Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Dit protocol is belangrijk omdat het een algemene benadering biedt voor engineering eiwit dimerization systemen als biosensoren voor een verscheidenheid van kleine moleculen. Bovendien gebruikt het één zeer diverse eiwitbibliotheek om biosensoren voor verschillende liganden op een efficiënte en kosteneffectieve manier zonder de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur te selecteren. De ontworpen biosensor kan worden gebruikt om het celgedrag chemisch te controleren en om real-time veranderingen in celmetabolieten te monitoren.

Door middel van deze visuele demonstratie kunnen onderzoekers een gedetailleerde instructie van de technieken observeren met een duidelijke verwachting van de experimentele output. Begin elke selectieronde door één TG1 elektroporatie-competente celkolonie te kweken in zes milliliter 2YT-medium bij 37 graden Celsius en 250 omwentelingen per minuut tot een 600 nanometer absorptie van ongeveer 0,5. Wanneer de optimale optische dichtheid is bereikt, plaatst u de cellen op ijs.

Om de negatieve selectie kralen voor te bereiden, was 300 microliter van streptavidin-gecoate magnetische kralen drie keer met een milliliter van 05%PBS plus Tween buffer en twee keer met een milliliter PBS per wassen op een magnetische scheiding rack. Resuspend de kralen met een milliliter van 1%caseïne in PBS, en verzadigen de kralen met biotine op vijf keer de gerapporteerde bindingscapaciteit van de kralen. Na een uur bij kamertemperatuur met rotatie, was de kralen vijf keer met PBS plus Tween en drie keer met PBS zoals aangetoond.

Voeg na de laatste wasbeurt ongeveer één keer 10 toe aan de 13 faagdeeltjes in 1% caseïne en 1%runderserumalbumine in PBS voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur met rotatie. Breng aan het einde van de incubatie de supernatant over in een buis van 1,5 milliliter. Voor een positieve selectie met de biotinylated ligand-gebonden streptavidin kralen, verzadigen de helft van het volume van kralen gebruikt voor de negatieve selectie in de biotinylated ligand van keuze op vijf keer de volledige bindingscapaciteit zoals berekend volgens de handleiding.

Na een incubatie van een uur bij kamertemperatuur met rotatie, was de kralen vijf keer met PBS plus Tween en drie keer met PBS alleen zoals aangetoond, en blokkeer de kralen met een milliliter van 1% caseïne en 1% runder serum albumine gedurende een uur met rotatie. Aan het einde van de incubatie, was de streptavidin-gecoate magnetische kralen drie keer in PBS plus Tween en een keer in PBS alleen zoals aangetoond, en gebruik ongebonden faag om de streptavidin-gecoate magnetische kralen opnieuw op te zetten. Haal de niet-gebonden faagbevattende supernatant zonder de kralen te verstoren en zet het monster opzij om als input te worden gebruikt.

Was vervolgens de kralen 10 keer met PBS plus Tween en vijf keer met PBS zoals aangetoond, het overbrengen van de kralen naar een nieuwe buis na elke drie wasbeurten om te voorkomen dat niet-specifieke binding van de gebonden fagen aan de buiswanden. Om de gebonden fagen concurrerend te ontwijken, voeg je 450 microliter van een micromolarconcentratie van niet-biotinylated ligand toe aan de positieve selectiekralen en plaats je de kralen gedurende 30 minuten op rotatie. Breng aan het einde van de incubatie de supernatant over in een nieuwe buis die als uitgang moet worden gebruikt.

Voor input titratie, bereid 10 seriële verdunningen in PBS tot een keer 10 tot de negenvoudige met de input faag. Breng 10 microliter input faag van de ene keer 10 naar de zeven naar 10 naar de negen verdunningen naar 70-microliter aliquots van de voorbereide TG1 cellen. Na 45 minuten bij 37 graden Celsius, plaat de geïnfecteerde TG1 cellen op individuele 90-millimeter 2YT agar schotels met 100 microgram per milliliter ampicilline en 2%glucose voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius.

De volgende ochtend gebruikt u de formule om de faaginput te berekenen. Voor output infectie en titratie, voeg de eluted fagen tot drie milliliter TG1 cellen voor een 45-minuten incubatie in een 37-graden Celsius waterbad. Bereid vervolgens 10 seriële verdunningen van de geïnfecteerde cellen in verse 2YT medium tot een een keer 10 tot de derde concentratie, en plaat elke verdunning op 90-millimeter 2YT agar gerechten voor hun nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius.

De volgende ochtend, bereken de faag output volgens de formule. Om individuele klonen te isoleren van een verrijkte subbibliotheek, breng enkele kolonies van de 's nachts gekweekte, faag-geïnfecteerde TG1-celplaten over in 250 microliters van 2YT-medium aangevuld met ampicilline per goed in steriele diep-goed platen voor hun nachtelijke cultuur bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen een dichtheid van ongeveer 0,5 nanometer bereiken, voegt u vijf keer 10 toe aan de negen plaquevormende eenheden per milliliter CM13-helperproteit aan elke put en broed de cellen gedurende 45 minuten uit bij 37 graden Celsius bij 250 rotaties per minuut.

Voeg aan het einde van de incubatie 500 microliter 2YT-medium toe, aangevuld met ampicilline en 50 microgram per milliliter kanamycine aan elke put, en plaats de plaat 's nachts op 25 graden Celsius en 250 rotaties per minuut. De volgende ochtend, sediment de cellen door centrifugatie om het verzamelen van de faagdeeltjes mogelijk te maken. Om de ankerbinding door ELISA te valideren, bedekt u 's nachts 96-well ELISA-platen met 100 microliter van vijf microgram per milliliter streptavidin in coatingbuffer bij vier graden Celsius.

De volgende ochtend, was de platen drie keer in 300 microliter van PBS plus Tween alvorens 100 microliters van een-micromolar biotinylated doel toe te voegen aan de doelputten en 100 microliters van een-micromolar biotine of doelhomolog aan de juiste controle putten. Na een uur bij kamertemperatuur, was de platen vijf keer met PBS plus Tween per wasbeurt, en blokkeer elke niet-specifieke binding met 300 microliter van 1% caseïne per put gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de platen drie keer in verse PBS plus Tween per wasbeurt, en voeg de gezuiverde faag supernatant.

Na een uur op kamertemperatuur, was de borden 10 keer met verse PBS plus Tween per wasbeurt. Voeg 100 microliters mierikswortelperoxidase M13 major coat protein antilichaam toe aan elke put voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de platen drie keer zoals aangetoond, en voeg 100 microliters van TMB substraat aan elke put voor een 10-minuten incubatie bij kamertemperatuur of totdat een zichtbare kleurverandering wordt waargenomen.

Stop vervolgens de reactie met 100 microliters van eenkievel zoutzuur per put, en lees de plaat op 450 nanometer op een spectrofotometer. Na validatie van het ankerbindmiddel moet ook de dimerisatiebandscreening worden uitgevoerd met dezelfde eiwitbibliotheek die zich richt op het ankerbindbindbandcomplex. Typische verrijkingsresultaten na vier tot zes selectierondes zijn een goede indicatie dat er een hoge verhouding is tussen potentiële treffers in de sublibraries, in welk geval verdere selectierondes mogelijk niet nodig zijn.

Single-clone ELISA is geschikt voor het analyseren van de relatieve bindende affiniteit en selectiviteit van anker- en dimerisatiebindmiddelen en vergemakkelijkt de vergelijking van bindende selectiviteit tussen klonen. Evenzo, dimerization bindmiddel selectie maakt de identificatie van klonen die een heterodimeer vormen met de geïmmobiliseerde anker bindmiddel alleen met of zonder de ligand. Deze ligand concentratie-afhankelijke bindende gegevens suggereren dat de geteste nanolichamen geschikt zijn voor de bouw van een chemisch geïnduceerde dimerisatie systeem in vergelijking met de slechte binding aangetoond door de controle monsters.

Verder kan analytische grootte-uitsluiting chromatografie worden gebruikt om de heterodimeervorming tussen anker- en dimerisatiebindmiddelen in aanwezigheid van de ligand te bevestigen. In dit experiment werd bijvoorbeeld een dimerisatiepiek waargenomen toen de anker- en dimerisatiebindmiddelen en cannabidiol werden gemengd. Daarentegen werd er geen dimerisatiepiek gedetecteerd bij afwezigheid van cannabidiol of wanneer elk bindmiddel alleen in de kolom werd geladen.

Het eiwitverkleinisatiesysteem moet genetisch worden gecodeerd in gist- of zoogdiercellen om verdere verificatie van de geselecteerde biosensoren voor de ontwikkeling van in vivo-toepassingen mogelijk te maken. We verwachten dat deze methode andere onderzoekers de effectieve en noodzakelijke instrumenten zal geven voor het detecteren van belangrijke metabolieten, signaleringsmoleculen of geneesmiddelen in vivo met een hoge spatiotemporale resolutie.