Interactome-Seq: Een Protocol voor Domainome bibliotheek bouw, de validatie en de selectie door Phage Display en volgende generatie sequentiebepaling

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het eiwit gebaseerde onderzoek, zoals annotatie van nieuwe eiwitten of eiwitdomeinen, karakterisering van structurele en functionele eigenschappen van bekende eiwitten, definitie van eiwit interactie netwerken of antigeen antilichaam handtekeningen in verschillende omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het volledig onbevooroordeeld, hoge doorvoer en modulair is voor elke vorm van studie, variërend van een enkel gen tot een heel genoom. De bouw van een domainone bibliotheek is zeer nuttig voor functionele studies.

Het kan worden overgebracht naar een faagweergavecontext en gebruikt voor de selectie tegen verschillende doelen zoals bindende eiwitten of gezuiverde antilichamen. De koppeling met NGS maakt een uiterst gevoelige en krachtige analyse mogelijk. Tegelijkertijd geven de speciaal ontwikkelde webtools een nauwkeurige karakterisering van het hele domeinoom en inter interactoom.

Om de ORF-bibliotheek eerst te construeren, moet het DNA met pulsen van 30 seconden worden gesoond bij een output van 100%. Na sonicatie, laad de ladder en de gesoniceerde DNA op een 1,5% agarose gel. Start vervolgens de elektroforese-eenheid op vijf volt per centimeter gedurende 15 minuten.

De agarose gel elektroforese toont de aanwezigheid van DNA-uitstrijkje bevestiging van sonicatie. Dit is in vergelijking met de vaste band verkregen uit een DNA niet onderworpen aan sonicatie. Snijd vervolgens de gel gedeelte met de gefragmenteerde DNA-uitstrijkje en zuiveren met behulp van kolom gebaseerde gel extractie kit.

Meet de concentratie van het gezuiverde DNA in de UV-spectrofotometer. Volg vervolgens de instructies van de fabrikant en behandel vijf microgram van de wisselplaat met één microliter snel afstompend enzymmengsel. Activeer vervolgens het enzymmengsel gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius.

Om de filtervector voor te bereiden, verteert u eerst vijf microgram van de gezuiverde kloonvector met EcoRV-restrictieenzym. Laad vervolgens de verteerde en onverteerde vectoren en de moleculaire marker op een 1%agarose gel. Dan warmte inactiveren de beperking enzym bij 80 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Vervolgens fosforylaat de verteerde vector met vijf eenheden van fosfatase enzym en 1/10 volume van de 10X fosforbuffer. Vervolgens incubeer het mengsel op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Activeer vervolgens het fosfataseenzym bij 65 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Haal vervolgens de plasmide uit de gel en zuiver het DNA. Meet vervolgens de concentratie van het DNA in de UV-spectrofotometer. Om de ligatiereactie uit te voeren, voeg je 400 nanogram van de fosforyleerde wisselplaten toe aan één microgram verteerde vector, 10X T4 DNA ligase buffer en T4 DNA ligase aan een eindvolume van 100 microliters.

Dan broeden de ligatie reactie op 16 graden Celsius voor 's nachts. De volgende dag, warmte inactiveren de ligase op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 1/10 volume van drie molaire natriumacetaat toe bij pH 5.2 en 2,5 volumes van 100% ethanol om het ligatieproduct neer te halen.

Om DNA neer te halen, meng de reagentia en vries 20 minuten bij min 80 graden Celsius. Na 20 minuten, centrifuge op de hoogste snelheid gedurende 20 minuten op vier graden Celsius. Na centrifugatie, verdrijven de supernatant.

Voeg aan de pellet 500 microliters koude 70% ethanol toe en nogmaals centrifuge. Gooi de supernatant aan het einde van de centrifugatie weg. Zodra de pellet is lucht gedroogd, los het neergeslagen DNA in 10 microliters van water.

Voordat u elektroporatie uitvoert, moet u het juiste aantal microcentrifugebuizen en 0,1 centimeter elektroporatie cuvettes op ijs regelen. Voeg vervolgens een microliter van het gezuiverde ligatieproduct toe aan 25 microliter van de cellen. Dan pipette het DNA, cel mengsel aan de koude elektroporatie cuvette en flick de buis.

Veeg vervolgens het water van de buitenkant van de cuvette en plaats in de elektroporatie-eenheid en raak de puls. Nadat de elektroporatie voorbij is, voeg snel een milliliter vloeibaar 2X YT-medium zonder antibioticum toe aan de cellen in de cuvette. Breng het cellulaire mengsel vervolgens over naar een buis van 10 milliliter.

Laat de buis op een shaker op 220 omwentelingen per minuut op 37 graden Celsius voor een uur. Plaat de verdunningen van de bibliotheek op 10 centimeter 2X YT agar platen aangevuld met chloramphenicol, ampicilline en alleen chlooramphenicol. Dit is om enkele kolonies te verkrijgen om te worden getest door PCR en om titratie uit te voeren.

Vervolgens, plaat de getransformeerde bevoegde cellen op 15 centimeter 2X YT agar platen aangevuld met chlooramphenicol en ampicilline. Dan incubeer de platen op 30 graden Celsius voor 's nachts. De volgende dag, tel de kolonies het kiezen van de verdunning waar ze telbaar zijn.

Bereken vervolgens de grootte van de bibliotheek. De grootte van de bibliotheek wordt als volgt berekend, gemiddelde koloniegetal keer verdunningsfactor keer het totale bibliotheekvolume. De grootte van de bibliotheek moet in de orde van 10 zijn voor de kracht van zes klonen.

Als ampicilline concentratie optimaal is om meer filtering uit te voeren, de kloon nummer vermindert tot een tot 20 van die verkregen in de afwezigheid van dit antibioticum. Om te testen voor de positieve kolonies, gebruik een tip op te halen ongeveer 15 tot 20 enkele kolonies. Verdun vervolgens de kolonies met 100 microliter 2x YT medium zonder antibiotica.

Vervolgens versterkt PCR 0,5 microliter van de cultuur als DNA-sjabloon met Taq DNA polymerase. Tijdens de PCR, uitvoeren 25 cycli van versterkingen met behulp van annealing temperatuur van 55 graden Celsius en een verlengingstijd van 40 seconden bij 72 graden Celsius. Controleer of de lengte van de wisselplaat zich in het verwachte bereik van 150 tot 750 basispaar bevindt.

En dat verschillende kolonies verschillende tussenvoegsels met verschillende grootte presenteren. Dit duidt op een goede bibliotheekvoorbereiding in termen van variabiliteit. Voeg vervolgens drie milliliter vers 2X YT medium toe aan de 150 millimeter platen om de bacteriën te verzamelen.

Oogst vervolgens de bacteriën met behulp van een steriele schraper. Na het mengen grondig, voeg 20%glycerol en laat in min 80 graden Celsius in aliquots voor toekomstig gebruik. Voor onmiddellijk gebruik, uit te voeren kolom gebaseerde plasmid extractie kit om de plasmide DNA te zuiveren van een van de aliquots van de bibliotheek voor het toevoegen van glycerol.

Meet de concentratie van het DNA in de UV-spectrofotometer en bewaar de monsters bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Gebruik 2,5 microliter van de bibliotheek als DNA-sjabloon voor PCR-versterking. Stel de thermocycler voorwaarden in en start de run.

Gebruik vervolgens een index-PCR-kit om index-PCR uit te voeren. Dit zal de dubbele geïndexeerde bibliotheken binnen multiplexed Illumina-runs sequencen. Stel vervolgens de thermocycler voorwaarden in en start de run.

Na zuivering met AMPure XP kralen, om de grootte te verifiëren, voer een microliter van de een tot 10 verdunning van de laatste bibliotheek op de bioanalyzer. Kwantificeer vervolgens door het gebied van het uiteindelijke bibliotheektraceren te selecteren. Deze schematische voorstellingen demonstate dat na klonen in P filter vector, alleen kolonies die overeenkomen met ORF's produceren functionele beta-lactamase in aanwezigheid van antibiotica.

Na het filteren wordt een afname van het kloonaantal van 20-voudige verwacht. Met goede map ORF's groeien bij hogere antibioticaconcentraties. Bovendien kunnen de ORF-fragmenten eenvoudig worden teruggewonnen uit de gefilterde bibliotheek.

Een faagmid ORF bibliotheek is gebouwd om faag display selectie uit te voeren tegen doeleiwitten of antilichamen. Alle bibliotheken en de verkregen uitgangen worden vervolgens grondig geanalyseerd door de NGS. De NGS biedt een volledige informatie over de diversiteit van de bibliotheek, overvloed en nauwkeurige mapping van elk van de geselecteerde fragmenten.

Tot slot de interactome seek webtool ontwikkeld genereert raw sequencing leest, variërend van de lijst van vermeende domeinen met genomische annotaties. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe te bouwen en valideren van een domainome bibliotheek van een gewenste DNA-bron. En om een hoge doorvoer screening van de bibliotheek uit te voeren door de volgende generatie sequencing.

We hebben de volgorde van de ORF filterbibliotheken geoptimaliseerd met de Illumina-platforms en een webtool ontwikkeld die de analyse van dit soort gegevens mogelijk maakt zonder dat er programmeervaardigheden nodig zijn.