Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans
16 augustus 2017
Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.
Het algemene doel van dit kader is om genen te identificeren die betrokken zijn bij breed scala aan voedingsbeperkingen, de omgevingsinformatie te kwantificeren die door hun expressieniveaus wordt gecodeerd en de onderliggende coderingsstrategie te begrijpen die omgeving koppelt aan levensduur. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van de neurobiologie van veroudering te beantwoorden, zoals welke genen informatie uit de omgeving overbrengen om de levensduur te moduleren. Hoewel dit kader inzicht kan geven in het sensorische systeem van C Elegan, kan het ook algemeen worden toegepast op elk biologisch systeem waarvan de componenten samenwerken om omgevingsinformatie te verwerken.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de omgevingsinformatie kwantificeert die wordt gecodeerd door groepen van neuronen en de coderingsstrategie bepaalt die door neuroselquites wordt gebruikt om deze informatie naar downstream-doelen over te brengen. Na het kweken van OP50 op MGM-platen volgens het tekstprotocol, bereid 500 milliliter LB-medium in elk van de twee liter erlenmeyer kolven voor en autoclaveer ze. Inoculeer elke kolf met een enkele kolonie van OP50 en kweek de culturen bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende ongeveer 14 uur.
Voeg vervolgens aan de culturen 50 microgram per milliliter streptomycine toe. Schud de kolven vervolgens nog 30 minuten bij 37 graden Celsius en plaats de kolven vervolgens 15 minuten op ijs. Breng 450 milliliter van elke cultuur over in afzonderlijke 500 milliliter steriele centrifugeerbuisjes, bewaar de overgebleven cultuur op ijs, aangezien deze zal worden gebruikt om de concentratie van de bacteriën te bepalen.
Centrifugeer de buisjes 25 minuten bij 4500 x G en vier graden Celsius, gooi daarna de supernatant weg en bewaar de buisjes op ijs. Verdun met 900 microliter steriele LB 100 microliter overgebleven cultuur uit elke kolf. Gebruik een milliliter steriele LB om de spectrofotometer op nul te zetten en bepaal vervolgens de OD600 van de 10-voudige verdunning van elke cultuur.
Als bijvoorbeeld de OD600 van de 10-voudige verdunning van de overnachtelijke cultuur 0,28 is, dan had de cultuur een werkelijke OD600 van 2,8. Vanuit dit voorbeeld, om te komen tot een werkstockoplossing van 1,12 x 10 tot de 10de OP50 cellen per milliliter, wat gelijk is aan een OD600 van 56, suspendeer het pellet van de 450 milliliter cultuur in één 20ste van het oorspronkelijke volume of 22,5 milliliter steriele S basale oplossing of SB, aangevuld met 50 microgram per milliliter streptomycine. Maak alle volgende concentraties die in experimenten worden gebruikt in SB en strep, uit seriële verdunningen van de werkstock, met behulp van de verdunningsfactoren die in deze tabel staan vermeld.
Na het kweken en synchroniseren van C Elegans reporterstammen volgens het tekstprotocol, gebruik 15 milliliter SB om de wormen stap voor stap van de drie platen te wassen en het vocht in een steriele 15 milliliter buis te verzamelen. Laat de L4-larven natuurlijk sedimenteren en aspirier vervolgens alle vloeistof behalve ongeveer 0,5 milliliter. In de wildtype reporterstammen verwijdert dit type alle larven jonger dan L4. In mutante achtergronden helpt deze stap bij het verwijderen van eventuele gearresteerde larven, zoals de onze, in het geval van sterfgevallen van een OK3125.
Gebruik vervolgens negen milliliter SB om de wormen opnieuw te suspenderen. Bewaak opnieuw de sedimentatiesnelheid van de L4-larven en aspirier vervolgens alle vloeistof behalve ongeveer 0,5 milliliter van het supernatant zodra de meeste L4-larven zijn gepelleteerd voordat u het proces herhaalt. Voeg 10 microliter steriele S basale medium, aangevuld met 0,1% pluronic F127, toe aan de vloeistof die de L4-larven bevat.
Dit werkt als een oppervlakteactieve stof en voorkomt dat de larven aan de binnenkant van de plastic pipettenpunten plakken. Gebruik een P200 lagere retentie pipettenpunt om de larven voorzichtig te suspenderen en verdeel vervolgens 150 microliter op drie 10 centimeter RNAi platen die zijn gezaaid met 5 x 225 microliter egg vijf RNAi-bacteriën. Zorg ervoor dat de wormen gelijkmatig verdeeld zijn over alle vijf bacterie-matten.
Zodra de vloeistof in de agar is geabsorbeerd, verwijdert u eventuele niet-L4-larven van de platen die niet door de wasprocedure zijn geëlimineerd, door ze handmatig af te plukken. Bewaar vervolgens de platen gedurende 24 uur bij 20 graden Celsius. Om een breed scala DR te initiëren, plukt u eventuele jonge larven die aan de vorige handmatige verwijderingsstap ontsnapt zijn, waardoor alleen de een dag oude volwassenen op de platen achterblijven.
Gebruik voor elke stam 15 milliliter steriele SB strep om de een dag oude volwassenen van de drie platen te wassen in een 15 milliliter buis. Laat de wormen natuurlijk sedimenteren en aspirier vervolgens alle vloeistof behalve 0,5 milliliter van het supernatant. Suspendeer de wormen opnieuw met 9,5 milliliter SB strep en herhaal de sedimentatie- en wasstappen.
Na de laatste wassing en aspiratie van alle vloeistof behalve 0,5 milliliter van het supernatant, voegt u 10 microliter SB Plu toe en gebruikt u een P200 pipettenpunt om de larven voorzichtig te suspenderen. Verdeel 100 microliter van de larven op een NSC-plaat, gezaaid met 5 x 225 microliter bacteriën, met een concentratie van 2 x 10 tot de negende cellen per milliliter. Verdeel de 100 microliter gelijkmatig over alle vijf bacterie-matten.
Schat onder een microscoop het aantal dieren dat op de plaat aanwezig is, met als doel tussen de 100 en 150 wormen per plaat. Bepaal het volume vloeistof dat nodig is om een wormdichtheid binnen dit bereik te bereiken en verdeel het vervolgens over twee extra platen. Pas het aantal wormen op de eerste plaat aan om ook binnen dit bereik te vallen.
En bewaar de platen gedurende 24 uur bij
Overzicht
Deze studie presenteert een kader om breedspectrum voedingsbeperking te verbinden met genexpressie en levensduur. Het beschrijft protocollen voor voedingsbeperking en kwantitatieve beeldvorming van genexpressie, samen met computationele analyses om de genetische circuits die betrokken zijn bij voedseldetectie te begrijpen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurobiologie van veroudering
- Genexpressieanalyse
- Verwerking van omgevingsinformatie
Achtergrond
- Het begrijpen van de relatie tussen voeding en levensduur is cruciaal in verouderingsonderzoek.
- Het identificeren van genen die de levensduur moduleren op basis van omgevingssignalen kan inzichten geven in verouderingsmechanismen.
- Het C. elegans-model is effectief voor het bestuderen van sensorische systemen en genetische circuits.
- Het kwantificeren van omgevingsinformatie die wordt gecodeerd door genexpressie is essentieel voor dit onderzoek.
Doel van de studie
- Om genen te identificeren die betrokken zijn bij breedspectrum voedingsbeperking.
- Om de omgevingsinformatie die wordt gecodeerd door genexpressieniveaus te kwantificeren.
- Om de coderingsstrategieën die omgevingsfactoren met levensduur verbinden te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Protocollen voor het kweken van OP50-bacteriën en C. elegans.
- Kwantitatieve beeldvormingstechnieken voor genexpressieanalyse.
- Seriele verdunnings- en sedimentatiemethoden voor wormsynchronisatie.
- Experimentele setups voor voedingsbeperking en levensduurbeoordeling.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van belangrijke genen die omgevingsinformatie over levensduur overbrengen.
- Kwantitatieve gegevens over genexpressieniveaus onder voedingsbeperkingsomstandigheden.
- Inzichten in de coderingsstrategieën van neuronale circuits in C. elegans.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van het kader op bredere biologische systemen.
Conclusies
- Het kader verbindt effectief voedingsbeperking met genexpressie en levensduur.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van veroudering en omgevingsinteracties.
- Deze aanpak kan worden aangepast om andere biologische systemen te bestuderen buiten C. elegans.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This framework enables biopharma R&D to quantify how gene expression encodes environmental information relevant to lifespan modulation, supporting target validation in aging pathways. By linking sensory input to phenotypic output through information theory, it provides a mechanistic de-risking approach for identifying genes that modulate longevity under dietary restriction. The method supports predictive confidence in early discovery by revealing how genetic circuits process food availability signals to influence lifespan.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies genes that convey environmental information to modulate lifespan, enabling therapeutic hypothesis interrogation in aging pathways.
- Operational Value: Uses quantitative imaging and genetic analysis to establish expression-food level relationships for target prioritization.
- Scientific Value: Reveals how genes like daf-7 process food abundance signals, supporting functional validation of neural circuit targets in longevity regulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes standardized worm synchronization and imaging protocols for reproducible quantification of gene expression under dietary restriction.
- Operational Value: Provides serial dilution and sedimentation methods to generate calibrated bacterial food concentrations for scalable assay conditions.
- Scientific Value: Enables measurement of transcriptional reporters (e.g., TPH1, daf-7) in specific neurons to quantify food-encoded information in neural circuits.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links gene expression dynamics to lifespan outcomes, supporting biomarker alignment between environmental sensing and aging phenotypes.
- Operational Value: Uses microfluidic imaging and lifespan tracking to connect molecular readouts to phenotypic continuity across discovery and preclinical stages.
- Scientific Value: Uncovers coding strategies (redundant/synergistic) in neural circuits, informing mechanism-based risk assessment for target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery by linking environmental input (food level) to molecular readouts (gene expression) and phenotypic output (lifespan), supporting progression from target identification to mechanistic validation in aging research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how specific genes regulate lifespan in response to dietary restriction through quantitative expression-food level correlations.
- Screening: Enables assay readiness via synchronized L4 larvae preparation and controlled bacterial food concentrations for consistent gene expression measurement.
- Analytics: Quantifies information encoded by gene expression using joint distribution estimation and information theory to compare conditions and circuit contributions.
- Translational Research: Connects neural circuit activity to lifespan modulation, supporting biomarker continuity from environmental sensing to aging phenotypes.
- Enterprise Reuse: Framework is adaptable to any biological system where components process environmental information, enabling platform reuse across target validation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by quantifying how much environmental information is encoded by gene expression levels.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized worm handling, bacterial culture, and imaging protocols across experimental conditions.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in aging targets by revealing whether genes act individually or combinatorially in neural circuits to modulate lifespan.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying genes with high information-encoding capacity for dietary restriction response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, quantitative fluorescence imaging, and genetic strain management.
- Depends on controlled bacterial culture (OP50), serial dilution infrastructure, and microfluidic imaging systems for data collection.
- Necessitates cross-team standardization of worm synchronization, food concentration preparation, and lifespan assay timing.
- Adaptation across model systems requires validation of homologous neural circuits and environmental sensing mechanisms.
- Sample size is critical for accurate information theory application, as reliable gene expression distribution estimation depends on sufficient biological replicates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Preparation of Bacterial Cultures and Dilution for Experiments
3:05
Treatment of Reporter Strains with egg-5 RNAi
4:55
Initiation of Broad-range DR
7:19
Results: Information in C. elegans Quantified During Lifespan Modulation Through Broad-range Dietary Restriction
8:44
Conclusion
