrische beperking die de vorm van een mitotische cel nabootst.

Deze methode kan ook worden gebruikt om andere processen te bestuderen die afhankelijk zijn van cellulaire opsluiting. Meng 10 delen PDMS-prepolymeer met één deel uithardingsmiddel tot een totale massa van ongeveer 40 gram. Plaats het mengsel vervolgens gedurende ongeveer 30 minuten in een vacuümkamer om luchtbellen te verwijderen.

Wikkel ondertussen aluminiumfolie om de mal om een kommetje te maken met een diepte van één centimeter en een diameter van vier inch. Giet vervolgens, zodra dit gereed is, ongeveer 3/4 van het PDMS-mengsel in de mal. Plaats het PDMS daarna nogmaals 30 minuten in een vacuümkamer.

Na het ontluchten wordt het PDMS gedurende een uur uitgehard bij 100 °C. Bereid ondertussen enkele glazen objectglaasjes voor op spin-coating door ze af te stoffen met perslucht. Breng vervolgens het resterende PDMS-mengsel via spin-coating aan op de glaasjes.

Hard deze slides een uur lang uit bij 100 graden Celsius om het PDMS te harden. Pel vervolgens voorzichtig het PDMS af met een scheermesje en pons de benodigde gaten uit de PDMS-strips om microfluidische chips te maken. Behandel nu de microfluidische chip en een met PDMS gecoate glasplaat enkele seconden lang met een coronabehandeling.

Plaats tot slot op elke glazen objectglas een microfluïdische chip met de kanalen naar beneden en bak de chips een nacht bij 100 degrees Celsius. Bereid eerst ongeveer 250 micrograms in chloroform opgeloste lipiden voor met behulp van met chloroform gewassen glaswerk. Droog het lipidenmengsel voorzichtig met een inert gas.

Plaats het vervolgens een uur in een vacuümkamer. Los daarna de lipiden op in minerale olie en 2,5% surfactant tot een concentratie van 0,5 milligram per milliliter, wat ongeveer 500 microliters is. Om de lipiden volledig op te lossen, wordt het mengsel 30 minuten gesoneerd bij 40 kilohertz.

Spoor vervolgens PDMS op dekglasplaatjes met een dikte die overeenkomt met het objectief van de microscoop. Spin-coat daarna PDMS op glazen objectglazen. Cure nu de met PDMS gecoate dekglasplaatjes en objectglazen gedurende een uur bij 100 °C.

Maak vervolgens de flowcellen door dunne stroken laboratoriumafdichtingsfolie met kleine tussenruimtes op de met PDMS gecoate glazen objectglazen te plaatsen. Positioneer stroken van drie millimeter met een tussenruimte van ongeveer twee millimeter. Dek de flowcellen daarna af met een met PDMS gecoat dekglas en verzegel het geheel door de folie gedurende een korte minuut bij 100 °C te smelten.

Druk na het verhitten het dekglas voorzichtig aan en verzegel dit met Valap. Bereid vervolgens een PDMS-cup voor langetermijnbeeldvorming. Pons een gat met een diameter van 4 mm in een 3 mm dikke plak PDMS.

Behandel vervolgens de PDMS-schijf en een PDMS-gecoat dekglas met corona. Plaats ze na de behandeling op elkaar en bak het geheel een nacht bij 100 graden Celsius. Controleer de vorming van druppels met een omgekeerde brightfield-microscoop.

Verbind de lipide-oliefase met de drukregelaar en verhoog de druk totdat er een olie-druppel uit de peak-tubing komt. Verbind de peak-tubing met inlaat twee van de microfluidische chip. Vul vervolgens de microfluidische chips volledig met de lipide-oliefase via inlaat twee.

Voeg vervolgens de MRB-80 gebaseerde waterfase toe via inlaat één. Controleer de druppelgrootte door de druk van de lipide-oliefase en de waterfase aan te passen om druppels met een diameter van ongeveer 15 micron te creëren. Ongeveer 800 millibar voor de lipide-oliefase en 200 millibar voor de waterfase is een goed startpunt.

Nadat de gewenste druppelgrootte is bereikt, wordt de flowcell volledig gevuld met druppels. Deze druppels worden gevormd met behulp van kleine volumes van de waterfase. Dit betekent dat de microfluidische opstelling snel moet draaien om te voorkomen dat de gehele waterfase verloren gaat voordat druppels van de juiste grootte zijn gevormd.

Zodra deze is gevuld, worden de uiteinden van de flowcell voorzichtig gesloten met Valap. Als de druppels niet stoppen met bewegen, is de afdichting niet volledig of zijn er luchtbellen geïntroduceerd. Voor beeldvorming op de lange termijn worden de druppels overgebracht naar een PDMS-cup en bedekt met een laag olie-lipidenmengsel.

Ontdooi de centrosomen bij kamertemperatuur en plaats ze 20 minuten bij 37 °C om een correcte microtubuli-nucleatie te waarborgen. Bereid tijdens het wachten het assay-mengsel op ijs voor. Dit moet tubuline, GTP, een zuurstofvanger-systeem, moleculaire krachtgeneratoren zoals microtubuli-crosslinkers, ATP en een ATP-regeneratiesysteem bevatten.

Zodra het mengsel is bereid, wordt het monster gecentrifugeerd in de gekoelde Airfuge-rotor bij 30 psi gedurende drie minuten. Voeg vervolgens de vooraf verwarmde centrosomen toe aan het mengsel. Optimaliseer de hoeveelheid toegevoegde centrosomen om één of twee centrosomen per druppel te verkrijgen.

Gebruik vervolgens dit mengsel om emulsiedruppels te produceren zoals eerder beschreven. Om dyneïne te rekruteren naar gebiotineerde lipiden aan de cortex van de druppel, voegt u GFP-dynein TMR en streptavidine toe aan de waterfase. Visualiseer de groei van microtubuli na 30 minuten bij 26 °C met een spinning disk confocale microscoop.

Tijdens het beelden kan de groei van microtubuli worden gestimuleerd door de temperatuur te verhogen naar 28 of zelfs 30 °C. Maak voor Z-projecties stacks met intervallen van één micron, wat ongeveer 20 beelden per druppel zou vereisen. Ga naar het hoofdcamera-paneel, klik op Edit Z en stel de Z Step in op 1.0.

Klik op Volgende om de instellingen op te slaan. Stel vervolgens de maximale lineaire EM Gain in door op het tabblad Camera in het acquisitiepaneel te klikken en de EM Gain-schuifregelaar naar 300 te slepen. Stel daarna in hetzelfde tabblad de belichtingstijd in op 200 milliseconden.

Klik op Record om de instellingen op te slaan. Maak bij live-imagingexperimenten elke twee minuten Z-projecties gedurende twee uur door de belichtingstijden te verminderen tot ongeveer 100 milliseconden en de Z-intervallen te verhogen naar twee micron. Gebruik bij live-imagingexperimenten een PDMS-cup in plaats van een reguliere flowcell voor maximale immobilisatie van het monster.

Met behulp van de beschreven protocollen werd de aster-vorming bestudeerd in emulsiedruppels van water en olie die centrosomen bevatten. Aanvankelijk diffunderen de centrosomen vrij binnen de beperkte volumes. Na ongeveer 20 tot 30 minuten worden de eerste microtubuli zichtbaar en wordt de diffusie van de centrosomen beperkt doordat microtubuli in alle richtingen richting de cortex groeien.

Wanneer de microtubuli langer worden dan de helft van de diameter van de druppel, worden de centrosomen naar tegenovergestelde randen geduwd, waarbij de microtubuli langs de cortex van de druppel groeien. Zonder streptavidine is dyneïne diffuus verspreid binnen de druppel. Echter, in aanwezigheid van streptavidine wordt dyneïne binnen ongeveer 10 minuten na de vorming van de druppel gekoppeld aan de gebiotineerde lipiden.

Bij het bekijken van fluorescerend tubuline in aanwezigheid van corticaal dyneïne is duidelijk dat de centrosomen centraal gepositioneerd zijn. Terwijl in afwezigheid van dyneïne de centrosomen naar tegenovergestelde zijden van de druppel worden geduwd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat dyneïne microtubule-catastrofes en corticale trekkrachten bevordert, wat resulteert in het centreren van de asters.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe microfluïdische technologieën kunnen worden gebruikt om spoelvormige structuren te creëren in sferische emulsiedruppels. Zodra de techniek onder de knie is, kunnen druppelvorming en beeldvorming in twee tot drie uur worden voltooid wanneer dit correct wordt uitgevoerd. Met behulp van deze procedure kunnen andere factoren voor spoelvorming worden ingekapseld om hun effect op de morfologie en positionering van de spoel te bestuderen.

Voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, moeten altijd worden genomen bij het gebruik van chloroform of PDMS.