Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

Cellulaire microtubule arrays bevatten subpopulaties van microtubuli met verschillende dynamische eigenschappen zoals vereist voor functie. Dit protocol behandelt hoe de collectieve activiteit van regulatoren proximale microtubule subpopulaties met verschillende eigenschappen verleent. Deze bottom-up restitutietest stelt ons in staat om tegelijkertijd de organisatie en dynamiek van proximale microtubulipopulaties zoals enkele microtubuli en bundels te visualiseren en de mechanismen te ontcijferen die ten grondslag liggen aan hun zelforganisatie.

Multi-component reconstitutie vereist het optimaliseren van experimentele parameters zoals pH, ionische sterkte en eiwitconcentratie met behoud van de activiteit van elk. Systematische analyse van individuele componenten voorafgaand aan multi-eiwit assays is uiterst nuttig. Pipetteer om te beginnen een mengsel van 4,5 microliter BRB ADDTT in één microliter microtuboplossing op een microscoopglaasje.

Dek af met een afdeklip van 18 bij 18 millimeter en sluit de randen af met heldere nagellak of VALAP-kit. Plaats de TIRF-doelstelling onder de coverslip. Visualiseer de nieuw gepolymeriseerde microtubuli op een golflengte die geschikt is voor de fluorescerend gelabelde tubuline in de heldere mix om te bepalen welke verdunning van microtubuli moet worden gebruikt in de komende experimenten.

Bepaal de laserintensiteit voor het experiment empirisch, zodat alle fluorescerende eiwitten worden verlicht, maar geen significante fotobleaching ondergaan in de loop van het experiment. Stel de microscooptemperatuur in op 28 graden Celsius om dynamische microtubuli te bekijken. Gebruik lenspapier om een objectief van 100X schoon te maken met 70% ethanol.

Gebruik de beste combinatie van filterkubussen en emissiefilters, afhankelijk van de fluorescerende kanalen die moeten worden afgebeeld. Stel de beeldreeks in. Voor een experiment met 647 nanometer fluorofoor-gelabelde gebiotinyleerde microtubuli, 560 nanometer fluorofoor-gelabelde niet-gebiotinyleerde microtubuli in oplosbare tubuline en GFP-gelabeld eiwit van belang, beeld de 488 nanometer, 560 nanometer en 647 nanometer kanalen elke 10 seconden gedurende 20 minuten.

Om een referentiebeeld van bundels vast te leggen vóór de toevoeging van oplosbaar tubuline en microtubule-geassocieerd eiwit, stelt u een reeks in met elk één afbeelding in golflengtekanalen van 560 nanometer en 647 nanometer. Controleer de positie van de laserstraal op het plafond boven de microscoop en breng softwarematig wijzigingen aan in de straal. Zorg ervoor dat het laserlicht is uitgelijnd.

Voeg voorafgaand aan de beeldvorming een druppel microscoop-onderdompelingsolie toe aan het objectief. Bereid het oplosbare tubulinemengsel terwijl u het op ijs houdt en draai het mengsel naar beneden. Om microtubuli te immobiliseren via biotine-NeutrAvidin-biotine koppeling, eerst in ongeveer 7,5 microliter NeutrAvidin oplossing stromen totdat de kamer gevuld is en gedurende vijf minuten incuberen.

Wassen met 10 microliter MB koud. Stroom in 7,5 microliter van het blokkerende eiwit KC en incubeer gedurende twee minuten. Was met 10 microliter MB warm om de kamer voor te bereiden op de introductie van microtubuli.

Verdun de voorraad gebiotinyleerde microtubuli in BRB ADDTT en voeg één microliter van deze verdunning toe tot negen microliter MB warm. Laat het mengsel in de kamer stromen en incubeer gedurende 10 minuten. Spoel niet-geïmmobiliseerde microtubuli weg met 10 microliter MB warm.

Laat 7,5 microliter warme KC in de kamer stromen en incubeer gedurende twee minuten. Bereid tijdens de incubatie een twee nanomolaire oplossing van het crosslink- of eiwit PRC1 in KC en draai de oplossing naar beneden. Laat 10 microliter van deze oplossing in de beeldvormingskamer stromen en incubeer gedurende vijf minuten.

Om bundels te maken, stroomt u 10 microliter niet-gebiotinyleerde microtubuli in de kamer en incubeert u gedurende 10 minuten. Was de kamer twee keer met 10 microliter MB warm. Bereid tijdens de incubatietijd van 10 minuten 10 microliter testmengsel met interessante eiwitten, oplosbare tubuline, nucleotiden, zuurstofvangers en antioxidanten en draai het af.

Bewaar het mengsel op ijs. Laad de voorbereide beeldvormingskamer die is afgeplakt op de schuifhouder op het 100X TIRF-objectief. Gebruik de kanalen van 560 nanometer en 647 nanometer om een gezichtsveld te vinden dat een optimaal aantal en dichtheid van enkele microtubuli en bundels bevat.

Zodra een gezichtsveld is geïdentificeerd, maakt u een referentiebeeld. Vloei voorzichtig in het testmengsel zonder de beeldvormingskamer te verstoren. Sluit de open uiteinden van de kamer af met VALAP-kit.

Observeer de microtubuli en start de beeldvormingssequentie. Na het immobiliseren van microtubulizaden en het genereren van bundels werden fluorescentiebeelden verkregen. Enkele microtubuli werden geïdentificeerd door een fluorescerend signaal in het 647 nanometerkanaal, terwijl microtubuli werden geïdentificeerd als voorgevormde bundels wanneer ze fluorescerende signalen in beide kanalen vertoonden.

De dynamiek van enkele microtubuli en PRC1-gekruiste bundels werd bestudeerd in aanwezigheid van de eiwitten KIF4A en CLASP1, waaruit bleek dat de enkele microtubuli in de loop van de test verlengen, terwijl de groei van gekruiste microtubuli tot stilstand is gekomen. Wees voorzichtig om gepolymeriseerde microtubuli op of boven kamertemperatuur te houden. Bewaar oplosbare tubuline op ijs en bescherm de beeldvormingskamer en fluorescerend gelabelde microtubuli en eiwitten tegen licht.

Deze testen gaven mechanistisch inzicht in hoe een eiwitmodule in de mitotische spil de dynamiek van twee verschillende microtubulepopulaties die naast elkaar bestaan in de spindel differentieel kon reguleren.