Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om door cavitatie geïnduceerde bio-effecten in microfluïdische opsluiting te onderzoeken, waarbij oppervlaktepatronering wordt gebruikt om de generatie van tandem-bellen en de locatie en vorm van de individuele doelcellen nauwkeurig te beheersen. Dit microfluïdische systeem maakt experimenten mogelijk met deze overgang van cavitatiebellen en cellen die relevant zijn voor therapeutische toepassingen en geluidsoperaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek komt voort uit de verbeterde precisie door oppervlaktepatronering.

Het stelt ons in staat om de bio-effecten van individuele cellen te bestuderen en biedt een hoge stroombelasting dankzij betrouwbare bel-bel-interactie. Een visuele demonstratie van de procedures is essentieel, aangezien de stappen voor oppervlaktepatronering en celpreparatie in de chip complex zijn en diverse technieken en tips omvatten. Voer alle microfabricageprocedures uit in een cleanroom terwijl u een cleanroompak draagt.

Ontwerp het oppervlak van elke gouden stip tussen de 25 en 30 vierkante micron, zodat deze groot genoeg is om laserenergie te absorberen voor de generatie van bellen, maar klein genoeg om te voorkomen dat individuele cellen eraan hechten. Reinig het glazen objectglas in een chemische zuigkast volgens het tekstprotocol en ga vervolgens naar de spincoating-zuigkast. Programmeer de spincoater om in twee seconden te versnellen naar 1000 RPM en deze snelheid vijf seconden vast te houden, om vervolgens in drie seconden te versnellen naar 3000 RPM en deze snelheid 30 seconden vast te houden.

Bevestig vervolgens het glazen objectglas aan de spin-coater met behulp van het vacuüm. Bedek het objectglas daarna met P20 en start de spin-cyclus. Breng vervolgens NFR negatieve fotolak aan met behulp van dezelfde cyclus.

Bak het objectglas nu op een warmteplaat bij 95 degrees celsius gedurende 60 seconden. Zodra het is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt de fotolithografie uitgevoerd. Plaats het chroommasker in de maskeruitlijner en zorg ervoor dat de zijde met het patroon naar beneden, richting het objectglas, is gericht.

Stel vervolgens het fotolithografierecept in op de harde belichtingsmodus met negen seconden UV-belichting en lijn het glazen substraat uit met het masker. Bak de slide na de UV-belichting één minuut lang op 95 °C en laat deze daarna, zoals voorheen, afkoelen. Om het patroon op de slide te ontwikkelen, plaatst u deze gedurende 60 seconden in de ontwikkelaar, waarna u de slide wast met gedestilleerd water en droogt met stikstofgas.

Nadat het patroon via microscopische inspectie is bevestigd, wordt het objectglas vijf minuten gebakken bij 120 degrees celsius en afgekoeld tot kamertemperatuur. Reinig vervolgens het objectglas met plasma in de reactieve ion-etser gedurende 90 seconden bij 500 tor en 100 watts. Bevestig het monster met tape aan de platenhouder van een E-beam evaporator.

Programmeer de machine om een laag titanium van 5 nanometer te deposeren, gevolgd door een laag goud van 15 nanometer. Zodra die positie is voltooid, dient de machine te worden geventileerd. Week het objectglas vervolgens een nacht in een bekerglas met een oplosmiddel voor het verwijderen van fotoresist om het goud dat bovenop de NFR-resist ligt te verwijderen.

Was de volgende dag de slide met aceton, gevolgd door IPA en droog deze vervolgens met stikstof. Spoel de slide met DI-water en droog deze opnieuw met stikstof. Verhit de slide nu vijf minuten bij 115 °C.

Reinig vervolgens de slide met het gouden stippenpatroon met een zuurstofplasma-asher bij 100 watts gedurende 90 seconden. Stel het oppervlak van elk met fibronectine gecodeerd eilandje in op 700 tot 900 vierkante micron om een adequate spreiding van HeLa-cellen in een vierkant gebied te faciliteren, terwijl de kans dat meerdere cellen op het eilandje aggregeren wordt geminimaliseerd. De fabricage is vergelijkbaar met die van het gouden patroon.

Breng de code op de slide aan door deze zoals voorheen te spinnen met S18 positieve fotoresist en bak de codering vervolgens bij 115 degrees celsius. Voer daarna fotolithografie uit, waarbij de markeringen op het masker worden uitgelijnd met die op het substraat. Controleer het patroon op het centrale gedeelte om de juiste hoek te bevestigen en pas de afstand tussen de gouden stippen en het H-patroon aan.

Voer de UV-belichting uit gedurende negen seconden zonder nabakken. Het volgende verschil is dat de ontwikkelingsstap slechts 45 seconden duurt. Stel voor het reactieve ionenetsen de parameters in op 500 tor, 100 watt en 90 seconden.

Breng vervolgens een druppel PLLG peg-passiveringsoplossing aan op een stuk paraffinefolie en klem de oplossing tegen de zijde van de slide met het patroon. Voorkom dat er luchtbellen ontstaan. Verwijder de slide na 45 minuten van de folie.

Spoel het objectglas af met gedemineraliseerd water en droog het vervolgens met stikstof. Week het objectglas daarna opeenvolgend in photoresist remover 1165 en vervolgens in een oplossing van 50 procent 1165 in gedemineraliseerd water.

Vervolgens alleen gedeïoniseerd water. Roer de oplossing tijdens elk bad gedurende 90 seconden in een ultrasoon bad. Droog het objectglas nu op een warmteplaat, verzegel het vervolgens in een exsiccator en bewaar het bij 4 graden celsius.

Assembleer de slides tot een microkanaalchip zoals beschreven in het tekstprotocol. Let er nauwkeurig op het patroongebied van het glaas-substraat af te schermen met de kleine PDMS-plaat voordat reactieve ionenetzing wordt gebruikt om de PLLG-peg uit het perifere gebied te verwijderen. Haal het gepatroneerde glas uit de RIE-machine en verwijder de kleine PDMS-plaat.

Nadat het microkanaal-PDMS is behandeld met een verlaagde dosis zuurstofplasma, wordt het onder een stereoscoop uitgelijnd met het gepatroneerde glassubstraat. Breng het microkanaal-PDMS en het gepatroneerde glassubstraat in conform contact. De chip kan nu worden gebruikt.

Prime eerst de chip door gedurende 30 minuten PBS door het microkanaal te laten stromen met een stroomsnelheid van 1 µL per minuut. Infuseer vervolgens de chip gedurende 45 minuten met een fibronectine-oplossing bij dezelfde stroomsnelheid. Bereid tijdens het wachten de cellen voor in een concentratie van 5 miljoen cellen per milliliter.

Een gezonde status en een hoge confluentie zijn cruciaal voor deze procedure. Vervang vervolgens de oplossing die door de chip stroomt door PBS en verhoog de stroomsnelheid naar 10 µL per minuut. Laat de PBS vijf minuten doorstromen.

Inject vervolgens de voorbereide cellen met een spuit in de chip. Wanneer er één druppel uit de slang is gestroomd, stopt u de injectie en klemmen we de uitlaat af. Plaats de chip daarna gedurende 30 minuten in een incubator.

Laat daarna de uitlaat los en spoel de chip vijf minuten lang door met celkweekmedium met een snelheid van 10 µL per minuut. Verlaag na vijf minuten de flow naar 0,75 µL per minuut en plaats de chip en de pomp gedurende twee uur in een incubator. Ga na twee uur verder met de generatie van tandem-bellen terwijl u de chip bekijkt onder een omgekeerde microscoop met twee gepulste NDI-lasers op timingregelaars gericht op het gouden stippatroon, en met een hogesnelheidscamera klaar om de resultaten vast te leggen.

Stel voor bellen van 50 micron de vertraging tussen de twee lasers in op 2,5 microseconden en stel hun vermogen in op tien microjoules. Synchroniseer vervolgens de opname van de hogesnelheidscamera met de lasers en maak opnames met twee miljoen frames per seconde en belichtingstijden van 200 nanoseconden. Op deze manier worden de dynamiek van de bellenexpansie, de collaps, de bellen-belleninteractie en de jetvorming vastgelegd.

Interacties tussen bellen en diverse door cavitatie geïnduceerde bioeffecten werden op single-celniveau bestudeerd met behulp van de beschreven techniek, zoals de transiënte interacties van tandem bellen met jetvorming, de visualisatie van het resulterende stromingsveld en de berekening van de jetsnelheid. De directionele jetstroom rond de tandem bel is ongeveer tien meter per seconde, is ongeveer tien micron breed en is daarmee in staat om een impulsieve en gelokaliseerde schuifspanning en spanningsgradiënt op nabijgelegen doelcellen uit te oefenen. Ook de door tandem bellen geïnduceerde celmembraandeformatie werd bestudeerd.

Membraandeformatie en -herstel worden gehighlight door de verplaatsing van gefunctionaliseerde kraaltjes die aan de voorzijde van het celmembraan zijn bevestigd. De lokale oppervlaktestrekking werd berekend op basis van de coördinaten van een triade aangrenzende kraaltjes. Dit schema toont de maximale oppervlakteverandering op verschillende locaties op het celoppervlak.

De voorzijde wordt primair uitgerekt, terwijl de achterzijde of de laterale zijden van de cel worden gecomprimeerd, wat wijst op heterogeniteit en celdeformatie veroorzaakt door de jetting-stroom geïnduceerd door de tandem-bel. De temporele variatie van de oppervlaktestrekking aan de voorzijde van de cel bestaat uit een paar snelle oscillaties, gevolgd door een grote en aanhoudende rek gedurende ongeveer 100 microseconden, en een daaropvolgend geleidelijk herstel op een tijdschaal van enkele milliseconden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een controleerbare bel-bel interactie kunt creëren om de bio-effecten van individuele cellen met een gecontroleerde vorm en locatie vanuit oppervlaktepatronering te bestuderen.

Na deze procedure kunnen andere maatregelen, zoals het uitdunnen van het cytoskelet en conjugale beeldvorming, verder worden uitgevoerd om de reorganisatie van het celcytoskelet na de tandem-bubbelbehandeling te bestuderen. Na de ontwikkeling zal deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van subpretische echografie om captatie-geïnduceerde bio-effecten op enkelcelniveau te onderzoeken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een goede celconfluentie en conditie essentieel zijn voor het succes van de celpatroonvorming.

Vergeet niet dat werken met chemicaliën in cleanrooms en lasers extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en een lasersbril, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.