Name: Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer hoe cavitatie-induceerde bio-effecten op enkelvoudige cellen worden onderzocht met een microfluïdische chip en oppervlaktepatronen. Deze methode maakt precieze controle over belgeneratie en celplaatsing mogelijk voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de gebruikmaking van de schone ruimte SMIF-faciliteit aan de Duke University erkennen. We willen ook Hao Qiang bedanken voor zijn hulp bij het meten van de straalsnelheid. De auteurs danken Todd Rumbaugh van Hadland Imaging voor het verstrekken van de Shimadzu HPV-X-camera die in dit onderzoek is gebruikt. Het werk werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH via subsidies 5R03EB017886-02 en 4R37DK052985-20.

1. Microfabricage LET OP: Alle microfabrication procedures worden uitgevoerd in een cleanroom. Een chromen masker is ontworpen voor de microfabrication, zie figuur 2. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig2.jpg" /> Figuur 2: Schematische voorstelling van het kanaal ontwerp in de microfluïdische chip en de afmetingen van de werkeenheden. a) Masker ontwerp van de uitgelijnde PDMS microkanalen (groen) en de patronen op het glassubstraat (blauw en rood). b) vergrote afbeelding van het masker ontwerp in een representatief deel van de werkende unit arrays. c) Schematische voorstelling van een werkeenheid die een cel patroon (blauw) en een paar gouden stippen (rood). Alle lengteschalen worden getoond op de rechts onderaan. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een LAR bekijken</a>ger versie van deze figuur. <ol><li> Gold dot patroonvorming Opmerking: Het gebied van elk punt goud is ontworpen om binnen 25-30 urn 2, zodat deze groot genoeg is om laserenergie absorberen vorming van belletjes, maar klein genoeg om individuele cellen hechten te vermijden. Een schema voor het goud dot fabricage is getoond in figuur 3a. <ol><li> Glasplaatje schoonmaak (in een chemische kap) <ol><li> Spoel het glaasje met aceton gevolgd door isopropylalcohol (IPA), en droog hem vervolgens met een stroom N2. </li><li> Week de dia in piranha-oplossing (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) gedurende 10 min. </li><li> Haal de dia, spoelen met DI water en droog hem vervolgens met een stroom N2. </li><li> Bak het glaasje op een verwarmingsplaat bij 120 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Behandel de dia in een plasma Asher bij 100 W gedurende 90 s. </li></ol></li><li> Spin-coating (spin-bekledingskap) <ol><li> Zet op een kookplaat en wacht tot de temperatuur stabiel is bij 95 ° C. </li><li> Volg de coating procedure: 1000 rpm gedurende 5 s met 500 rpm / s ramp; dan 3000 rpm gedurende 30 s met een 1000-rpm / s helling. </li><li> Bevestig de gereinigde glasplaatje op de spin coater door een vacuüm. </li><li> Bedek het glijoppervlak met P-20 en start de coating recept. </li><li> Herhaal de coating proces voor het NFR-negatieve fotoresist. </li><li> Bak de schuif bij 95 ° C gedurende 60 s en wacht tot hij is afgekoeld tot kamertemperatuur. </li></ol></li><li> fotolithografie <ol><li> Monteer de chromen masker op het masker aligner en zorg ervoor dat het patroon kant naar beneden in de richting van de dia. </li><li> Stel de fotolithografie recept om belichtingsstand hard met 9 s van UV-blootstelling en snel uitlijnen van de glazen substraat met het masker. </li><li> Na het uitvoeren van de blootstelling aan UV, bak de dia bij 956; C gedurende 1 minuut, en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Ontwikkeling <ol><li> Ontwikkelen van de patroon op de dia in de ontwikkelaar oplossing voor 60 s. </li><li> Verwijder de schuif van de ontwikkelaar, spoelen met DI water en droog het met N2 flow. </li><li> Controleer het patroon geometrie onder een microscoop, en meten en de feature size opnemen. </li></ol></li><li> Gold depositie (E-beam verdamping) en lift-off <ol><li> Bak de glijbaan bij 120 ° C gedurende 5 minuten, en laat het afkoelen tot kamertemperatuur. </li><li> Maak de dia met plasma in de reactieve ionen etsen (RIE) machine gedurende 90 s bij 500 Torr en 100 W. </li><li> Borg 5 nm van Ti en 15 nm van Au op de dia met behulp van een e-beam verdamper 17. </li><li> Week de dia overnacht in een glazen bekerglas met fotoresist remover oplosmiddel goud rust bovenop de NFR verwijderen weerstaan. </li><li> Haal de glijbaan, flush it met aceton, gevolgd door IPA, en droog het met N2 flow. </li><li> Droog de dia een hete plaat bij 115 ° C voordat het zuurstofplasma asher reinigen bij 100 W gedurende 90 s. </li></ol></li></ol></li><li> Moleculair-assemblage patroonvorming door lift-off (MAPL) Opmerking: Het gebied van iedere fibronectine gecoate eiland is ingesteld op binnen 700-900 pm 2 voldoende HeLa cel verspreiding in een vierkant gebied terwijl het minimaliseren van de kans op meerdere cellen aggregeren op het eiland vergemakkelijken. Een schema voor de bereiding van cel-patroonvorming eilanden is weergegeven in figuur 3b. <ol><li> spincoating <ol><li> Herhaal stap 1.1.2, maar gebruik S1813-positieve fotoresist en een temperatuur van 115 ° C. </li></ol></li><li> Aligned fotolithografie <ol><li> Monteer de chromen masker op het masker aligner en zorg ervoor dat de kant met het patroon wordt naar beneden in de richting van de dia met degouden stippen. </li><li> Stel de fotolithografie recept om belichtingsstand hard met 9 s van blootstelling aan UV. </li><li> Lijn de bovenkant masker met het bodemobjectglaasje behulp uitrichtkenmerken, gelegen rond de rand van het masker, als ruimtelijke referentie. </li><li> Controleer het centrale gedeelte van het masker en controleer of het patroon functies correct zijn uitgelijnd. </li><li> Voltooiing van de blootstelling aan UV zonder een post-bakken. </li></ol></li><li> Ontwikkeling <ol><li> Herhaal stap 1.1.3, maar met 45 jaren van ontwikkeling voor het drogen op een kookplaat en het behoud in N 2 -opslag. </li></ol></li></ol></li><li> chemische behandeling <ol><li> Bereid de passiverende oplossing: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG in 10 mM HEPES buffer. </li><li> Haal de dia uit N2 opslag en reinig het met behulp van RIE met de parameter-instelling: 500-Torr druk van 100 W vermogen, en 90-s duur. </li><li> Pipetteer één druppel passiveren oplossing op een stuk film paraffine. &lt;/ Li&gt; <li> Sandwich de oplossing met de film en de glijbaan, zorg ervoor dat de kant met het patroon kenmerken is naar beneden in de richting van de film; voorkomen blaasvorming. </li><li> Wacht 45 minuten alvorens de schuif uit de film. </li><li> Geniet van de dia achtereenvolgens in fotoresist remover, fotolak remover en DI-water (1: 1), en DI-water, en schud het in een ultrasoon bad gedurende 90 s voor elke weken. </li><li> Droog de dia op een verwarmingsplaat om het vocht te verwijderen alvorens af te dichten in een exsiccator en opgeslagen in een koelkast. </li></ol></li><li> chip assemblage <ol><li> Herhaal de stappen 1.1.1-1.1.4, maar met SU8-2025-negatieve fotoresist en de parametrering bedoelde genaamd de Microchem protocol 18, een siliconen mal te bereiden met een fotomasker. </li><li> Vervaardig een PDMS microkanaal (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x B x H) en een kleine PDMS plaat (800 urn brede ril) met behulp van zachte lithografie. </li><li> Pons de microchannel voor vloeibare toegangspoorten en schoon te maken met tape en vervolgens met IPA. </li><li> Schild met patronen van de glassubstraat met de PDMS plaat en toepassen RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) PLL-g-PEG te verwijderen uit het randgebied. </li><li> Behandel de microkanaal met een lagere dosis van RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), en lijn naar de patroon glazen substraat (met de kleine PDMS plaat verwijderd); breng de microkanaal en het patroon glassubstraat in conform contact onder een stereoscoop. </li></ol></li></ol><img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig3.jpg" /> Figuur 3: Schema&#39;s voor microfabrication en chip montage. a) patroon van goud punten op het glassubstraat. b) Bereiding van het glazen substraat voor cellulaire patroonvorming via MAPL. c) Montage van de microfluïdische kanaal met plasma-bonding. Zie de Materialen List voor de definities of de afkortingen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="5"><li> celhechting OPMERKING: HeLa-cellen worden routinematig aangehouden in DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% antibioticum / antimitotische oplossing in een celkweek incubator. Een schematisch diagram van de chipeenheid en celhechting is weergegeven in figuur 3c. <ol><li> Prime de chip met PBS gedurende 30 min bij 1 ul / min en vervolgens giet fibronectine-oplossing (50 ug / ml in PBS, 1 pl / min) gedurende 45 min. </li><li> Afwachting, trypsinize celkweek met 0,25% trypsine-EDTA, was ze in kweekmedium centrifuge individuele cellen en reconstitueren de celsuspensie in voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium 5x10 6 cellen / ml. </li><li> Vervang de fibronectine-oplossing met PBS en spoel de chip aan 10 ul / min gedurende 5 min. </li><li> Injecterende bereide celsuspensie in de chip, stop de stroom, klem de uitlaat, en onderhouden van de chip in een celkweek incubator gedurende 30 minuten. </li><li> Laat de uitlaat en spoel de chip met celkweekmedium bij 10 ul / min gedurende 5 min. Verminder de perfusie debiet van het kweekmedium 0,75 pl / min en handhaven van de celkweek voor 2 uur in de incubator. </li></ol></li></ol> 2. Bubble Generation en Flow Visualisatie OPMERKING: Een schematische weergave van de experimentele opstelling wordt getoond in figuur 4a tandem vorming van belletjes en het resulterende stroom interactie met een enkele cel nabij gekweekt in een microfluïde kanaal. <ol><li> Genereren van tandem bellen met twee lasers en timingscontrole <ol><li> Plaats de microfluïdische chip op het podium van een omgekeerde microscoop en lijn de brandpunten van twee gepulste Nd: YAG lasers (λ = 532 nm, 5-ns pulsduur) op een paar gevormde gouden stippen gescheiden by 40 urn. </li><li> Gebruik een digitale vertragingsgenerator de twee lasers activeren tijdvertraagd ongeveer 2,5 microseconden twee bellen ingeleid op gouden dots produceren. </li><li> Stel de laser uitgangsenergie (~ 10 uJ) met een maximum diameter van de belletjes binnen 50 ± 2 urn. </li><li> Synchroniseer een high-speed camera (belichting 200 ns en 2 miljoen frames per seconde (fps)) naar de lasers en vastleggen van de dynamiek van de zeepbel van de uitbreiding, instorten, bubble-bubble interactie, en de vorming jet. </li></ol></li><li> Kwantificering van jet snelheid <ol><li> Noteer de positie van het spuitmondje (J 1) aan het proximale uiteinde van de eerste bel (B 1) en het distale uiteinde van B 1, beginnend bij het genereren van de tweede bubble (B 2) en eindigend met het neerkomen van J 1 naar het distale uiteinde van B 1; zie het schema in figuur 5a. </li><li> Lineair past het tijdsverloop van de positie voor both de proximale (jet tip) en de distale einden. Bereken de helling van de punt is ten opzichte tijdscurve voor het proximale uiteinde naar het jet snelheid te bepalen. Het snijpunt van de twee lijnen geeft de straal touchdown tijd. Meer details zijn te vinden in referentie 19. </li></ol></li><li> Visualisatie van de bubble-geïnduceerde stroom veld tandem <ol><li> Bereid 1 urn polystyreen (PS) kralensuspensie in DI-water (2,6% w / v) en injecteer de kralen in de microfluïdische chip. </li><li> Genereer tandem bellen zoals beschreven in stap 2.1.1-2.1.3. </li><li> Noteer de tandem bubble dynamiek met behulp van een high-speed video camera op een opnamesnelheid van 5 fps M met een 100-ns belichtingstijd. </li><li> Upload de verworven afbeelding sequentie in een commercieel PIV software. </li><li> Verdeel elk beeld in kleinere ondervraging ramen van 16 x 16 pixels (px) met een overlap van 75%. </li><li> Toepassen meerdere doorlopen iteratie en regionale filters om de fouten in snelheidsveld berekening verminderen, ende resultaten af ​​van een snelheidsvector kaart. </li></ol></li></ol><img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig4.jpg" /> Figuur 4: Schematische weergave van de experimentele opstelling en beeldopname. a) Experimentele opstelling voor tandem bubble generatie. b) De tijd die wordt gebruikt voor verschillende soorten beeldvorming acquisities. FL: fluorescentie microscopie, BF: helder veld, IFT: interframe tijd. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 3. Single-cell Analyse en Bioeffects OPMERKING: De tandem bel wordt geproduceerd naast de doelcellen en de resulterende bioeffects bestudeerd in een afstandsmeting-afhankelijke wijze. De tijdsvolgorde voor verschillende typen beelden worden afgebeeld in figuur 4b. <ol><li>Membraan perforeren en macromoleculaire opname OPMERKING: De opname van extracellulaire macromoleculen in de doelcel wordt gekenmerkt door de geleidelijke diffusie membraan impermeant propidiumjodide (PI) door de poratie plaats op het celmembraan. <ol><li> Na stap 1,5, vervangt het vaste kweekmedium (dwz DMEM) met PI oplossing (100 ug / ml in DMEM), dat op een perfusie stroomsnelheid van 0,5 ul / min gedurende het experiment. </li><li> Programmeer de microscoop control software om automatisch de PI fluorescerende kubus op de draaiende carrousel en synchroniseren van de timing van de CCD-camera met de PI-fluorescentie excitatie om de fluorescentie beelden vast te leggen met een belichtingstijd van 200 ms. </li><li> Nadat de twee brandpunten laser wordt afgestemd op een paar gouden stippen naast een doelcel, staat zowel helderveld (BF) en fluorescentie (FL) beelden voordat de tandem bubble behandeling. </li><li> Gebruik microscoop besturingssoftware onmiddellijkstart een time-lapse fluorescentie beeld opnemen van de doelcel kort na stap 2.1 de geschiedenis van PI opname vastleggen. </li></ol></li><li> membraan vervorming <ol><li> Bereid 1-um korrels (1% w / v, geactiveerd met wateroplosbaar carbodiimide) en functionaliseren ze met Peptide-2000 (100 ug / ml in PBS). </li><li> Na stap 1,5, incubeer de aangehechte cellen met het gefunctionaliseerde korrels met een dichtheid van 1x10 9 kralen / ml bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Herhaal stap 2.1 tot tandem bellen produceren naast het doel cel en noteer de cel vervorming met een ultra-high-speed camera draait op een opnamesnelheid van 5.000.000 fps. </li><li> Identificeren van een triade van 3 kralen die gedurende het experiment blijft de beeldvlak en hun positie als (x 1, y 1) (2 x, y 2) compileren en (3 x, y 3) in het experiment coördinaten. </li><li> Bereken de oppervlakte van de triade voor en afTER de tandem bubble behandeling met behulp van de formule: <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/55106/55106eq1.jpg" /></li><li> Bereken de oppervlakte stam als: <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/55106/55106eq2.jpg" /></li><li> Op basis van de coördinaten van de hoekpunten voor en na de behandeling tandem bubble Bereken het lokale hoofdrek Plaatselijke stam volgende vastgestelde protocollen 20,21. </li></ol></li><li> Levensvatbaarheid en apoptose LET OP: FITC Annexine V etiketten cellen, met inbegrip van apoptotische degenen, via de externalisering van fosfatidylserine (groene fluorescentie). PI labelt de kernen van necrotische cellen (rode fluorescentie). Helderveld beeldvorming wordt gebruikt om celmorfologie te documenteren en te helpen bij de identificatie van cellevensvatbaarheid en apoptose. <ol><li> Noteer de positie van elke behandelde cel in de microfluïdische kanaal (vergemakkelijkt door de adresetiketten in het kanaal, zie Figuur 2b </strong&gt;), terwijl het herhalen van stap 3.1. </li><li> Incubeer de behandelde cellen in het celkweekmedium nog 2 uur voordat perfuseren de chip met FITC- Annexine V oplossing gedurende 15 min. Positieve cellen weer groene fluorescentie. </li><li> Herhaal stap 3.3.2 24 uur na de tandem bubble behandeling langdurig bioeffects in de doelcellen te bestuderen. </li></ol></li><li> calcium reactie <ol><li> Meng 3 gl Fura-2:00 voorraadoplossing (1 mg / ml in DMSO) met 3 pl van 10% w / v Pluronic F-127 in 500 ui gereduceerd serum medium tot de uiteindelijke labelingoplossing (6 uM) te bereiden. </li><li> Na stap 1.5, vervang de celkweek medium met de etikettering oplossing en incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 40 minuten (1 pl / min perfusie tarief). </li><li> Vullen van het kanaal met de verminderde serum medium (0,75 ul / min perfusiesnelheid) voordat de cel experiment. </li><li> Start ratiometrische imaging (golflengte: 340/380 nm, 50-ms blootstelling)van de doelcel met het commerciële PTI systeem. </li><li> Na 10 s van ratiometrische beeldvorming van de cel rust komt, produceren tandem bellen zoals in stap 2.1; eerste record met een interframe tijd (IFT) van 0,1 s gedurende 1 minuut, dan stijgen de IFT op 1 s voor een andere min, en de verdere stijging tot 5 s na 2 min. </li><li> Met de PTI software om de verhouding R = F340 / F380 berekenen in het gebied van belang (ROI), dat evenredig is met de intracellulaire calciumconcentratie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wang, D., Bodovitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis%3A+the+new+frontier+in+%27omics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis: the new frontier in 'omics.</a> Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).</li>
<li>Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+high-throughput+single-cell+microtechnologies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Advances in high-throughput single-cell microtechnologies.</a> Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).</li>
<li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+stretching+of+single+cells+for+large+population+mechanical+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).</li>
<li>Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measurement of single-cell dynamics.</a> Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).</li>
<li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+single+cell+analysis%3A+from+promise+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li>
<li>Kennedy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+in+the+treatment+of+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).</li>
<li>Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stress+waves+and+cavitation+in+stone+comminution+in+shock+wave+lithotripsy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy.</a> Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).</li>
<li>Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+single+cell+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled single cell sonoporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).</li>
<li>Itah, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+cavitation+kills+prostate+cells+and+ablates+benign+prostatic+hyperplasia+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue.</a> Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).</li>
<li>Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bubbly+cavitating+flow+generation+and+investigation+of+its+erosional+nature+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).</li>
<li>Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+membrane+poration+by+bubble-induced+microjets+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).</li>
<li>Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yield+Strength+of+Human+Erythrocyte+Membranes+to+Impulsive+Stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching.</a> Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).</li>
<li>Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+induced+stretching+of+red+blood+cells+by+oscillating+bubbles+within+a+narrow+gap%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Am+Phys+Soc%22%5BJournal%5D)">Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap.</a> Bull Am Phys Soc. 58, (2013).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101(2010).</li>
<li>Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+microbubble+poration+of+localized+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Laser-induced microbubble poration of localized single cells.</a> Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li>
<li>Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+tandem+bubble+interaction+in+a+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acoust+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel.</a> J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).</li>
<li>Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf">http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf</a> (2000).</li>
<li>Yang, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Analysis+of+Tandem+Bubble+Interaction+and+Jet+Formation+in+a+Microfluidic+Channel%22">Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel</a>. , Duke University. (2013).</li>
<li>Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+strains+and+strain+rates+in+motile+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes.</a> Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).</li>
<li>Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+measurements+in+cultured+vascular+smooth+muscle+cells+subjected+to+mechanical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation.</a> Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).</li>
<li>Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+deformation+and+bioeffects+produced+by+tandem+bubble-induced+jetting+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).</li>
<li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).</li>
<li>Tay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+NF-kappa+B+dynamics+reveal+digital+activation+and+analogue+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing.</a> Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).</li>
<li>Rand, R. P., Burton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Properties+of+the+Red+Cell+Membrane%3A+I.+Membrane+Stiffness+and+Intracellular+Pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure.</a> Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).</li>
<li>Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+deformation+of+living+cells+using+laser+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Mater%22%5BJournal%5D)">Large deformation of living cells using laser traps.</a> Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).</li>
<li>Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+the+human+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of the human red blood cell.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).</li>
<li>Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonoporation+by+single-shot+pulsed+ultrasound+with+microbubbles+adjacent+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells.</a> Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).</li>
<li>van Wamel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrating+microbubbles+poking+individual+cells%3A+Drug+transfer+into+cells+via+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation.</a> J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).</li>
<li>Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perforation+and+recovery+dynamics+in+microbubble-mediated+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation.</a> Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).</li>
<li>Dijkink, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cavitation-cell+interaction%3A+trans-membrane+transport+and+viability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies.</a> Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).</li>
<li>Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+laser+microbeam-induced+cell+lysis%3A+Time-resolved+imaging+and+analysis+of+hydrodynamic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects.</a> Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Eencellige analyse, in combinatie met live-cell imaging, is sterk verbeterd ons begrip van de dynamische en vaak variabele processen in afzonderlijke vakken, zoals fenotype ontwikkeling en immuunrespons 23. In tegenstelling tot de conventionele celkweek in schotels of flacons, microfluïdische systemen maken nauwkeurige regeling van de micro-omgeving naar de enkelvoudige-celniveau, in real time. Bijgevolg, de vooruitgang in microfluïdische technologie en technieken zijn grotendeels de doorvoer en reproduceerba...

Er is een groeiend besef dat de cellulaire heterogeniteit, die voortvloeien uit de stochastische expressie van genen, eiwitten en metabolieten, bestaat binnen een grote cel populatie en dient als een fundamenteel principe in de biologie mogelijk te maken voor mobiele aanpassing en evolutie 1. Daarom is het vaak onnauwkeurig en onbetrouwbaar populatie gebaseerde bulk metingen gebruiken om de functie van individuele cellen en hun interacties te begrijpen. Ontwikkeling van nieuwe technologieën eencellige analyse is daarom van groot belang in biologisch en farmacologisch onderzoek en kan worden gebruikt, bijvoorbeeld om beter de sleutel signaalwegen en processen stamcel biologie en kankertherapie 2-4. De laatste jaren heeft de opkomst van microfluïdische platforms aanzienlijk vergemakkelijkt single-cell analyse, waarbij de positionering, behandeling en observatie van de reactie van individuele cellen uitgevoerd met nieuwe analysestrategieën 5. Cavitatie speelt een belangrijke rol in een brede waaier van biomedische toepassingen, met inbegrip van de behandeling van kankers door high-intensity focused ultrasound (HIFU) 6, de non-invasieve versnippering van nierstenen door schokgolf lithotripsy (SWL) 7, geneesmiddel of gentherapie door sonoporatie 8, en de onlangs gerapporteerde vernietiging van cellen of weefsels door hydrodynamische cavitatie zeepbel 9,10. Desondanks hebben de dynamische processen van cavitatiebel (s) interactie met biologisch weefsel en cellen niet goed begrepen. Dit komt door de willekeur cavitatie initiatie en beldynamica door ultrageluid, schokgolven en plaatselijke hydraulische druk; bovendien is er een gebrek aan technieken waarmee de inherent complexe en snelle reacties van biologische cellen te lossen, vooral bij de enkele-celniveau. Vanwege deze problemen, is het niet verwonderlijk dat heel weinig studies hebben been gemeld aan bubble-cel interacties onder goed gecontroleerde experimentele omstandigheden te onderzoeken. Bijvoorbeeld membraan perforeren van afzonderlijke cellen in suspensie gevangen 11 en de impulsieve grote deformatie van rode bloedcellen humane 12 aangetoond met behulp van laser opgewekte interne bellen in microkanalen. Deze laatste techniek is echter, kan slechts zeer geringe vervorming in eukaryotische cellen door de aanwezigheid van de kern 13. Bovendien is het moeilijk om downstream bioeffects controleren bij de behandeling van cellen in suspensie. In andere studies is ultrasone excitatie van een celgebonden microbelletjes (of ultrageluid contrastmiddel) voor het membraan poratie en / of intracellulair calcium reacties in één hechtende cellen gerapporteerd 8. Membraan perforeren van één hechtende cellen kunnen ook worden geproduceerd door laser gegenereerde tandem bellen in een dunne vloeistoflaag die lichtabsorberende trypan blauwe oplossing 14 ofdoor een oscillerende gasbel gegenereerd door microseconde laserpulsen bestralen door middel van een optisch absorberende substraat in &#39;counter 15. In vergelijking, de optisch absorberende substraat heeft een voordeel ten opzichte van de laser-absorberende trypan blauwe oplossing omdat deze is giftig voor cellen. Wat nog belangrijker is, laser-gegenereerde bubbels zijn beter controleerbaar in termen van de zeepbel van de grootte en locatie dan akoestisch opgewonden bubbels. Niettemin, in al deze eerdere studies, de cel vorm, oriëntatie en adhesie omstandigheden werden niet gecontroleerd, die in hoofdzaak de cel respons en bioeffects geproduceerd door mechanische spanningen 16 kan beïnvloeden. Deze nadelen in eerdere studies overwinnen, hebben we onlangs ontwikkelde een experimenteel systeem voor vorming van belletjes, cel patronen, bel-bel-cel interacties en real-time bioassays van celrespons in een microfluïdische chip geconstrueerd door een unieke combinatie van microfabricage techniques. Drie belangrijke kenmerken die ons experimenteel systeem te onderscheiden van anderen in het gebied zijn: 1) de patroonvorming van microscopisch kleine gouden stippen op het glassubstraat gelokaliseerde laser absorbeert, vorming van belletjes 17 mogelijk te maken; 2) de patroonvorming van microscopisch kleine eilanden extracellulaire matrix (ECM) voor celhechting op hetzelfde substraat aan zowel de locatie en de vorm van individuele cellen te controleren; en 3) het samenpersen van de afmeting van de bel-bel-celinteractie domein van 3D naar een quasi-2D speelt in het vlak visualisatie van bubble-bubble interacties te vergemakkelijken, spuiten stroomvelden, celvervorming en bioeffects, alle meegenomen in een gestroomlijnde beeldvorming sequentie (figuur 1d). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55106/55106fig1.jpg" /> Figuur 1: De microfluïdische chip en schema&#39;s van verschillende assays. a) een samengestelde microfluïdische chip met kanalen gevuld met blauwe inkt<html> voor visualisatie. b) Een regio binnen de microfluïdische chip met gevormde cellen en gouden stippen (de afstand tussen de twee gouden stippen in de nabijheid is 40 pm). Vele paren werkeenheden kunnen worden aangebracht in een kanaal. c) Close-up beeld van een enkele werkeenheid die bestaat uit een paar gouden stippen en een HeLa cel gehecht aan het cel-patronen regio. d) Schema van de bedieningsinrichting. Een enkele cel hecht aan en zich in het &quot;H&quot; -vormige eiland bedekt met fibronectine. Een paar cavitatiebubbels (tandem bubble) met tegenfase trilling worden geproduceerd door verlichten gepulste laserstralen op de gouden stippen (zie figuur 4a), wat leidt tot de vorming van een snelle en gelokaliseerde jet naar de beoogde cel buurt. De cel kan worden vervormd nomen voor macromoleculaire opname en / of gestimuleerd met calcium respons, afhankelijk van de afstandsmeting (Sd) van de cel om de tandem bubble.f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Dit platform kan verder gecombineerd worden met fluorescentie- assays en gefunctionaliseerde kralen bevestigd aan het celoppervlak voor cavitatie geïnduceerde bioeffects. Vooral dit platform schept voor betrouwbare en kwantificeerbare assays bij de enkele-celniveau. Tot nu toe hebben we de inrichting voor de analyse van tandem bubble-geïnduceerde celmembraan vervorming cel poratie en intracellulaire opname, levensvatbaarheid, apoptose en intracellulair calcium respons. In de onderstaande voorschriften beschrijven we het proces-chips en de procedure voor het analyseren van verschillende bioeffects bovengenoemde. Bovendien worden de bewerkingen van de chip ook beschreven.

<table><tbody><tr><td>Reagens/Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides</td><td>Corning</td><td>2947-75X38</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320110</td><td>ACS reagens, &ge;99.5%</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>W292907</td><td>&ge;99.7%, FCC, FG</td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>320501</td><td>ACS reagens, 95.0-98.0%</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>216763</td><td>30 wt.% in H2O</td></tr><tr><td>Primer P-20</td><td>Microchem</td><td>MCC Primer 80/20</td><td></td></tr><tr><td>NFR fotoresist</td><td>JSR</td><td>NFR016D2</td><td></td></tr><tr><td>Fotomasker</td><td>Photoplotstore</td><td>N/A</td><td>4x4 Direct write mask</td></tr><tr><td>MF-319 Developer</td><td>Shipley (Rohm and Haas)</td><td>Microposit MF-319</td><td></td></tr><tr><td>1165 Fotoresist Remover</td><td>Dow Chemical, Co.</td><td>DEM-10018073</td><td>1-methyl-2-pyrrolidinon gebaseerd</td></tr><tr><td>S1813 fotoresist</td><td>Shipley (Rohm and Haas)</td><td>S1813</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine film</td><td>HACH</td><td>251764</td><td></td></tr><tr><td>SU-2025 fotoresist</td><td>Microchem</td><td>SU-2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Microbore Tubing</td><td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>S-54-HL</td><td></td></tr><tr><td>Metalen pinnen</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1300-01</td><td>Cut Tube (straight), 0.025&rdquo; OD x 0.017&rdquo; ID x 0.50&rdquo; Long</td></tr><tr><td>HeLa cellen</td><td>Duke Cell Culture Facility</td><td>(307-CCL-2) HeLa, p.148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM kweekmedium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin bovine proteïne, plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P21493</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylaat Microsferen 1.00&nbsp;&mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>08226-15</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylaat Microsferen 2.00&nbsp;&mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18327-10</td><td></td></tr><tr><td>EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Peptite-2000</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5020-5MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A13199</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich, Co.</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>F-127</td><td>invitrogen</td><td>P6866</td><td>0.2 &micro;m gefilterd (10% oplossing in water)</td></tr><tr><td>Reduced serum media&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma asher</td><td>Emitech</td><td>K-1050X</td><td>O2 / Ar plasma ashing van fotoresist en andere organische materialen</td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>SUSS MicroTec&nbsp;</td><td>Karl Suss MA6/BA6</td><td></td></tr><tr><td>E-beam evaporator</td><td>CHA Industries</td><td>CHA Industries Solution E-Beam</td><td></td></tr><tr><td>RIE</td><td>Trion Technology&nbsp;</td><td>Trion Technology Phantom II</td><td>(oxide/ nitride/ polymeer) etsen</td></tr><tr><td>Stereoscoop</td><td>AmScope</td><td>American Scope SM-4TZ-FRL</td><td>Stereo Microscoop</td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Chemyx Inc</td><td>NanoJet</td><td></td></tr><tr><td>Celkweekincubator</td><td>NuAire</td><td>AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator</td><td></td></tr><tr><td>Biologische Veiligheidskasten</td><td>NuAire</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>VWR</td><td>1122s</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>IEC</td><td>Centra CL2</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser&nbsp; (laser 1)</td><td>New Wave Research</td><td>Tempest</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser&nbsp; (laser 2)</td><td>New Wave Research</td><td>Orion</td><td></td></tr><tr><td>Delay generator</td><td>Berkeley Nucleonics&nbsp;</td><td>BNC 565-8c</td><td></td></tr><tr><td>Flash lamp</td><td>Dyna-Lite</td><td>ML1000 fiber-coupled flashtube</td><td></td></tr><tr><td>hoge snelheid camera</td><td>DRS Hadland</td><td>&nbsp;Imacon 200</td><td></td></tr><tr><td>hoge snelheid&nbsp; camera</td><td>Shimadzu</td><td>HPV-X</td><td></td></tr><tr><td>hoge snelheid camera</td><td>Vision Research</td><td>Phantom V7.3</td><td></td></tr><tr><td>PIV software</td><td>LaVision</td><td>DaVis 7.2</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc 5</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision</td><td></td></tr><tr><td>PTI systeem</td><td>Horiba</td><td>S/N: 1705 RAM-X</td><td></td></tr><tr><td>EasyRatio software</td><td>Horiba</td><td>Easy Ratio Pro 2</td><td>versie 2.3.125.86</td></tr><tr><td>63&times; objectief</td><td>Zeiss</td><td>LD Plan Neofluar</td><td></td></tr></tbody></table>

een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van cavitatie bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende bioeffects bij de single-cell niveau

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In dit manuscript beschrijven we eerst de vervaardiging protocol van een microfluïdische chip met goud dots en fibronectine gecoate gebieden op hetzelfde glassubstraat, dat het genereren van tandem bellen en individuele cellen buurt patroon met goed gedefinieerde locaties en vormen nauwkeurig regelt. Vervolgens tonen de vorming van luchtbellen tandem door twee lasers verlichten van een paar gouden stippen met enkele microseconde vertraging. We visualiseren de bubble-bubble interactie en de vorming van jet door high-speed imaging en karakteriseren van de resulterende stroom veld met behulp van particle image velocimetry (PIV). Tenslotte geven we een aantal toepassingen van deze techniek voor enkele cel analyse, inclusief celmembraan poratie met macromolecuul opname gelokaliseerde deformatie membraan bepaald door de verplaatsingen van de bijgevoegde integrine-bindende kralen en intracellulair calcium reactie van ratiometrische beeldvorming. Onze resultaten tonen aan dat een snelle en gerichte jetting stroming progeproduceerd door de tandem bubble interactie, die een sterk gelokaliseerde schuifspanning kunnen opleggen aan het oppervlak van een cel gekweekt in de nabijheid. Bovendien kunnen er verschillende bioeffects worden geïnduceerd door het veranderen van de sterkte van de stroming jetting door instelling van de afstandsmeting van de cel tandem bubbels.

De microfluïdische platform in dit werk beschreven kan worden gebruikt voor bubble bubble-interacties te onderzoeken en een verscheidenheid aan cavitatie geïnduceerde bioeffects analyseren bij de enkele-celniveau. Hier presenteren we een aantal voorbeelden van verschillende experimentele studies en bioassays die kunnen worden uitgevoerd in ons experimenteel systeem te demonstreren. We zullen eerst illustreren de voorbijgaande interacties van tandem bubbels met de straalvorming, de visual...

Een microfluïdische chip werd vervaardigd om paren gouden stippen te produceren voor tandem bubbeltjesgeneratie en fibronectine-gecoate eilandjes voor nabijgelegen single-cel patterning. Het resulterende stromingsveld werd gekenmerkt door deeltjesbeeldsnelheidsmeting en werd gebruikt om verschillende bioeffecten te bestuderen, waaronder celmembraan poratie, membraanvervorming en intracellulaire calciumrespons.

Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is om door cavitatie geïnduceerde bio-effecten in microfluïdische opsluiting te onderzoeken, waarbij oppervlaktepatronering wordt gebruikt om de generatie van tandem-bellen en de locatie en vorm van de individuele doelcellen nauwkeurig te beheersen. Dit microfluïdische systeem maakt experimenten mogelijk met deze overgang van cavitatiebellen en cellen die relevant zijn voor therapeutische toepassingen en geluidsoperaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek komt voort uit de verbeterde precisie door oppervlaktepatronering.Het stelt ons in staat om de bio-effecten van individuele cellen te bestuderen en biedt een hoge stroombelasting dankzij betrouwbare bel-bel-interactie. Een visuele demonstratie van de procedures is essentieel, aangezien de stappen voor oppervlaktepatronering en celpreparatie in de chip complex zijn en diverse technieken en tips omvatten. Voer alle microfabricageprocedures uit in een cleanroom terwijl u een cleanroompak draagt.Ontwerp het oppervlak van elke gouden stip tussen de 25 en 30 vierkante micron, zodat deze groot genoeg is om laserenergie te absorberen voor de generatie van bellen, maar klein genoeg om te voorkomen dat individuele cellen eraan hechten. Reinig het glazen objectglas in een chemische zuigkast volgens het tekstprotocol en ga vervolgens naar de spincoating-zuigkast. Programmeer de spincoater om in twee seconden te versnellen naar 1000 RPM en deze snelheid vijf seconden vast te houden, om vervolgens in drie seconden te versnellen naar 3000 RPM en deze snelheid 30 seconden vast te houden.Bevestig vervolgens het glazen objectglas aan de spin-coater met behulp van het vacuüm. Bedek het objectglas daarna met P20 en start de spin-cyclus. Breng vervolgens NFR negatieve fotolak aan met behulp van dezelfde cyclus.Bak het objectglas nu op een warmteplaat bij 95 degrees celsius gedurende 60 seconden. Zodra het is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt de fotolithografie uitgevoerd. Plaats het chroommasker in de maskeruitlijner en zorg ervoor dat de zijde met het patroon naar beneden, richting het objectglas, is gericht.Stel vervolgens het fotolithografierecept in op de harde belichtingsmodus met negen seconden UV-belichting en lijn het glazen substraat uit met het masker. Bak de slide na de UV-belichting één minuut lang op 95 °C en laat deze daarna, zoals voorheen, afkoelen. Om het patroon op de slide te ontwikkelen, plaatst u deze gedurende 60 seconden in de ontwikkelaar, waarna u de slide wast met gedestilleerd water en droogt met stikstofgas.Nadat het patroon via microscopische inspectie is bevestigd, wordt het objectglas vijf minuten gebakken bij 120 degrees celsius en afgekoeld tot kamertemperatuur. Reinig vervolgens het objectglas met plasma in de reactieve ion-etser gedurende 90 seconden bij 500 tor en 100 watts. Bevestig het monster met tape aan de platenhouder van een E-beam evaporator.Programmeer de machine om een laag titanium van 5 nanometer te deposeren, gevolgd door een laag goud van 15 nanometer. Zodra die positie is voltooid, dient de machine te worden geventileerd. Week het objectglas vervolgens een nacht in een bekerglas met een oplosmiddel voor het verwijderen van fotoresist om het goud dat bovenop de NFR-resist ligt te verwijderen.Was de volgende dag de slide met aceton, gevolgd door IPA en droog deze vervolgens met stikstof. Spoel de slide met DI-water en droog deze opnieuw met stikstof. Verhit de slide nu vijf minuten bij 115 °C.Reinig vervolgens de slide met het gouden stippenpatroon met een zuurstofplasma-asher bij 100 watts gedurende 90 seconden. Stel het oppervlak van elk met fibronectine gecodeerd eilandje in op 700 tot 900 vierkante micron om een adequate spreiding van HeLa-cellen in een vierkant gebied te faciliteren, terwijl de kans dat meerdere cellen op het eilandje aggregeren wordt geminimaliseerd. De fabricage is vergelijkbaar met die van het gouden patroon.Breng de code op de slide aan door deze zoals voorheen te spinnen met S18 positieve fotoresist en bak de codering vervolgens bij 115 degrees celsius. Voer daarna fotolithografie uit, waarbij de markeringen op het masker worden uitgelijnd met die op het substraat. Controleer het patroon op het centrale gedeelte om de juiste hoek te bevestigen en pas de afstand tussen de gouden stippen en het H-patroon aan.Voer de UV-belichting uit gedurende negen seconden zonder nabakken. Het volgende verschil is dat de ontwikkelingsstap slechts 45 seconden duurt. Stel voor het reactieve ionenetsen de parameters in op 500 tor, 100 watt en 90 seconden.Breng vervolgens een druppel PLLG peg-passiveringsoplossing aan op een stuk paraffinefolie en klem de oplossing tegen de zijde van de slide met het patroon. Voorkom dat er luchtbellen ontstaan. Verwijder de slide na 45 minuten van de folie.Spoel het objectglas af met gedemineraliseerd water en droog het vervolgens met stikstof. Week het objectglas daarna opeenvolgend in photoresist remover 1165 en vervolgens in een oplossing van 50 procent 1165 in gedemineraliseerd water.Vervolgens alleen gedeïoniseerd water. Roer de oplossing tijdens elk bad gedurende 90 seconden in een ultrasoon bad. Droog het objectglas nu op een warmteplaat, verzegel het vervolgens in een exsiccator en bewaar het bij 4 graden celsius.Assembleer de slides tot een microkanaalchip zoals beschreven in het tekstprotocol. Let er nauwkeurig op het patroongebied van het glaas-substraat af te schermen met de kleine PDMS-plaat voordat reactieve ionenetzing wordt gebruikt om de PLLG-peg uit het perifere gebied te verwijderen. Haal het gepatroneerde glas uit de RIE-machine en verwijder de kleine PDMS-plaat.Nadat het microkanaal-PDMS is behandeld met een verlaagde dosis zuurstofplasma, wordt het onder een stereoscoop uitgelijnd met het gepatroneerde glassubstraat. Breng het microkanaal-PDMS en het gepatroneerde glassubstraat in conform contact. De chip kan nu worden gebruikt.Prime eerst de chip door gedurende 30 minuten PBS door het microkanaal te laten stromen met een stroomsnelheid van 1 µL per minuut. Infuseer vervolgens de chip gedurende 45 minuten met een fibronectine-oplossing bij dezelfde stroomsnelheid. Bereid tijdens het wachten de cellen voor in een concentratie van 5 miljoen cellen per milliliter.Een gezonde status en een hoge confluentie zijn cruciaal voor deze procedure. Vervang vervolgens de oplossing die door de chip stroomt door PBS en verhoog de stroomsnelheid naar 10 µL per minuut. Laat de PBS vijf minuten doorstromen.Inject vervolgens de voorbereide cellen met een spuit in de chip. Wanneer er één druppel uit de slang is gestroomd, stopt u de injectie en klemmen we de uitlaat af. Plaats de chip daarna gedurende 30 minuten in een incubator.Laat daarna de uitlaat los en spoel de chip vijf minuten lang door met celkweekmedium met een snelheid van 10 µL per minuut. Verlaag na vijf minuten de flow naar 0,75 µL per minuut en plaats de chip en de pomp gedurende twee uur in een incubator. Ga na twee uur verder met de generatie van tandem-bellen terwijl u de chip bekijkt onder een omgekeerde microscoop met twee gepulste NDI-lasers op timingregelaars gericht op het gouden stippatroon, en met een hogesnelheidscamera klaar om de resultaten vast te leggen.Stel voor bellen van 50 micron de vertraging tussen de twee lasers in op 2,5 microseconden en stel hun vermogen in op tien microjoules. Synchroniseer vervolgens de opname van de hogesnelheidscamera met de lasers en maak opnames met twee miljoen frames per seconde en belichtingstijden van 200 nanoseconden. Op deze manier worden de dynamiek van de bellenexpansie, de collaps, de bellen-belleninteractie en de jetvorming vastgelegd.Interacties tussen bellen en diverse door cavitatie geïnduceerde bioeffecten werden op single-celniveau bestudeerd met behulp van de beschreven techniek, zoals de transiënte interacties van tandem bellen met jetvorming, de visualisatie van het resulterende stromingsveld en de berekening van de jetsnelheid. De directionele jetstroom rond de tandem bel is ongeveer tien meter per seconde, is ongeveer tien micron breed en is daarmee in staat om een impulsieve en gelokaliseerde schuifspanning en spanningsgradiënt op nabijgelegen doelcellen uit te oefenen. Ook de door tandem bellen geïnduceerde celmembraandeformatie werd bestudeerd.Membraandeformatie en -herstel worden gehighlight door de verplaatsing van gefunctionaliseerde kraaltjes die aan de voorzijde van het celmembraan zijn bevestigd. De lokale oppervlaktestrekking werd berekend op basis van de coördinaten van een triade aangrenzende kraaltjes. Dit schema toont de maximale oppervlakteverandering op verschillende locaties op het celoppervlak.De voorzijde wordt primair uitgerekt, terwijl de achterzijde of de laterale zijden van de cel worden gecomprimeerd, wat wijst op heterogeniteit en celdeformatie veroorzaakt door de jetting-stroom geïnduceerd door de tandem-bel. De temporele variatie van de oppervlaktestrekking aan de voorzijde van de cel bestaat uit een paar snelle oscillaties, gevolgd door een grote en aanhoudende rek gedurende ongeveer 100 microseconden, en een daaropvolgend geleidelijk herstel op een tijdschaal van enkele milliseconden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een controleerbare bel-bel interactie kunt creëren om de bio-effecten van individuele cellen met een gecontroleerde vorm en locatie vanuit oppervlaktepatronering te bestuderen.Na deze procedure kunnen andere maatregelen, zoals het uitdunnen van het cytoskelet en conjugale beeldvorming, verder worden uitgevoerd om de reorganisatie van het celcytoskelet na de tandem-bubbelbehandeling te bestuderen. Na de ontwikkeling zal deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van subpretische echografie om captatie-geïnduceerde bio-effecten op enkelcelniveau te onderzoeken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een goede celconfluentie en conditie essentieel zijn voor het succes van de celpatroonvorming.Vergeet niet dat werken met chemicaliën in cleanrooms en lasers extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en een lasersbril, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

a-microfluidic-system-with-surface-patterning-for-investigating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de fabricage van microfluïdische apparaten die cel te vangen en cultuur kunnen inschakelen. In deze benadering patroon microstructuren, zoals groeven in microfluïdische kanalen worden gebruikt om lage shear stress regio's waarbinnen de cel kan dock te creëren.

Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

Microfluïdische apparaten kunnen worden gebruikt om complexe natuurlijke processen in real-time en op het juiste fysieke schalen te visualiseren. We hebben een eenvoudige microfluïdische apparaat dat de belangrijkste functies van de natuurlijke poreuze media nabootst voor het bestuderen van de groei en het transport van bacteriën in de ondergrond.

Venster op een Microworld: Eenvoudig Microfluïdische Systemen voor het bestuderen van microbiële transport in poreuze media

Source: Kurz, D. L., et al. Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates the use of a microfluidic device to study biofilm formation. A bacterial suspension is introduced into the microchannel, followed by incubation to allow biofilm development. Flow is then resumed, and pressure monitoring along with imaging is used to detect biofilm formation and pore blockage over time.

A Microfluidic Device for Real-Time Imaging and Pressure Tracking During Biofilm Formation

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

We demonstreren een-microfluidics gebaseerde test om de termijn voor de cellen om de doorvoer te meten door middel van een opeenvolging van micron-schaal vernauwingen.

Een Microfluïdische Techniek om Cell Vervormbaarheid Probe

We presenteren een protocol om subtractieve patterning van levende celmonolagen op een oppervlak uit te voeren. Dit wordt bereikt door lokale en selectieve lysis van adherende cellen met behulp van een microfluïdische sonde (MFP). Het cellysaat dat uit lokale gebieden wordt verkregen, kan worden gebruikt voor downstream-analyse, waardoor moleculaire profileringsstudies mogelijk worden.

Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

Het gepresenteerde experimentele protocol kan worden gebruikt om real-time metingen uit te voeren van cavitatieactiviteit in een celkweekapparaat met als doel onderzoek mogelijk te maken naar de voorwaarden die nodig zijn voor een succesvolle medicijnafgifte en/of andere bio-effecten.

Cavitatie verbeterde therapie bestuderen

Een snelle en betrouwbare techniek wordt voorgesteld om de vormoscillaties van een enkele, gevangen akoestische bel te regelen die is gebaseerd op coalescentietechniek tussen twee bellen. De steady-state, symmetrie-gecontroleerde bubbelvormoscillaties maken analyse mogelijk van de vloeistofstroom die wordt gegenereerd in de buurt van de belinterface.

Inductie van microstreaming door niet-bolvormige bubbeloscillaties in een akoestisch levitatiesysteem

Een protocol voor het kweken en manipuleren van embryonaal weefsel van muizen op een microfluïdische chip wordt verstrekt. Door pulsen van pathway modulators toe te passen, kan dit systeem worden gebruikt om signaaloscillaties extern te regelen voor het functionele onderzoek van muis somitogenese.

Een microfluïdische benadering voor het functioneel onderzoek van signaaloscillaties die somitogenese beheersen

We presenteren een technologie die capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch platform gebruikt om microgrote objecten die in een vloeistof zijn gesuspendeerd, zoals bacteriën en colloïden, te modelleren in voorgeschreven arrays op een polydimethylsiloxaansubstraat.

Patroonvorming van micro-organismen en microdeeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage

Het huidige protocol beschrijft een microfluïdisch platform om de ontwikkeling van biofilms in quasi-2D poreuze media te bestuderen door microscopiebeeldvorming met hoge resolutie te combineren met gelijktijdige drukverschilmetingen. Het platform kwantificeert de invloed van poriegrootte en vloeistofstroomsnelheden in poreuze media op bioclogging.

Een microfluïdisch platform om bioclogging in poreuze media te bestuderen

Leer hoe cavitatie-induceerde bio-effecten op enkelvoudige cellen worden onderzocht met een microfluïdische chip en oppervlaktepatronen. Deze methode maakt precieze controle over belgeneratie en celplaatsing mogelijk voor therapeutische toepassingen.

Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau (Video) | JoVE Journal

Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau

Meer video's verkennen