Name: Observatie en kwantificering van paargedrag in het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Leer een protocol om paargedrag te observeren bij het dennenaaltje Bursaphelenchus xylophilus. Deze methode maakt het mogelijk om maagdelijke volwassenen te verkrijgen voor gedragsstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Najie Zhu en Liqun Bai eveneens bijgedragen aan dit werk. Dit werk werd financieel ondersteund door het speciaal fonds voor de bosbouw Wetenschappelijk Onderzoek in het algemeen welzijn (201204501) en de National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688 en 31570638). Wij danken Dr. Holighaus Gerrit en Dr. Danielle Hickford voor hun nuttige suggesties over Engels schrijven.

1. Verwerving van Virgin Adult Nematoden <ol><li> Pinewood nematode isolaat en kweekomstandigheden NB: De B. xylophilus isoleren Nxy61 werd oorspronkelijk gewonnen uit een zieke Pinus massoniana in de Ningbo gebied van de provincie Zhejiang in China. <ol><li> Bereid Potato Dextrose Agar (PDA, zie tabel van Materialen) platen voor de teelt van Botrytis cinerea. </li><li> Voor enting, punch een stuk schimmel mat met een diameter van 10 mm uit een B. cinerea mat en zet het in het midden van een nieuwe PDA plaat. Cultuur de B. cinerea gedurende 5 dagen bij 25 ° C in het donker. </li><li> Cultuur dennennematoden de gevulde petrischaaltje met B. cinerea bij 25 ° C in het donker. </li></ol></li><li> Overname van B. xylophilus eieren <ol><li> Plaats een vastgeklemd rubberen slang onder een trechter en houd de voorbereide trechter in een rek aan de assemblerenBaermann trechter apparaat. Plaats twee lagen van filterpapier in plaats van gaas in de mond van de trechter. </li><li> Breng de schimmel culturen aan de trechter setup en voeg water toe tot de schimmel mat is ondergedompeld. Wacht 2 uur, en nematoden zal komen uit de schimmel cultuur, steek de filter papier, en zich te vestigen in het laagste deel van de Baermann trechter. </li><li> Verzamel de eerste paar druppels water van de bodem van de buis in een 15 ml buis en laat nematoden door langzaam vrijgeven van de klem op de buis. </li><li> Centrifugeer de bovengenoemde verzamelingen bij 3000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de bovenste laag water met een pipet en resuspendeer met 1 ml steriel dubbel gedestilleerd (dd) H 2 O. </li><li> Met een pipet de bovenstaande resuspensie naar een nieuwe glazen petrischaal (6 cm diameter). Voeg 3 ml steriel dd H2O de petrischaal zodat de nematoden vrij kunnen zwemmen. </li><li> Houd de aaltjes in het glass petrischaal gedurende 10 min bij 25 ° C in het donker. De eieren worden gelegd door zwangere vrouwen. Vanwege hun glycoproteïne oppervlak, zal de eieren aan de bodem van de glazen petrischaal. </li><li> Verwijder het water en wormen voorzichtig, zonder de eieren te storen. Voeg 3 ml steriel dd H2O de glazen petrischaal onmiddellijk te voorkomen dat de eieren uitdrogen. </li><li> Herhaal stap 1.2.8 3x alle larven en volwassenen te verwijderen en het zuivere eieren te verkrijgen. Voeg een extra 2 ml (5 ml in totaal) steriel dd H 2 O aan de petrischaal. </li></ol></li><li> Overname van de vierde etappe jongeren (J4 larven) <ol><li> Hatch verzamelde eieren voor 24 uur in het donker bij 25 ° C J2 larven te verkrijgen. </li><li> Breng de J2 larven met een pipet in een 15 ml buis, centrifuge bij 3000 xg gedurende 2 minuten, en verwijder de bovenste laag van het water. </li><li> Resuspendeer de J2 larven met 200 pl steriel dd H 2 O, en vervolgens overbrengen naarde PDA plaat met B. cinerea. </li><li> Cultuur J2 larven gedurende 52 uur bij 25 ° C in het donker. Op dit tijdstip zullen de meeste J2 larven hebben ontwikkeld in de vroege fase van J4 larven. </li></ol></li><li> Overname van maagdelijke volwassen nematoden <ol><li> Bereid een naald voor het oppakken van aaltjes door het tekenen van een glazen capillaire na verhitting het over een alcohol brander. OPMERKING: De tip van de capillaire naald moet meestal 50 urn in diameter, ongeveer lichaam breedte van een volwassen nematode, zodat het kan worden gebruikt als instrument voor het oppakken van een nematode. </li><li> Monteer een Baermann trechter en extraheren nematoden uit de fungale culturen 2 uur, zoals beschreven in stap 1.2.1 - 1.2.3. </li><li> Breng de J4 met water in een schone petrischaal. </li><li> Neem de nematoden onder een stereomicroscoop en onderscheid tussen mannen en vrouwen met genitale morfologie, zoals beschreven door Mamiya en Kiyohara 8 (figuur 1 </strong&gt;). Pick-up een nematode van het gewenste seks met de voorbereide capillaire naald en breng het naar de juiste schimmel-cultuur plaat voor mannen of vrouwen. LET OP: Er zijn meer vrouwen dan mannen, met het percentage van de vrouwtjes bij 60 - 70%. De vrouwelijke vulva is duidelijk verschillend van de mannelijke spicule. In vergelijking met de volwassen, de spicule of vulva in startende J4 kleiner, maar nog goed te zien en onderscheiden. De nematode is altijd in beweging in het water, die soms moeilijk te onderscheiden mannetjes en vrouwtjes verhoogt. </li><li> Cultuur J4 larven nog eens 24 uur bij 25 ° C in het donker. OPMERKING: Alle aaltjes moet zich ontwikkelen tot volwassenen, maar omdat ze ongedempte, worden ze beschouwd als maagd volwassenen. </li><li> Monteer twee Baermann trechters en pak de maagd volwassenen uit de schimmel kweken gedurende 2 uur, zoals beschreven in de stappen 1.2.1 - 1.2.3, en de overdracht van de maagd volwassen mannen en vrouwen in twee afzonderlijke, schone Petri gerechten. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Observatie en video-opname van paargedrag <ol><li> Bereid meerdere concave dia en voeg 200 ul steriel dd H 2 O aan elk van de putjes. </li><li> Pick-up de voorbereide maagd volwassen mannelijke of vrouwelijke en met een capillaire naald en zet slechts één nematode in het water van elke concave glijbaan. </li><li> Houd de maagd volwassenen in de put gedurende 1 uur om hen te laten passen aan de nieuwe waterige omgeving. </li><li> Combineer een maagd mannelijk en vrouwelijk door de overdracht van één van hen van de ene put naar de andere met behulp van een pipet. </li><li> Let op de paargedrag van de 1♀ + 1♂ combinatie in het concave dia onder een stereomicroscoop. </li><li> Om de paring efficiëntie van virgin volwassenen te analyseren, berekenen hun paring slagingspercentage (R) en te vergelijken met die van willekeurig geselecteerde volwassen paren. Bereken R als het percentage herhalingen waarin copulatie werd waargenomen vergeleken met het totale aantal duplo onderzocht. </li><li&gt; Om de paring keuze en intraseksuele concurrentie, de groep te onderzoeken en te observeren maagdelijke nematoden van twee verschillende combinaties: 1♀ + 3♂ en 3♀ + 1♂. </li><li> Om de gegevens te verzamelen voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse, filmen het paargedrag met behulp van video-microscopie. Gewoonlijk wordt de gehele paring, vanaf het moment waarop de nematoden in de put van het concave dia moment worden geplaatst wanneer zij zich na copulatie verplaatsen, voltooid binnen 2 uur. Daarom gaat opnemen de paring gedurende minstens 2 uur als een herhaling. Volledige tenminste 30 repliceert in totaal voor elke combinatie. NB: Voeg meer steriel dd H2O (gewoonlijk 50 pl) per 0,5 h naar de bron om te compenseren voor verdamping tijdens het opnameproces. </li></ol> 3. Data Collection <ol><li> Alle video voorzichtig op een computerscherm en karakteriseren van de sub-gedrag kwalitatief. </li><li> Meet de tijdsduur van de paring met behulp the beeld-voor-beeld-functie van de videorecorder. Handmatig aftrekken van de starttijd van het eindpunt. </li><li> Voor de 1♀ + 1♂ combinatie, analyseert elke video-opname en het meten van de duur van de volgende evenementen: <ol><li> Meet de duur van het zoeken (dwz de tijd tussen de vrouwelijke en mannelijke worden ingebracht in de put van het concave dia aan het moment dat ze ontmoeten en elkaar raken). </li><li> Meet de duur van contact (dat wil zeggen de tijd vanaf het eerste contact tot het moment waarop de mannelijke juist is gepositioneerd op de vrouwelijke vulva voor de eerste paring). </li><li> Meet de duur van copulerende (dat wil zeggen, de tijd vanaf het moment dat de man precies is gepositioneerd op vulva van het vrouwtje tot hij glijdt uit het lichaam van het vrouwtje na de zaadlozing). Opmerking: Sommige nematoden kan meerdere keren copuleren in 2 uur. In dit geval meet de duur van paring van de eerste paring aan het einde van de last een, inclusief de tijd daartussen. </li><li> Meet de duur van aanhoudende (dat wil zeggen de periode na de paring tot de mannelijke en vrouwelijke zwemmen afstand van elkaar en zijn gescheiden door een afstand van meer dan de lichaamslengte nematoden (meestal 1 mm)). </li></ol></li><li> Tel de copulatie frequentie en duur van elke copulatie en de gemiddelde duur van alle copulaties in 2 uur voor elk van de verschillende combinaties (dat wil zeggen, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ en 1♀ + 3♂). </li><li> Bereken het percentage paring succes voor het eerste contact (P) voor de verschillende combinaties van de slaagkans van paring na het eerste contact, die onmiddellijk en zonder onderbreking plaatsvindt. In het contact op te nemen fase, kan enkele contacten in acht worden genomen voordat de werkelijke copulatie. <ol><li> Wanneer de afstand tussen twee individuen is dan de lichaamslengte, eens een contact voorbij. Voor één repliceren, opnemen P 100% bij copulatie is waargenomen onmiddellijk na het eerste contact, zonder onderbreking, of 0,00% indien er geen copulatie werd waargenomen of als er copulatie maar na twee of meer contacten. LET OP: Er waren 30 herhalingen voor elke hier beschreven combinatie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
<li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wilt+disease%3A+a+threat+to+European+forestry%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Plant+Path%22%5BJournal%5D)">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li>
<li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus%3A+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Path%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li>
<li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Nemat%22%5BJournal%5D)">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li>
<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
<li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community+Wormbook%22%5BJournal%5D)">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li>
<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Behavioral tests zijn een fundamenteel aspect van de chemische ecologie, neurobiologie, moleculaire biologie en genetica. Nematoden, met name C. elegans, worden veelvuldig gebruikt voor onderzoek op dit gebied. Het paargedrag van C. elegans is eerder 10-11 onderzocht. Echter, B. xylophilus gonochoristic en verschillend van de tweeslachtige C. elegans en de paring heeft verschillende gedragskenmerken 9. Onlangs heeft het paargedrag van Bursaphelenchus okinawae...

De dennenematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner en Buhrer) Nickle, is een van de meest destructieve invasieve soorten, die het verwelken en uiteindelijk de dood van dennen veroorzaakt. Men neemt aan dat deze pathogene nematode inheems is in de VS, maar hij is getransporteerd naar verschillende landen, waaronder China, Japan, Zuid-Korea en Portugal. Onlangs is hij ook gemeld in Spanje, waarbij miljoenen dennen zijn omgekomen met enorme economische verliezen en een bedreiging voor de bosproductie en ecologische stabiliteit1-5.
Zodra een gastheerden is geïnfecteerd door dennenematoden, worden er snel duizenden miljoenen nakomelingen in de stam geproduceerd. Dit veroorzaakt disfunctie van het xyleem, wat resulteert in verwelking en uiteindelijk de dood van de gastheerboom6. Er is echter momenteel geen efficiënte manier om deze ziekte te bestrijden. Paringsgedrag kan een belangrijke rol spelen in de hoge vruchtbaarheid van deze nematode7. Daarom hebben we het paringsgedrag van B. xylophilus in het laboratorium onderzocht en geprobeerd een effectieve manier te vinden om zijn paring te verstoren en zijn vruchtbaarheid te verminderen.
Dit protocol is bedoeld om de gedetailleerde methoden te introduceren voor het verkrijgen van de maagdelijke volwassenen van B. xylophilus en om het paringsgedrag te observeren en te analyseren met behulp van een videorecorder en een stereomicroscoop. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een referentie voor gedragsstudies van andere nematoden.

<table><tbody><tr><td>B. xylophilus isolaat Nxy61</td><td></td><td></td><td>Geëxtraheerd uit Pinus massoniana in Ningbo-gebied van China</td></tr><tr><td>Grijze schimmelstam</td><td></td><td></td><td>Verkregen van Forestry Academy of China</td></tr><tr><td>Baermann trechters</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>falconbuizen</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipet</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>steriele dd H2O</td><td></td><td></td><td>Gesteriliseerd door hoge druk van stoom bij 121 &deg;C gedurende 30 min.</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA-medium</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laminaire stroom</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glas capillair</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stereoscoop</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>invers stereomicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>concave glijbanen</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

observatie en kwantificering van paargedrag in het dennenaaltje, bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Een methode voor de waarneming en kwantificeren van het paargedrag van het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus, werd opgericht in het kader van een stereomicroscoop. De paring efficiëntie van B. Xylophilus verbeteren en de kans op paring observatie te vergroten, maagdelijk volwassenen werden gekweekt en gebruikt voor het onderzoek. Eieren werden verkregen door het houden van de aaltjes in het water en het toestaan ​​van de vrouwtjes om eieren te leggen gedurende 10 min. De tweede fase juvenielen (J2) werden gesynchroniseerd door het incuberen van de eieren voor 24 uur bij 25 ° C in het donker, en het begin J4 werden verkregen door het kweken van de J2 met grijze schimmel, Botrytis cinerea, nog eens 52 uur. Op dit tijdstip konden de meeste J4 nematoden duidelijk onderscheiden als zijnde mannelijke of vrouwelijke genitale behulp van hun morfologie. De mannelijke en vrouwelijke J4 werden verzameld en gekweekt in twee afzonderlijke Petrischalen voor 24 uur tot maagdelijke volwassen nematoden krijgen. Een maagd mannelijke en een vrouwelijke maagd werden gekoppeld in een druppel water in de put van een concave slide. Het paringsgedrag werd gefilmd met een videorecorder onder een stereomicroscoop. De gehele duur van de paring proces was 82,8 ± 3,91 min (gemiddelde ± SE) en kan worden opgedeeld in 4 verschillende fasen: zoeken, contact op te nemen, copuleren, en slepende. De gemiddelde notulen van duur waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 en 7,2 ± 0,5, respectievelijk. Elf sub-gedragingen werden beschreven: het kruisen, het naderbij komen, ontmoeten, aanraken, hooping, het opsporen, het bevestigen, ejaculeren, het scheiden, rust, en roaming. Interessant, werd duidelijk intraseksueel concurrentie waargenomen wanneer een vrouwtje was gegroepeerd met 3 mannen of een man met 3 vrouwen. Dit protocol is nuttig en waardevol, niet alleen bij het onderzoek het paringsgedrag van B. xylophilus, maar ook als een referentie voor ethologische studies van andere nematoden.

De paring succespercentage (R) van maagdelijke volwassenen bedroeg 86,67% gemiddeld, die aanzienlijk hoger is dan die van de willekeurig geselecteerde volwassenen bedroeg: 13,33 ± 4,65% (V = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Figuur 2). Deze bevinding suggereert dat het gemakkelijker is om de paring gedrag van B. xylophilus met Virgin volwassenen dan met willekeurig geselecteerde volwassenen nemen. <p class="jove_content" fo:keep-together.within...

Een protocol voor het onderzoeken van het paringsgedrag van de dennennematode, Bursaphelenchus xylophilus, wordt gepresenteerd. Gedragskenmerken van B. xylophilus worden beschreven in het paringsproces.

Observatie en kwantificering van paargedrag in het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Het algemene doel van deze procedure is om het paringsgedrag van de dennehoutworm, Bursaphelenchus xylophilus, te observeren. Deze methode kan helpen bij het bevorderen van psychologische studies van de worm. Het gaat specifiek over het observeren van het paringsgedrag van de dennehoutworm.Het grote voordeel van deze techniek is dat ongeslachtelijke volwassenen kunnen worden verkregen, wat het veel gemakkelijker maakt om het paringsgedrag van volwassenen te observeren. De implicaties van deze techniek zijn puur gericht op de bredere studie van nematoden, omdat ze vergelijkbare levenscyclusgedragingen hebben. De demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het verkrijgen van ongeslachtelijke volwassen nematoden moeilijk is omdat de beperkingen van ontwikkelende nematoden oefening vereisen en het niet gemakkelijk is om mannetjes en vrouwtjes in de vroege eerste stadium-jongens nauwkeurig te onderscheiden.Om dennehoutwormen te kweken, bereidt u eerst aardappel-dextrose-agarplaten voor. Om een plaat te inoculeren, prikt u een stuk schimmelmat met een diameter van 10 millimeter van een betritus senaria-mat, en plaatst u deze in het midden van een nieuwe PDA-plaat. Cultiveer de schimmelmat gedurende vijf dagen bij 25 graden Celsius in het donker.Na vijf dagen voegt u de dennehoutwormen toe aan de voorbereide petrischaal en kwekt u ze gedurende drie dagen bij 25 graden Celsius in het donker. Om de wormen van de schimmel te isoleren, bereidt u eerst een verzamelgereedschap. Plaats een geklemde rubberen buis onder een trechter, en houd de voorbereide trechter in een rek om de baermann-trechterinrichting te monteren.Plaats vervolgens twee lagen filterpapier in de mond van de trechter in plaats van gaas. Breng nu de schimmelculturen over naar de trechteropstelling en voeg water toe totdat de schimmelmat is ondergedompeld. Na twee uur komen de wormen uit de schimmelcultuur, steken het filterpapier over en nestelen zich in het laagste deel van de baermann-trechter.Verzamel de wormen door een 15 milliliterbuis onder de trechter te plaatsen, en laat vervolgens langzaam de klemming los om een paar druppels water te verzamelen, die de wormen zullen bevatten. Centrifugeer de wormverzamelingen bij 3.000 G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het bovenste waterniveau en suspendeer de wormen opnieuw in één milliliter water.Breng de wormensuspensie over naar een glazen schaal van zes centimeter en voeg drie milliliter water toe om de wormen vrij te laten zwemmen. Verzamel nu eieren om ongeslachtelijke voorraden te maken. Breng de schaal over naar een donkere incubator en laat de zwangere vrouwtjes eieren leggen gedurende 10 minuten.Vanwege hun glycoproteïne-oppervlak zullen de eieren aan het glas blijven kleven. Verwijder vervolgens het water met de wormen voorzichtig om de aan het schaaltje vastzittende eieren niet te verstoren. Voeg dan snel 3 milliliter water terug toe aan het schaaltje om te voorkomen dat de eieren uitdrogen.Herhaal dit proces van het schoonmaken van eieren minstens drie keer om alle larven en volwassenen te verwijderen en zuivere eieren te verkrijgen. Voeg vijf milliliter water toe aan de gewassen zuivere eicollectie en ga verder met het ontwikkelen van de eieren in het donker bij 25 graden Celsius. 24 uur na het starten van de eicultuur, verzamelt u de uitgekomen J2-larven.Breng de J2-larven voorzichtig over in een 15 milliliterbuis. Centrifugeer vervolgens de collectie bij 3.000 G gedurende twee minuten. Verwijder het bovenste waterniveau en voeg 200 microliters water terug toe.Vervolgens kweekt u de J2-larven op een PDA-plaat voorbereid met een mat van schimmel. Na 52 uur zullen de meeste J2-larven zich hebben ontwikkeld tot vroege J4-larven. Monteer een baermann-trechter en trek de wormen gedurende twee uur uit de schimmelculturen, zoals eerder beschreven.Terwijl u wacht, bereidt u een naald voor om de wormen op te pakken. Trek een punt van een glazen capillair verwarmd over een alcoholbrander. De punt moet ongeveer 50 micron in diameter zijn, ongeveer de lichaamsbreedte van een volwassen worm.Na twee uur brengt u de J4-larven over in een schone petrischaal zoals eerder beschreven. Bepaal nu het geslacht van de wormen onder een stereomicroscoop. Ongeveer tweederde van de larven zijn meestal vrouwelijk.De vulva van de vrouwtjes is duidelijk anders dan de anatomie van de mannetjes, maar omdat de wormen erg actief zijn, zal geslachtsonderscheiding oefening vergen. De meest cruciale stap in dit protocol is om mannetjes en vrouwtjes nauwkeurig te onderscheiden en te scheiden in het vroege eerste stadium. Anders zullen er gemengde en slechte wormen zijn wanneer ze volwassen worden.En dat maakt het moeilijk om de paring te observeren. Selecteer en breng de wormen geleidelijk over naar een druppel water op een schuif voor mannetjes of vrouwtjes. Om succes te garanderen, moeten twee verschillende personen de geslachtsverdeling dubbel controleren.Breng nu de waterdruppel met de geslachtsverdeelde wormen over naar een geschikte schimmelcultuurplaat. Kweek vervolgens de ongeslachtelijke wormen nog eens 24 uur voordat u hun paringsgedrag bestudeert. Om het paringsgedrag van dennehoutwormen te observeren, bereidt u eerst verschillende holle schuiven voor door 200 microliters water toe te voegen aan elk van hun putjes.Kies vervolgens een enkele voorbereide ongeslachtelijke volwassene en breng deze over naar een voorbereide schuif. Houd de ongeslachtelijke volwassenen een uur binnen in de put om ze te laten wennen aan de nieuwe waterige omgeving. Voeg na een uur een enkele ongeslachtelijke volwassene van het andere geslacht toe aan de put, met behulp van een pipet.Observeer vervolgens het paringsgedrag onder een stereomicroscoop en film het gedrag voor kwantitatieve analyse. Het hele paringsproces is meestal binnen twee uur voltooid. Elke 30 minuten voegt u

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Entomopathogene aaltjes-grondbewonende rondwormen die een brede waaier van insecten parasiteren. We tonen bemonsteringsmethoden voor de isolatie van deze nematoden uit de bodem met behulp van twee technieken: de insecten lokken en de gewijzigde White val, voor het herstel van nematoden uit bodemmonsters en geïnfecteerde insecten kadavers, respectievelijk.

Grondmonstername en isolatie van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidea)

Gedragstests bieden krachtige hulpmiddelen voor het begrijpen van neuronale functie. Hier presenteren we verschillende protocollen voor het kwantificeren van roofzuchtig voedingsgedrag dat wordt aangetroffen in het modelrondworm Pristionchus pacificus en zijn verwanten. Bovendien bieden we methoden voor het analyseren van roofzuchtige voedingsaanpassingen, inclusief mondstructuren en tanden.

Het testen van Predatory Feeding gedrag in<em&gt; Pristionchus</em&gt; En andere Nematoden

We analyseren een analyse om de milieu- en genetische signalen te analyseren die invloed hebben op paringsgedrag in de vruchtvlieg Drosophila melanogaster .

Een methode om het effect van milieueisen op paring gedrag in te testen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Het gebruik van een aangepast "olfactorische chip" voor de efficiënte calcium beeldvorming van C. elegans mannetjes wordt hier beschreven. Studies van mannelijke Gasbedwelming met behulp van glycerol en een feromoon worden ook weergegeven.

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

Stuurman bewaken gedrag speelt een belangrijke rol bij de voortplanting van intertidal roeipootkreeften van het geslacht Tigriopus. Methoden voor het bestuderen van dit probleem zijn echter niet goed beschreven geweest. Hier beschrijven we methoden voor: 1) individuele cultuur van maagdelijke Tigriopus dieren, en 2) kwantitatieve analyse van hun stuurman bewaken gedrag.

Individuele kweken van Tigriopus copepoden en kwantitatieve analyse van hun stuurman bewaken gedrag

In dit protocol, worden methoden voor het uitvoeren van inteelt kruisen, en voor de beoordeling van het succes van deze kruisen, beschreven voor de mier Vollenhovia emeryi. Deze protocollen zijn belangrijk voor experimenten gericht op het begrijpen van de genetische basis van geslacht bepaling systemen in de Hymenoptera (Vliesvleugeligen).

Inductie en evaluatie van inteelt kruisen met behulp van de mier, Vollenhovia Emeryi

Het sperma moet met succes door de eileider navigeren om een eicel te bevruchten. Hier beschrijven we een assay voor het meten van sperma migratie binnen de C. hermafrodiet baarmoeder. Deze analyse kan kwantitatieve gegevens over sperma distributie binnen de baarmoeder na het koppelen, evenals op snelheid, richtings snelheid, en omkerings frequentie verstrekken.

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

Hier introduceren we een gedetailleerde soaking-methode van RNA-interferentie in Bursaphelenchus xylophilus om de studie van genfuncties te vergemakkelijken.

Toepassing van RNA-interferentie in de dennenaaltjes, Bursaphelenchus xylophilus

Dit protocol stelt methoden vast voor het extraheren en kwantificeren van reacties op het vluchtige seksferomoon in C. elegans, en biedt hulpmiddelen om chemische communicatie en navigatietraject te bestuderen.

Vluchtige seksferomoonextractie en chemo-aantrekkingstest bij Caenorhabditis elegans

Het protocol beschrijft de in vivo en in vitro dennenhoutnematodeninfectie van Pinus pinaster en hun vluchtige-analyse door middel van gaschromatografie (GC) en GC gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS).

Infectie van in vivo en in vitro dennen met de dennenhoutnematode Bursaphelenchus xylophilus en isolatie van geïnduceerde vluchtige stoffen

Dit protocol beschrijft een methode voor het induceren van de verspreiding van juvenielen van de derde fase (pre-dauer juvenielen, JIII.) van Bursaphelenchus xylophilus in cryptobiose door osmotische regulatie van kaliumchloride (KCl) ionen. Deze methode kan technische ondersteuning bieden voor onderzoek naar de stressbestendigheidsmechanismen van B. xylophilus.

Induceren van de inducatie van verspreidingsjuvenielen van Bursaphelenchus xylophilus in de derde fase in cryptobiose door osmotische regulatie

Leer een protocol om paargedrag te observeren bij het dennenaaltje Bursaphelenchus xylophilus. Deze methode maakt het mogelijk om maagdelijke volwassenen te verkrijgen voor gedragsstudies.

Observatie en kwantificering van paargedrag in het dennenaaltje, Bursaphelenchus xylophilus

Meer video's verkennen