Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau
January 10th, 2017
Een microfluïdische chip werd vervaardigd om paren gouden stippen te produceren voor tandem bubbeltjesgeneratie en fibronectine-gecoate eilandjes voor nabijgelegen single-cel patterning. Het resulterende stromingsveld werd gekenmerkt door deeltjesbeeldsnelheidsmeting en werd gebruikt om verschillende bioeffecten te bestuderen, waaronder celmembraan poratie, membraanvervorming en intracellulaire calciumrespons.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om cavitatie-geïnduceerde bio-effecten in microfluïdische beperking te onderzoeken met behulp van oppervlaktepatroon om de generatie van tandembubbels en de locatie en vorm van de individuele doelcellen nauwkeurig te controleren. Dit microfluïdische systeem maakt experimenten mogelijk met deze transitcavitatiedruppels en cellen die relevant zijn voor therapeutische en geluidspublicatie en geluidsbewerking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek komt van de verbetering van de precisie van oppervlaktepatroon.
Het stelt ons in staat om de bio-effecten van individuele cellen te bestuderen en is een hoge stroombelasting van betrouwbare bubbel-bubbelinteractie. Visuele demonstratie van de procedures is cruciaal, aangezien de oppervlaktepatroon en celvoorbereiding in de chip-stappen complex zijn en verschillende technieken en tips vereisen. Voer alle microfabricageprocedures uit in een cleanroom met een cleanroompak.
Ontwerp het gebied van elke gouden stip binnen 25 tot 30 vierkante micron, zodat het groot genoeg is om laserenergie te absorberen voor bubbelgeneratie, maar klein genoeg om te voorkomen dat individuele cellen eraan hechten. Reinig de glazen plaat in een chemische kap volgens het tekstprotocol en ga vervolgens naar de spincoatingkap. Programmeer de spincoder om in twee seconden te versnellen tot 1000 RPM en die snelheid gedurende vijf seconden te behouden, vervolgens te laten versnellen tot 3000 RPM in drie seconden en die snelheid gedurende 30 seconden te behouden.
Bevestig vervolgens de glazen plaat aan de spincoder met behulp van de vacuüm. Bedek vervolgens de plaat met P20 en start de spincyclus. Pas vervolgens NFR negatieve fotoweerstand toe met behulp van dezelfde cyclus.
Bakken nu de plaat op een hotplate bij 95 graden Celsius gedurende 60 seconden. Na afkoeling tot kamertemperatuur voer de fotolitografie uit. Monteer de chroommasker op de maskeraligner en zorg ervoor dat de patroonzijde naar de plaat is gericht.
Stel vervolgens de fotolitografiereceptie in op harde blootstellingsmodus met negen seconden UV-blootstelling en lijn het glazen substraat uit met het masker. Na de UV-blootstelling, bak de plaat bij 95 graden Celsius gedurende een minuut en laat het vervolgens afkoelen zoals voorheen. Om het patroon op de plaat te ontwikkelen, plaats het 60 seconden in ontwikkelaaroplossing, was de plaat vervolgens met gedestilleerd water en droog het met stikstofgas.
Na bevestiging van het patroon door microscopisch onderzoek, bak de plaat bij 120 graden Celsius gedurende vijf minuten en laat het vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Reinig nu de plaat met plasma in de reactieve ionetchingmachine gedurende 90 seconden bij 500 tor en 100 watt. Gebruik een E-beam evaporator, plak de steekproef op de plaathouder.
Programmeer de machine om een 5 nanometer laag titanium te deponeren, gevolgd door een 15 nanometer laag goud. Zodra die positie is voltooid, ventileer de machine. Week vervolgens de plaat een nacht in een beker met fotoresistverwijderaar oplossing om het goud dat op de bovenkant van de NFR-weerstand rust te verwijderen.
De volgende dag, was de plaat met aceton, gevolgd door IPA en droog het met stikstof. Spoel de plaat met DI-water en droog het opnieuw met stikstof. Verwarm nu de plaat gedurende vijf minuten bij 115 graden Celsius.
Reinig vervolgens de gouden stippenpatroonplaat met behulp van een zuurstofplasmaa-asher bij 100 watt gedurende 90 seconden. Stel het gebied van elk fibronectine gecodeerd eiland in om binnen 700 tot 900 vierkante micron te zijn om voldoende hela-celverspreiding in een vierkant gebied te vergemakkelijken terwijl de kans op meerdere cellen die zich op het eiland verzamelen wordt geminimaliseerd. Fabricage is veel zoals die van het goudpatroon.
Spincode de plaat zoals eerder met behulp van S18 positieve fotoweerstand en bak op de codering bij 115 graden Celsius. Voer vervolgens fotolitografie uit, lijn de markeringen op het masker uit met die op het substraat. Controleer het patroon op het centrale gedeelte om de juiste hoek te bevestigen en pas de afstand van de gouden stippen tot het H-patroon aan.
Voer de UV-blootstelling gedurende negen seconden uit zonder postbakken. Het volgende verschil is dat de ontwikkelingsstap slechts 45 seconden duurt. Voor de reactieve ionetching, stel de parimeters in op 500 tor 100 watt en 90 seconden.
Breng vervolgens een druppel PLLG peg passivating oplossing aan op een stuk paraffinefilm en sandwich de oplossing naar de patroonzijde van de plaat. Vermijd het vangen van bubbels. Verwijder na 45 minuten de plaat van de film.
Spoel de plaat af met DI-water en droog het vervolgens met stikstof. Week de plaat vervolgens achtereenvolgens in fotoresistverwijderaar 1165. Vervolgens 50 procent 1165 in DI-water.
Vervolgens alleen DI-water. Tijdens elk bad, schud de oplossing gedurende 90 seconden in een ultrasoonbad. Droog nu de plaat op een hotplate, sluit deze dan in een droogkast en bewaar het bij 4 graden Celsius.
Assembleer de plaatjes tot een microkanaalchip zoals beschreven in het tekstprotocol. Besteed zorgvuldige aandacht aan het afschermen van het gepatroneerde gebied van de glazen substraat met de kleine PDMS-plaat voordat u reactieve ionetching gebruikt om de PLLG-peg uit het perifere gebied te verwijderen. Haal het gepatroneerde glas uit de RIE-machine en verwijder de kleine PDMS-plaat.
Na behandeling van het microkanaal PDMS met een verminderde dosis zuurstofplasma, lijn het uit met het gepatroneerde glazen substraat onder een stereoscoop. Breng het microkanaal PDMS en het gepatroneerde glazen substraat in conformiteit met contact. Ga nu door met het gebruik van de chip.
Prime eerst de chip door PBS gedurende 30 minuten door het microkanaal te laten stromen met een microliter per minuut. Spuit vervolgens de chip gedurende 45 minuten met fibronectineoplossing met dezelfde strooms
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt cavitatiegeïnduceerde bio-effecten in microfluïdische beperking, waarbij oppervlaktepatronering wordt gebruikt voor nauwkeurige controle over bubbeltjesgeneratie en celplaatsing. De microfluïdische chip maakt het mogelijk om bio-effecten zoals celmembraanporering en intracellulaire calciumrespons te onderzoeken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Celbiologie
- Bio-effecten van cavitatie
Achtergrond
- Microfluïdische systemen maken gecontroleerd experimenteren met bubbels en cellen mogelijk.
- Oppervlaktepatronering verbetert de precisie bij celplaatsing en bubbeltjesgeneratie.
- Het begrijpen van bio-effecten is cruciaal voor therapeutische toepassingen.
- Visuele demonstraties helpen bij het begrijpen van complexe procedures.
Doel van het onderzoek
- Om de bio-effecten van cavitatiebuikels op individuele cellen te onderzoeken.
- Om oppervlaktepatronering te gebruiken voor nauwkeurige controle in experimenten.
- Om de impact van bubbeltjesinteracties op celgedrag te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een microfluïdische chip voor bubbeltjesgeneratie.
- Karakterisering van stromingsvelden met behulp van deeltjesbeeldsnelheidsmeting.
- Onderzoek naar celmembraanporering en -deformatie.
- Meting van intracellulaire calciumreacties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van tandembubbeltjes en gepatroneerde cel-eilandjes.
- Karakterisering van stromingsvelden gaf inzichten in bubbeltjesdynamiek.
- Gewaargenomen bio-effecten omvatten membraanporering en calciumrespons.
- Oppervlaktepatronering verbeterde de experimentele precisie aanzienlijk.
Conclusies
- Het microfluïdische systeem is effectief voor het bestuderen van cavitatiegeïnduceerde bio-effecten.
- Oppervlaktepatronering is een waardevolle techniek voor het controleren van celinteracties.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van therapeutische toepassingen van cavitatie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Precise microfluidic systems with surface patterning enable controlled investigation of cavitation-induced bioeffects at the single-cell level, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This platform allows for reproducible interrogation of cell membrane responses and intracellular signaling under defined shear stress conditions. Such capabilities enhance predictive confidence for therapeutic hypothesis testing and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of cell membrane poration and deformation under controlled jetting flow.
- Supports functional target validation by quantifying localized bioeffects at single-cell resolution.
- Facilitates predictive confidence in pathway modulation by measuring intracellular calcium responses.
- Provides a platform for biological de-risking through precise manipulation of cell-bubble interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated microfluidic systems for downstream single-cell analysis workflows.
- Standardizes assay conditions by controlling cell placement and bubble generation via surface patterning.
- Enables reproducible quantitative outputs such as membrane strain and macromolecule uptake.
- Supports reliable evaluation of compound or intervention effects on cell bioresponses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling localized shear stress and cellular response.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation through quantitative single-cell bioeffect measurement.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying cellular response heterogeneity.
- Supports predictive de-risking for translational biomarker development when relevant.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic system integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of cavitation-induced effects and pathway clarification at the single-cell level.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility through standardized patterning and bubble generation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of membrane deformation, macromolecule uptake, and calcium signaling.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by modeling localized cellular bioeffects relevant to therapeutic interventions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable microfluidic platform adaptable to various cell types and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of single-cell bioeffect assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cellular response thresholds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, surface patterning, and high-speed imaging.
- Needs access to clean room facilities, pulsed lasers, and advanced microscopy infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible cell patterning and bubble generation.
- Adaptable to different cell types and experimental conditions with protocol optimization.
- Practical limitations include the complexity of fabrication and the need for precise alignment and timing control.
