Name: Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Ontdek een computationeel kader om genen te identificeren die betrokken zijn bij dieetbeperking in C. elegans. Deze methode kwantificeert omgevingsinformatie gecodeerd door genexpressieniveaus en onthult de strategieën die neuronale circuits gebruiken om levensduur te moduleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de Bargmann en Horvitz labs voor reagentia. Sommige stammen werden verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Wij danken ook M. Lipovsek voor opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de Wellcome Trust (Project Grant 087146 aan Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 en BB/M00757X/1 tot Q.C.), European Research Council (NeuroAge 242666 naar Q.C.), ons National Institutes of Health (R01AG035317 en R01GM088333 naar H.L.), en de VS National Science Foundation (0954578 naar H.L., 0946809 GRFP tot M.Z.).

<ol><li>Gendron, C. M., Chung, B. Y., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+system%3A+More+than+just+a+window+to+the+external+world%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">The sensory system: More than just a window to the external world.</a> Commun Integr Biol. 8 (2), 1017159(2015).</li>
<li>Calhoun, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Mechanisms+for+Evaluating+Environmental+Variability+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural Mechanisms for Evaluating Environmental Variability in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 86 (2), 428-441 (2015).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328 (5976), 321-326 (2010).</li>
<li>Cho, Y., Zhao, C. L., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+high-throughput+and+functional+neuroimaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Trends in high-throughput and functional neuroimaging in Caenorhabditis elegans.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 01376(2017).</li>
<li>Ching, T. -T., Hsu, A. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+plate-based+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2701(2011).</li>
<li>Greer, E. L., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+dietary+restriction+regimens+extend+lifespan+by+both+independent+and+overlapping+genetic+pathways+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans.</a> Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).</li>
<li>Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+dietary+restriction+for+genetic+epistasis+analysis+and+gene+discovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans.</a> PLoS ONE. 4 (2), 4535(2009).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans.+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans. life span on solid media.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Ching, T. -T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((-Ldrr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">-Ldrr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9 (4), 545-557 (2010).</li>
<li>Kaeberlein, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans.+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans. by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).</li>
<li>Lee, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+deprivation+extends+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dietary deprivation extends lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5 (6), 515-524 (2006).</li>
<li>Entchev, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-expression-based+neural+code+for+food+abundance+that+modulates+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">A gene-expression-based neural code for food abundance that modulates lifespan.</a> elife. 4, 06259(2015).</li>
<li>Diana, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+encoding+strategy+in+a+food-sensing+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Genetic control of encoding strategy in a food-sensing neural circuit.</a> elife. 6, (2017).</li>
<li>Shannon, C. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.1538-7305.1948.tb01338.x/abstract">A Mathematical Theory of Communication.</a> Bell System Technical Journal. 27 (3), 379-423 (1948).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook+%3A+the+online+review+of+C+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook : the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans.%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans.: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li>
<li>Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mech Ageing Dev. 131 (5), 364-365 (2010).</li>
<li>Anderson, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans.lifespan+extension+by+osmotic+stress+requires+FUdR%2C+base+excision+repair%2C+FOXO%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">C. elegans.lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins.</a> Mech Ageing Dev. 154, 30-42 (2016).</li>
<li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging. 5 (10), Albany NY. 759-769 (2013).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans).</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mech Ageing Dev. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Cheng, K. C. -C., Klancer, R., Singson, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MBK-2%2FDYRK+by+CDK-1+and+the+pseudophosphatases+EGG-4+and+EGG-5+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of MBK-2/DYRK by CDK-1 and the pseudophosphatases EGG-4 and EGG-5 during the oocyte-to-embryo transition.</a> Cell. 139 (3), 560-572 (2009).</li>
<li>Parry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-4+and+EGG-5+Link+Events+of+the+Oocyte-to-Embryo+Transition+with+Meiotic+Progression+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-4 and EGG-5 Link Events of the Oocyte-to-Embryo Transition with Meiotic Progression in C. elegans.</a> Curr Biol. 19 (20), 1752-1757 (2009).</li>
<li>Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nat Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li>
<li>Crane, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+screening+of+C.+elegans.identifies+genes+implicated+in+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Autonomous screening of C. elegans.identifies genes implicated in synaptogenesis.</a> Nat Methods. 9 (10), 977-980 (2012).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Zhan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Processing+of+Imaging+Data+through+Multi-tiered+Classification+of+Biological+Structures+Illustrated+Using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated Processing of Imaging Data through Multi-tiered Classification of Biological Structures Illustrated Using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Comput Biol. 11 (4), 1004194(2015).</li>
<li>Duong, T. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/5143010_ks_Kernel_Density_Estimation_and_Kernel_Discriminant_Analysis_for_Multivariate_Data_in_R">Kernel density estimation and kernel discriminant analysis for multivariate data in R.</a> Journal of Statistical Software. 21 (7), URL http://www.jstatsoft.org/v21/i07 21(2007).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org (2008).</li>
<li>Cover, T. M., Thomas, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCover%2C+TM+%22Elements+of+information+theory%22">Elements of information theory</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Tkacik, G., Walczak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+transmission+in+genetic+regulatory+networks%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">Information transmission in genetic regulatory networks: a review.</a> J Phys Condens Matter. 23 (15), 153102(2011).</li>
<li>Arimoto, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1054753/">An Algorithm for Computing the Capacity of Arbitrary Discrete Memoryless Channels.</a> IEEE Transactions on Information Theory. 18 (1), 14-20 (1972).</li>
<li>Cheong, R., Rhee, A., Wang, C. J., Nemenman, I., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+transduction+capacity+of+noisy+biochemical+signaling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Information transduction capacity of noisy biochemical signaling networks.</a> Science. 334 (6054), 354-358 (2011).</li>
<li>Schneidman, E., Bialek, W., Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+redundancy%2C+and+independence+in+population+codes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synergy, redundancy, and independence in population codes.</a> J Neurosci. 23 (37), 11539-11553 (2003).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (22), 13091-13096 (1998).</li>
<li>Golegaonkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rifampicin+reduces+advanced+glycation+end+products+and+activates+DAF-16+to+increase+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Rifampicin reduces advanced glycation end products and activates DAF-16 to increase lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 14 (3), 463-473 (2015).</li>
<li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).</li>
<li>Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+network+for+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een nieuwe methode voor dieet beperking die een veel breder scala van voedsel concentraties dan eerder gepubliceerde protocollen kapselt. Deze methode verbindt twee voorheen gescheiden verschijnselen gezien in C. elegans DR literatuur, bacteriële ontbering en klassieke dieet beperking, waardoor zowel dieet effecten worden bestudeerd onder één protocol. Met behulp van de nieuwe brede gasgroep DR paradigma, presenteren we een algemeen kader voor de behandeling van eencellige genexpressie in antwoord op een specifieke milieu cue en bepalen hoe deze cel informatie codeert. Ons kader bestaat uit twee experimentele protocollen die illustreren hoe u levensduur en kwantitatieve beeldvorming, respectievelijk uitvoert, onder brede-bereik DR. Data van deze experimentele protocollen kan vervolgens worden onderzocht met de computationele analyses waarin Dit kader te kwantificeren van de informatie die is gecodeerd door wijzigingen in het gen expressie niveaus of levensduur over verschillende voorwaarden.
Levensduur experimenten met behulp van breed-scala DR paradigma betrekken zes niveaus van de verschillende voedingsmiddelen (tabel 1). Dit vereist een meer arbeidsintensieve aanpak dan levensduur onder minder voedsel niveaus, zoals dieet ontbering10,11 te onderzoeken of het gebruik van de eten-2 genetische achtergrond35. Echter kunt onderzoeken op levensduur onder één voorwaarde beperken de interpretaties van de rol van een gen in DR. Bijvoorbeeld, bleek we onlangs dat daf-7 mutanten een bidirectionele demping van de reactie op voedsel concentratie ten opzichte van wild type dieren12 (figuur 1A). Bij gebrek aan voedsel weergeven daf-7 mutanten een verkorting van hun levensduur in vergelijking met wild type dieren. Als we alleen dieet ontbering overwogen hadden, wij zou hebben uitgelegd dat het gen van de daf-7 als noodzakelijk voor alleen levensduur verlenging, wanneer in feite de rol van de daf-7 complexer is. Daarom is de kritische uitkomst van dit deel van het protocol om te bepalen of een gen van belang is betrokken bij het moduleren van de algehele reactie van levensduur op veranderingen in overvloed van voedsel.
Een groot voordeel van dit protocol in vergelijking met andere methoden is dat het een nieuwe methode gebruikt voor het elimineren van de productie van nakomelingen in de dieren ondergaan levensduur analyse. De meeste studies gebruiken de drug FuDR voor de remming van de proliferatie van de germline bij volwassenen waardoor ze steriel. Recente studies hebben echter aangetoond FuDR behandeling voorwaarde - en gen-specifieke effecten op levensduur17,18,19,20,21, ter discussie kan hebben vraag de algemene toepasbaarheid ervan. In dit protocol, eliminatie van de productie van nakomelingen wordt bereikt door een 24-uurs behandeling van dieren met RNAi gericht op het gen van de ei-5 , dat de vorming van de chitine "eggshell" van remt bevrucht C. elegans eicellen resulterend in hun dood22,23. Het voordeel van deze methode is dat het zeer late-handelt en dus niet interfereert met de kiemcellen, dat een belangrijke regulator van de levensduur in C. elegans is.
Een mogelijke waarschuwing van het breed-scala DR protocol is de afhankelijkheid van het gebruik van de antibiotica om bacteriële proliferatie om te zorgen voor een strakke controle van bacteriële concentratie. Bacteriële proliferatie in de darm van de worm is bekend dat een belangrijke oorzaak van overlijden in C. elegans16. Dus, het gebruik van bacteriostatische antibiotica, zoals carbenicillin, in NGM agar voorkomt bacteriële proliferatie en verhoogt de levensduur van wormen in vergelijking met niet-antibioticum besturingselementen16. Bepaalde soorten antibiotica, zoals rifampicine36 en leden van de tetracycline familie37,38, is aangetoond dat het verlengen van de levensduur in C. elegans onafhankelijk van hun effect op de bacteriële proliferatie. Er is echter geen bewijs in de literatuur dat carbenicillin of streptomycine levensduur onafhankelijk van hun effect op de bacteriële proliferatie kan verhogen.
Levensduur kan worden gezien als de uitvoer van een complexe berekening waar milieu-informatie, gerouteerd door gen-expressie in neuronale netwerken, wordt doorgegeven aan de fysiologie. Ons protocol biedt een methode om te begrijpen hoe specifieke genen beïnvloeden deze stroom van milieu-informatie. Om aan deze vraag, moeten we betrouwbare beeldverwerking om te bepalen van de verdeling van gen expressie reacties op het niveau van één cel. Zijnde kundig voor schatten niet alleen de gemiddelde reactie van genexpressie aan veranderingen in overvloed van voedsel maar ook de volledige statistische verdeling van grote populaties vertegenwoordigt een belangrijke vereiste voor de toepasbaarheid van onze methode. Deze nauwkeurige beschrijving van gen expressie reacties op voedsel overvloed kan de toepassing van informatietheorie te kwantificeren van de informatie die is gecodeerd door de specifieke neuronen, alsmede de codering strategie in dienst van de neurale circuit.
De beeldvorming en Computationele aspecten van de methoden die worden beschreven in dit protocol gelden voor een groter aantal biologische contexten. In ons werk zijn we gericht op een kleine neurale netwerk deelnemen aan voedsel sensing, de analyses van informatieverwerking functies zijn echter niet beperkt tot een specifieke celtype of specifieke milieu signalen. Deze methodologieën kunnen in de toekomst mogelijk worden uitgebreid tot een grotere verscheidenheid van invoervariabelen, waardoor geen fysiologische uitvoer. Deze aanpak zal bijdragen tot een beter begrip van hoe regulerende netwerken van gen codeert, proces en doorgeven van gegevens.

Alle organismen moeten kunnen te voelen en te reageren op veranderingen in de omgeving om te overleven. Bij dieren, het zenuwstelsel is de primaire detector en transducer van informatie over de omgeving en coördineert de fysiologische reactie op wijzigingen die van invloed kan zijn voor het organisme van survival1. Overvloed van voedsel is een milieu cue momenteel goed onderzocht in verschillende contexten die niet alleen voedselgerelateerde gedrag, zoals foerageren2 regelt, maar ook van invloed op de levensduur van een dier. De modulatie van levensduur door veranderingen in overvloed van voedsel is een fenomeen dat bekend staat als dieet beperking (DR), en heeft brede evolutionaire instandhouding3.
De nematode Caenorhabditis elegans is een krachtig modelsysteem voor het aanpakken van fundamentele biologische vragen. Een overvloed aan technieken zijn ontwikkeld waarmee voor het manipuleren van het genoom van de worm, zoals RNAi en in vivo gene bewerken technieken. De kleine fysieke grootte van de worm en de optische transparantie lenen zich ook voor in vivo imaging van zowel transcriptionele en translationele fluorescerende verslaggevers en het nut van high-throughput technologieën zoals microfluidics4. Deze hulpprogramma's kunnen samen worden aangewend om te onderzoeken hoe neurale circuits directe dierlijk gedrag.
C. elegans is een Bacterivoor en verschillende methoden hebben gepubliceerd waarmee voor de nauwkeurige controle van de overvloed van voedsel door het manipuleren van bacteriële concentratie5,6,7,8 . Binnen de C. elegans onderzoeksgemeenschap, is DR onderzocht in twee verschillende contexten. De eerste kan worden betiteld als 'klassieke DR', zoals het weerspiegelt de veranderingen gezien in reactie op het verkleinen van voedsel niveaus in andere organismen. In dit verband, afnemende voedsel overvloed van ad libitum niveaus resulteert in een toenemende levensduur tot een optimale is bereikt, nadat dit punt levensduur met verdere vermindering van voedsel6,7afneemt, 9. Het tweede kader waaronder DR is onderzocht in C. elegans is dieet ontbering waarin de levensduur van de wormen wordt verhoogd met de volledige verwijdering van eventuele bacteriële voedsel bron10,11. In Entchev et al. (2015)12, we hebben laten zien dat de complexiteit van DR als gevolg van deze twee verschillende paradigma's kan worden onderzocht gelijktijdig in een context die we noemen 'breed-scala DR'. Met behulp van het protocol zoals hieronder beschreven, we geïdentificeerd een nieuwe klasse van genen die betrokken zijn bij DR dat bidirectionally het moduleren van de levensduur reactie op voedsel overvloed en zijn betrokken bij de neurale circuits die zin voedsel12 (Figuur 1).
De reactie van een dier op veranderingen in het milieu integreert een reeks biologische processen die de zintuigstelsel koppelen aan complexe regelgeving interacties overbrengen van milieu-informatie aan fysiologie. Hoewel de mechanistische details van dergelijke "informatiestroom" bekeken, vaak onbekend zijn, kunnen genetische's worden gebruikt voor het verwerven van inzicht in hoe deze complexe berekening wordt georganiseerd onder verschillende biologische componenten. In ons recente werk toonden we dat daf-7 en tph-1 zijn betrokken bij de overdracht van milieu-informatie over voedsel overvloed via een voedsel-sensing neurale circuit dat levensduur in C. elegans12 moduleert , 13. door het toepassen van het wiskundige kader van informatietheorie14, konden we kwantificeren van het bedrag van de milieu-informatie, in termen van bits, dat wordt vertegenwoordigd door het gen expressie veranderingen in daf-7 en tph-1 in specifieke neuronen in verschillende niveaus. Daaruit konden we dan om te ontdekken de codering strategie in dienst van deze neurale en hoe het genetisch wordt gecontroleerd (Figuur 2).
In het volgende protocol schetsen we de stappen die nodig zijn om te begrijpen wat de gevolgen van de genen van belang uitgedrukt in specifieke neuronen zijn en hoe zij deelnemen aan de stroom van voedselinformatie uit omgeving naar levensduur. In het algemeen, onze kader is verdeeld in twee experimentele protocollen en een computationele workflow. Voor de experimentele aspecten, is het van cruciaal belang dat mutanten van de genen van belang dat onder brede-bereik kan worden onderzocht DR. Faithful transcriptionele verslaggevers zijn ook nodig om het kwantificeren van het niveau van de uitdrukking van de genen op verschillende niveaus. Om te kunnen overgaan tot de computationele analyse besproken in onze methode, moet de dataset van voldoende grootte tot zinvolle schattingen van expressie distributies op te leveren. Hoewel wij sjabloon broncodes voor de analyses bieden, moet de gebruiker vertrouwd zijn met de taal van de informatietheorie die uitgebreid door onze computationele kader wordt gebruikt. De broncodes zijn geschreven in R en C++. Daarom is een zekere mate van programmering vaardigheid ook verplicht toe te passen op een zinvolle manier.

<table><tbody><tr><td>Carbenicillin di-Natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-5G</td><td>Antibioticum</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfaat zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501-50G</td><td>Antibioticum</td></tr><tr><td>&nbsp;Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td>Inductor voor RNAi-platen</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380-1KG-M</td><td>Gebruikt in S basaal en NGM-agar</td></tr><tr><td>di-Kaliumwaterstoffosfaat(K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05104.1000</td><td>Gebruikt in S basaal en NGM-agar</td></tr><tr><td>Kalium di-waterstoffosfaat (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791-1KG</td><td>Gebruikt in S basaal en NGM-agar</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-1KG</td><td>Gebruikt in NGM-agar</td></tr><tr><td>Calciumchloride (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td>Gebruikt in NGM-agar</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687-500G</td><td>Gebruikt voor bleekmiddel</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-1KG</td><td>Gebruikt in beeldvorming</td></tr><tr><td>Natriumhypochloriet (NaClO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05614.2500</td><td>Gebruikt voor bleekmiddel</td></tr><tr><td>LB-Bouillon</td><td>Invitrogen</td><td>12780052</td><td>Gebruikt om bacteriën te kweken</td></tr><tr><td>Adavanced TC 6 cm Tissue Culture plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628960</td><td>Platen voor levensduur</td></tr><tr><td>CellStar 10cm Tissue Culture plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>Platen voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Low Retention P200 tips</td><td>Brandt</td><td>732832</td><td>Tips voor het hanteren van wormen in vloeistof</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214510</td><td>Agar voor NGM, RNAi en NSC-platen</td></tr><tr><td>Bacto-pepton</td><td>BD</td><td>211820</td><td>Pepton voor NGM, RNAi en NSC-platen</td></tr></tbody></table>

kwantificering van informatie gecodeerd door gene expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in c. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Zintuiglijke systemen kunnen dieren te detecteren, te verwerken en te reageren op hun omgeving. Overvloed van voedsel is een milieu cue die diepgaande gevolgen voor de dierlijke fysiologie en gedrag heeft. Onlangs, toonden we dat modulatie van de levensduur in de nematode Caenorhabditis elegans door overvloed van voedsel complexer is dan eerder herkend. Het reactievermogen van de levensduur tot veranderingen in voedsel niveau wordt bepaald door de specifieke genen die gedragen beheersen van informatieverwerking binnen een neurale circuit. Ons kader combineert genetische analyse, high-throughput kwantitatieve beeldvorming en informatietheorie. Hier beschrijven we hoe deze technieken kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van elk gen dat fysiologische relevant is voor breed scala dieet beperking. In het bijzonder deze workflow is ontworpen om te onthullen hoe een gen van belang regelt levensduur onder breed-scala dieet beperking; dan vast te stellen hoe de expressie van het gen varieert met voeding niveau; en tot slot, om te zorgen voor een onpartijdige kwantificering van de hoeveelheid informatie overgebracht door genexpressie over voedsel overvloed in de omgeving. Wanneer meerdere genen gelijktijdig in het kader van een neurale circuit onderzocht worden, kan deze werkstroom de codering strategie in dienst van het circuit ontdekken.

Door het uitvoeren van levensduur experimenten op de mutanten van de genen van belang naast het wild type N2 stam, kan een vast of deze genen een rol in het voedsel antwoord naar breed scala DR hebben. De wild type reactie moet vergelijkbaar zijn met degene die zijn afgebeeld in Figuur 1A. Elke modulatie van deze reactie door de mutanten, doorgevoerd door een niet-uniforme effect op voedsel voorwaarden, aangeeft dat deze genen beïnvloeden het vermogen van de worm correct reageren op veranderingen in overvloed van voedsel, op welk punt nader onderzoek van de reacties van de expressie van deze genen op breed scala DR gerechtvaardigd is. Als de reactie van de levensduur van de mutanten echter niet significant verschillend van het wild-type is dan hebben de genen geen rol in het transducing van de effecten van breed-scala DR, ten minste op het niveau van de gemiddelde levensduur. Als de mutaties een uniforme verschuiving van de hele levensduur reactie veroorzaken dan hebben de genen een voedsel-onafhankelijke effect op levensduur. Dit sluit niet uit dat de uitdrukking van de genen van belang voedsel-responsieve is, in welk geval de informatie die door deze genen niet aan de levensduur doorgegeven wordt.
De volgende fase van het protocol is te bepalen hoe de expressie niveaus wijzigen onder breed-scala DR voor de genen van belang. In Figuur 1Billustreren we dit door de niveaus van de expressie van een transcriptionele verslaggever van daf-7, waaruit een reactie op veranderingen in het niveau van het voedsel in de sensorische neuronen van ASI blijkt. In een daf-7(-) mutant, is de reactie van de expressie van de transcriptionele verslaggever gewijzigd. Indien de genen van belang echt voedsel-reageren op het niveau van de levensduur zijn kan dan men verwachten dat hun expressie ook met voedsel verandert. Dienovereenkomstig moet een transcriptionele verslaggever in de mutant achtergrond een gewijzigde expressie profiel in reactie op breed scala DR. Het is echter ook mogelijk dat de transcriptionele verslaggever van het gen van belang in een wild type achtergrond niet alle voedsel-responsieve wijzigingen in expressie toont. In deze situatie, kan dit duiden op een post-transcriptional regelgevende effect dat buiten het bestek van dit protocol valt.
In Diana et al. (2017)13, we hebben opgehaald expressie waarden voor daf-7 in ASI en tph-1 in de ADF en NSM. In Figuur 2illustreren we de schatting van de verdeling van de expressie in ASI en ADF voor een niveau van bepaald voedsel. Met meerdere uitlezingen uit één worm afbeeldingen stelt ons in staat om te analyseren van niet alleen de hoeveelheid informatie onafhankelijk gecodeerd door elk neuron maar ook de combinatorische informatie van het hele neurale circuit (Figuur 2B-2 C). Het combineren van deze twee informatie-theoretische maatregelen stelt ons in staat om te karakteriseren van het systeem in termen van de codering strategie in dienst van de neuronen te brengen informatie over voedsel. Het bedrag van de redundantie in het circuit kan worden verkregen door de som van de wederzijdse informatie voor elk neuron en de gezamenlijke wederzijdse informatie (kanaalcapaciteit) verkregen door te overwegen de combinatorische uitlezingen van het circuit af te trekken. Een positieve waarde van zo'n verschil geeft een overbodige karakter van de codering strategie omdat de cumulatieve gegevens tussen de delen groter dan de werkelijke gegevens gecodeerd door het hele circuit is. Omgekeerd geeft een negatieve waarde een synergetische strategie omdat de ware informatie gecodeerd groter dan de som van haar onderdelen (Figuur 2B is). Informatie en redundantie kunnen worden vergeleken tussen verschillende genotypen te verkennen mogelijk hogere orde rollen van genregulering, bijvoorbeeld in Diana et al. (2017) 13 het effect van daf-7 mutatie schakelt de codering strategie van redundante aan synergetische (Figuur 2C-2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig1.jpg"> 
Figuur 1 : Reactie van de levensduur en gen-expressie onder breed scala DR. (A) de gemiddelde levensduur van het wild type N2 stam (zwarte lijn) toont een complexe reactie naar breed scala DR. De omvang van deze reactie is verzwakt in een null mutant van het daf-7 gen (rode lijn). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde, gegroepeerde gegevens uit Entchev et al. (2015) 12. (B) het gemiddelde niveaus van de expressie van een transcriptionele verslaggever voor het daf-7 -gen in wild type achtergrond (zwarte lijn) ook een complexe niet-monotone reactie naar breed scala DR weergeven. In de genetische achtergrond van daf-7(-) de uitdrukking van deze transcriptionele verslaggever zeer is verzwakt en toont weinig reactie op veranderingen in voedsel niveau. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde, gegevens uit een enkel proces in Entchev et al. (2015) 12. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig2.jpg"> 
Figuur 2 : Computational methodologie. (A) afbeelding van tweedimensionale dichtheid schatting van tph-1 expressie in ADF en daf-7 expressie in ASI verkregen uit het pakket van de 'ks' R met behulp van een raster dimensie 30 x 30. (B) visualisatie van de informatie die is gecodeerd door de gezamenlijke uitdrukking van tph-1 en daf-7 (geheel) en individueel (som van delen) voor de ADF, ASI en NSM neuronen. Redundante en synergetische tekens van de codering worden vertegenwoordigd door het verschil tussen de hoogte van de gestapelde balken aan de rechterkant en de informatie die is gecodeerd door het volledige circuit. (C) vergelijking tussen voedselinformatie gecodeerd door wild type dieren en daf-7(-) mutanten. (D) de vermindering van de wederzijdse informatie waargenomen in de mutanten wordt begeleid door een schakelaar naar synergetische codering. Panelen B-D zijn aangepast van Diana et al. (2017) 13. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacteriële concentratie (cellen/ml)</td>
			<td>Optische dichtheid (600nm)</td>
			<td>Verdunningsfactor (uit vorige)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.12E + 10</td>
			<td>56.000</td>
			<td>0,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E + 09</td>
			<td>10.000</td>
			<td>5,60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E + 08</td>
			<td>3.160</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E + 07</td>
			<td>0.316</td>
			<td>10,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E + 07</td>
			<td>0.100</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 (S basale)</td>
			<td>0.000</td>
			<td>NB</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: voedsel niveaus en verdunningsfactoren gebruikt in breed scala DR. Bacteriënl (cellen/mL) gebruikte concentraties in het breed-scala DR protocol, samen met hun respectieve OD600 metingen en de verdunningsfactor vereist om elke concentratie uit het vorige voorbeeld.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="7">Experimentele temperatuur van levensduur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dag</td>
			<td>12.5° C</td>
			<td>15° C</td>
			<td>17.5° C</td>
			<td>20° C</td>
			<td>22,5 ° C</td>
			<td>25° C</td>
			<td>27.5° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td colspan="7">Alle stammen aan verse NGM platen stuk en onderhouden bij 20° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td colspan="7">P0 generatie van daf-7(-) stammen instellen en onderhouden bij 20° C (1 L4 per plaat, 5 platen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td colspan="7">P0 generatie van wild type stammen instellen en onderhouden bij 20° C (1 L4 per plaat, 5 platen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td colspan="7">Instellen van de F1-generatie van daf-7(-) stammen en onderhouden bij 20° C (1 L4 per plaat, 90 platen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td colspan="7">F1 generatie van wild type stammen instellen en onderhouden bij 20° C (1 L4 per plaat, 30 platen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="7">F2 L4 larven te halen &#62; ei-5 RNAi platen en onderhouden bij 20° C (15 L4 per plaat, 24 platen)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="7">1 - dag oud volwassenen naar NSC platen bezaaid met 9 cellen/ml voeding niveau + 2.0e en handhaven bij 20 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="7">2 - dagen oude volwassenen NSC platen bezaaid met experimentele voedsel voorwaarden en tot experimentele temperatuur verplaatsen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>Overdracht</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: schema voor levensduur uitgevoerd bij verschillende temperaturen. Schematisch overzicht van de stappen die nodig zijn om breed-bereik instellen DR levensduur experimenten bij verschillende temperaturen, daf-7(-) en wild type stammen als voorbeelden gebruikt. Het aantal overdrachten aan verse platen van elk niveau van de experimentele voedsel afneemt met toenemende temperatuur. Dit is op het feit dat dieren bij hogere temperaturen sneller zijn veroudering en zo een meer vatbaar voor fysieke schade per overdracht.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dagen</td>
			<td>IMA</td></tr></tbody></table>ging pijpleiding
		
		<tr>
			<td>-14</td>
			<td>Brok verslaggever stammen in daf(-) achtergrond. Handhaven bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-13</td>
			<td>Brok verslaggever stammen in wild type achtergrond. Handhaven bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td>P0 generatie van daf-7(-) verslaggever stammen instellen. Gebruik 3 L4 larven per 10cm NGM plaat. 2 platen gebruiken en onderhouden bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td>P0 generatie van wild type verslaggever stammen instellen. Gebruik 3 L4 larven per 10cm NGM plaat. 2 platen gebruiken en onderhouden bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td>F1 generatie van daf-7(-) verslaggever stammen instellen. Gebruik 3 L4 larven per 10cm NGM plaat. 12 platen gebruiken en onderhouden bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td>F1 generatie van wild type verslaggever stammen instellen. Gebruik 3 L4 larven per 10cm NGM plaat. 4 platen gebruiken en onderhouden bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td>Bleekmiddel daf-7(-) verslaggever stammen in middag (~ 5 pm) en eieren op 3 10cm NGM platen storten en onderhouden bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td>Bleekmiddel wild type verslaggever stammen in de ochtend (~ 10 am) en storting eieren op 3 10 cm NGM platen en onderhouden bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>Wassen L4 aan 10 cm ei-5 RNAi platen. Gebruik 3 platen per stam en onderhouden bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Wassen van de 1-daagse volwassenen aan NSC platen bezaaid met 2.0e + 9 cellen / ml. gebruik 3 platen per stam en onderhouden bij 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Wassen 2 dagen volwassenen aan NSC platen bezaaid met experimentele voedsel niveaus. 3 platen per stam en verschuiving kunt experimentele temperatuur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Transfer naar verse NSC platen. Gebruik 3 platen per stam en onderhouden bij experimentele temperatuur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Transfer naar verse NSC platen. Gebruik 3 platen per stam en onderhouden bij experimentele temperatuur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Plukken van dieren uit platen en voorbereiden van beeldvorming.</td>
		</tr>
	

Tabel 3: schema voor imaging-pijpleiding. Schematisch overzicht van de stappen die nodig zijn om breed-scala DR imaging experimenten met behulp van fluorescerende transcriptionele verslaggever stammen in daf-7(-) en wild type achtergronden bij verschillende temperaturen als voorbeelden.

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Het algemene doel van dit kader is om genen te identificeren die betrokken zijn bij breed scala aan voedingsbeperkingen, de omgevingsinformatie te kwantificeren die door hun expressieniveaus wordt gecodeerd en de onderliggende coderingsstrategie te begrijpen die omgeving koppelt aan levensduur. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van de neurobiologie van veroudering te beantwoorden, zoals welke genen informatie uit de omgeving overbrengen om de levensduur te moduleren. Hoewel dit kader inzicht kan geven in het sensorische systeem van C Elegan, kan het ook algemeen worden toegepast op elk biologisch systeem waarvan de componenten samenwerken om omgevingsinformatie te verwerken.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de omgevingsinformatie kwantificeert die wordt gecodeerd door groepen van neuronen en de coderingsstrategie bepaalt die door neuroselquites wordt gebruikt om deze informatie naar downstream-doelen over te brengen. Na het kweken van OP50 op MGM-platen volgens het tekstprotocol, bereid 500 milliliter LB-medium in elk van de twee liter erlenmeyer kolven voor en autoclaveer ze. Inoculeer elke kolf met een enkele kolonie van OP50 en kweek de culturen bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende ongeveer 14 uur.Voeg vervolgens aan de culturen 50 microgram per milliliter streptomycine toe. Schud de kolven vervolgens nog 30 minuten bij 37 graden Celsius en plaats de kolven vervolgens 15 minuten op ijs. Breng 450 milliliter van elke cultuur over in afzonderlijke 500 milliliter steriele centrifugeerbuisjes, bewaar de overgebleven cultuur op ijs, aangezien deze zal worden gebruikt om de concentratie van de bacteriën te bepalen.Centrifugeer de buisjes 25 minuten bij 4500 x G en vier graden Celsius, gooi daarna de supernatant weg en bewaar de buisjes op ijs. Verdun met 900 microliter steriele LB 100 microliter overgebleven cultuur uit elke kolf. Gebruik een milliliter steriele LB om de spectrofotometer op nul te zetten en bepaal vervolgens de OD600 van de 10-voudige verdunning van elke cultuur.Als bijvoorbeeld de OD600 van de 10-voudige verdunning van de overnachtelijke cultuur 0,28 is, dan had de cultuur een werkelijke OD600 van 2,8. Vanuit dit voorbeeld, om te komen tot een werkstockoplossing van 1,12 x 10 tot de 10de OP50 cellen per milliliter, wat gelijk is aan een OD600 van 56, suspendeer het pellet van de 450 milliliter cultuur in één 20ste van het oorspronkelijke volume of 22,5 milliliter steriele S basale oplossing of SB, aangevuld met 50 microgram per milliliter streptomycine. Maak alle volgende concentraties die in experimenten worden gebruikt in SB en strep, uit seriële verdunningen van de werkstock, met behulp van de verdunningsfactoren die in deze tabel staan vermeld.Na het kweken en synchroniseren van C Elegans reporterstammen volgens het tekstprotocol, gebruik 15 milliliter SB om de wormen stap voor stap van de drie platen te wassen en het vocht in een steriele 15 milliliter buis te verzamelen. Laat de L4-larven natuurlijk sedimenteren en aspirier vervolgens alle vloeistof behalve ongeveer 0,5 milliliter. In de wildtype reporterstammen verwijdert dit type alle larven jonger dan L4. In mutante achtergronden helpt deze stap bij het verwijderen van eventuele gearresteerde larven, zoals de onze, in het geval van sterfgevallen van een OK3125.Gebruik vervolgens negen milliliter SB om de wormen opnieuw te suspenderen. Bewaak opnieuw de sedimentatiesnelheid van de L4-larven en aspirier vervolgens alle vloeistof behalve ongeveer 0,5 milliliter van het supernatant zodra de meeste L4-larven zijn gepelleteerd voordat u het proces herhaalt. Voeg 10 microliter steriele S basale medium, aangevuld met 0,1% pluronic F127, toe aan de vloeistof die de L4-larven bevat.Dit werkt als een oppervlakteactieve stof en voorkomt dat de larven aan de binnenkant van de plastic pipettenpunten plakken. Gebruik een P200 lagere retentie pipettenpunt om de larven voorzichtig te suspenderen en verdeel vervolgens 150 microliter op drie 10 centimeter RNAi platen die zijn gezaaid met 5 x 225 microliter egg vijf RNAi-bacteriën. Zorg ervoor dat de wormen gelijkmatig verdeeld zijn over alle vijf bacterie-matten.Zodra de vloeistof in de agar is geabsorbeerd, verwijdert u eventuele niet-L4-larven van de platen die niet door de wasprocedure zijn geëlimineerd, door ze handmatig af te plukken. Bewaar vervolgens de platen gedurende 24 uur bij 20 graden Celsius. Om een breed scala DR te initiëren, plukt u eventuele jonge larven die aan de vorige handmatige verwijderingsstap ontsnapt zijn, waardoor alleen de een dag oude volwassenen op de platen achterblijven.Gebruik voor elke stam 15 milliliter steriele SB strep om de een dag oude volwassenen van de drie platen te wassen in een 15 milliliter buis. Laat de wormen natuurlijk sedimenteren en aspirier vervolgens alle vloeistof behalve 0,5 milliliter van het supernatant. Suspendeer de wormen opnieuw met 9,5 milliliter SB strep en herhaal de sedimentatie- en wasstappen.Na de laatste wassing en aspiratie van alle vloeistof behalve 0,5 milliliter van het supernatant, voegt u 10 microliter SB Plu toe en gebruikt u een P200 pipettenpunt om de larven voorzichtig te suspenderen. Verdeel 100 microliter van de larven op een NSC-plaat, gezaaid met 5 x 225 microliter bacteriën, met een concentratie van 2 x 10 tot de negende cellen per milliliter. Verdeel de 100 microliter gelijkmatig over alle vijf bacterie-matten.Schat onder een microscoop het aantal dieren dat op de plaat aanwezig is, met als doel tussen de 100 en 150 wormen per plaat. Bepaal het volume vloeistof dat nodig is om een wormdichtheid binnen dit bereik te bereiken en verdeel het vervolgens over twee extra platen. Pas het aantal wormen op de eerste plaat aan om ook binnen dit bereik te vallen.En bewaar de platen gedurende 24 uur bij

quantification-information-encoded-gene-expression-levels-during

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Hier presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van solide plaat op basis van dieetbeperking...

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

In dit artikel tonen we live beeldvorming van individuele wormen met een aangepaste microfluidic apparaat. In het apparaat, zijn meerdere wormen individueel beperkt om te scheiden van de kamers, waardoor multiplexed longitudinale toezicht van verschillende biologische processen.

Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van RNA, DNA en eiwit uit hetzelfde monster, in een poging om de variatie te reduceren, reproduceerbaarheid te verbeteren en vergemakkelijken van interpretaties.

Gecombineerde Nucleotide en eiwit extracties in Caenorhabditis elegans

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Het huidige protocol beschrijft lipidensuppletiemethoden in vloeibare en on-plate culturen voor Caenorhabditis elegans, in combinatie met longitudinale studies en gentranscriptionele analyse van bulk of een paar wormen en wormweefsels.

Lipidensuppletie voor een lange levensduur en gentranscriptionele analyse bij Caenorhabditis elegans

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.

Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde Caenorhabditis elegans op vaste media in multiwell-apparaten

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Ontdek een computationeel kader om genen te identificeren die betrokken zijn bij dieetbeperking in C. elegans. Deze methode kwantificeert omgevingsinformatie gecodeerd door genexpressieniveaus en onthult de strategieën die neuronale circuits gebruiken om levensduur te moduleren.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans (Video) | JoVE Journal

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Meer video's verkennen