Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits

Het algemene doel van deze procedure is het ontdekken van eiwitinteracties met geïmmobiliseerde bait-moleculen. Dit wordt bereikt door eerst de bait te verkrijgen en te immobiliseren. De tweede stap is het introduceren van de te screenen fagebibliotheek bij de bait onder condities die binding bevorderen.

Vervolgens worden de ongebonden fagen verwijderd door middel van grondige wasstappen. De gebonden fagen worden gebruikt om de bacteriën te infecteren voordat ze worden teruggewonnen. De laatste stap is het amplifieren van de gebonden fagen voor de volgende iteratie van de affiniteitsselectie.

Uiteindelijk, wanneer de faagtiter een plateau bereikt, worden individuele plaques geselecteerd en gesequenced om aan te tonen welke eiwitten de hoogste affiniteit hebben voor het geïmmobiliseerde substraat onder de experimentele bindingscondities. Dit proces kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over eiwit-eiwitinteracties. Deze procedure begint met het plaatsen van gezuiverd recombinant eiwit op de bodem van microtiterplaten, zoals beschreven in het tekstprotocol.

De volgende stap is het inoculeren van 50 milliliters Luria burani-medium met 100 micrograms per milliliter ampicilline in een 250 milliliter erlenmeyerfles met een enkele kolonie die eerder is gekweekt zoals beschreven in het tekstprotocol; incuberen bij 37 degrees Celsius, 200 RPM in een horizontale schudmachine en een spectrophotometer gebruiken om de celdichtheid te monitoren tot een optische dichtheid bij 600 nanometers van 0,5 tot 0,6 is bereikt. Giet de cellen vervolgens in een 50 milliliter Falcon-buis of vergelijkbaar en bewaar deze bij vier degrees Celsius tot gebruik; de cellen blijven gewoonlijk ongeveer een week levensvatbaar. Bereid op dag één de affiniteitselectie voor zoals beschreven in het tekstprotocol op de ochtend van dag twee.

Plaats negen geautoclaveerde, lege Erlenmeyerskolven van 250 milliliter in de klemmen van een incubatieschudder. Inoculeer 500 milliliters lal burani met 500 µL van een van de overnightculturen van faag-geïnfecteerde BLT 5 4 0 3-cellen die de vorige avond zijn gestart. Nadat de kolf in de incubator is geplaatst, schakelt u de spectrophotometer in en stelt u deze in om de absorbantie bij 600 nanometer te meten. Haal ondertussen de microtiterplaat uit de koelkast op 4 °C en verwijder de plastic folie. Verwijder alle ongebonden eiwitten van de plaat door 10 keer te wassen met 200 µL per well van 1X tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) pH 7,5 en door de plaat tussen de wasbeurten door ondersteboven op een papieren handdoek te kloppen.

Blokkeer met 200 µL per putje van 5% blokkeerreagens in TBS gedurende één uur. Terwijl de plaat is omwikkeld met vershoudfolie, wordt de blokkeersolutie 10 keer weggewassen met 200 µL van één X-T-B-S-T door de plaat ondersteboven tegen vier lagen keukenpapier te tikken tussen de wasbeurten door.

Gebruik vanaf dit punt filterbarrier-tips om kruiscontaminatie van fagen te voorkomen. Pipetteer 100 microliters van de fagenbibliotheek bij de eiwitten. Sluit de plaat opnieuw af met plastic folie en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Verwijder na één uur de plastic folie van de plaat en was deze onmiddellijk door de fagen uit te schudden in het biologisch gevaarlijk afval. Gebruik vervolgens een multichannelpipet om snel 200 µL van 1X TBST aan elke put toe te voegen. Zet een timer voor één minuut.

Schud na één minuut de buffer weg in het biohazard-afval, klop de plaat ondersteboven op een papieren handdoek en plaats deze terug op de bench. Herhaal de wasstappen 10 keer; na de 10e wasbeurt neemt u 200 µL BLT 5 4 0 3-cellen uit de 50 mL falcon tube bij 4 °C en brengt u deze over naar de bodem van elk van de negen wells waarvan de laatste wasbeurt is verwijderd.

Wikkel de platen in plasticfolie en plaats deze 20 minuten lang bij 37 °C, zodat eventuele fagen die nog aan het lokaas kleven na 20 minuten de bacteriën kunnen infecteren. Verwijder de folie van de platen. Neem vervolgens 10 µL bacteriën uit de BSA-well van replicatie één bij 25 °C en breng deze over naar de 990 µL medium in de well gemarkeerd als één.

Herhaal dit proces nog twee keer voor die put, resulterend in drie triplicaten van een 1 tot 100 verdunning van de faag uit die put; dit is BSA replicatie één, drie keer bemonsterd. Deze verdunningen worden gebruikt om de gemiddelde titer plus of minus de standaardfout van het gemiddelde te schatten voor die replicatie van BSA. Doe hetzelfde voor replicatie twee en drie van BSA, voor de drie gerepliceerde putten van het vergiftigde lokeiwit en voor het lokeiwit. Zet deze 27 EPR-buisjes apart. Als de bacteriën in de kolf een optische dichtheid van 0,6 tot 1,0 hebben, giet dan 50 milliliters van de cellen uit de Erlenmeyerkolf in elk van de 9 Erlenmeyerkolven van 250 milliliter.

Neem de resterende 170 µL faag-geïnfecteerde BLT 5 4 0 3 bacteriën uit de BSA-replicatieput één en voeg deze toe aan de 50 mL cellen gemarkeerd als BSA rep.One. Doe dit voor alle negen putten voordat de kolven in de incubator bij 37 °C worden geschud. Voer ondertussen verdunningen uit vanaf de initiële 27 verdunningen door 100 µL LB met bacteriën uit einor-buis één te nemen en dit toe te voegen aan de 900 µL LB in de einor-buis.

Voor de 10⁻³ verdunning: gooi de filterpunt weg en gebruik een nieuwe punt voordat u 100 µL van de LB met bacteriën uit buis vier neemt en dit toevoegt aan de 900 µL LB in buis zeven voor de 10⁻⁴ verdunning. Zet de verdunningsreeks voort voor alle triplicaten van alle replicaties van alle eiwitten en behandelingen. Er moeten in totaal 135 buisjes zijn zodra de cellen zijn gelyseerd.

Breng de cultuur naar 0,5 M natriumchloride door vijf milliliter van een 5 M natriumchloride-voorraadoplossing toe te voegen en breng het monster over naar een gelabelde centrifugefles; centrifugeer gedurende 10 minuten bij 8.000 ×g bij vier graden Celsius. Decanteer vervolgens het supernatant dat het virus bevat in een schone, steriele Falcon-buis van 50 milliliter. Voeg een paar druppels chloroform toe aan het gedecanteerde supernatant in de Falcon-buis.

Het supernatant kan worden bewaard bij vier graden Celsius voor de volgende ronde van affiniteitsselectie op dag drie; pipetteer 250 microliter VLT 5 4 0 3 cellen van vier graden Celsius in elk van de eerder voorbereide genummerde borosilicaatproefbuisjes. Pipetteer vervolgens 100 microliter van de verdunning in einorbuis één in de 250 microliter cellen in borosilicaatproefbuis één. Verhit kort de eerste vijf inch van de pipet boven de vlam en dompel deze in de gesmolten top aros.

Zuig drie milliliter op en breng dit snel over in de reageerbuis bovenop de cellen en fagen. Meng door met een vinger tegen de buis te tikken terwijl u de buis met de andere hand vasthoudt, en giet vervolgens de inhoud op de plaat. Kantel de plaat en gebruik de reageerbuis om luchtbellen en droge plekken weg te duwen totdat de hele plaat bedekt is door de bovenste agar.

Zet het rechtop op de bench om af te koelen. Gooi de borosilicaatbuis weg. Verwijder de filterbarrière-tip, neem een nieuwe tip en ga verder tot alle verdunningen zijn uitgeplaat.

Haal de voorbereide platen uit de incubator zodra ze worden verbruikt, maar niet meer dan zes tegelijk, anders koelen ze af en stolt de bovenste agar te snel; inspecteer de plaques die op de platen zijn gevormd en gooi platen met confluente lysis weg. Bepaal welke van de resterende seriële verdunningen voldoende weinig plaques hebben geproduceerd om een nauwkeurige telling mogelijk te maken. Noteer het aantal plaques van deze platen en bereken de titer zoals beschreven in het tekstprotocol aan het einde van de affiniteitsselectie. Selecteer in ronde vier 18 individuele, goed gedefinieerde plaquekolonies met een steriele gele pipetpunt.

Bevocht de binnenkant van de tip met tris-hydrochloride pH 8,5 in een einor-buisje. Neem vervolgens monsters van deze plaques van de titerplaten door de tip door een goed geïsoleerde plaque direct door de plastic petrischaal eronder te duwen en de kern op te zuigen; breng de kern over in 100 µL tris-hydrochloride pH 8,5 in het juiste buisje voordat u deze vortexed. Verhit kort 20 µL van dit volume bij 65 °C gedurende 10 minuten en ga verder met de PCR en sequencing zoals beschreven in het tekstprotocol. Hier worden typische titerresultaten getoond; door meerdere keren te bemonsteren zijn de uiteindelijke geschatte totalen minder gevoelig voor pipetteerfouten, wat een nauwkeurigere schatting geeft van de werkelijke titer en de variatie hieromheen.

Schattingen per put tonen een voorkeur voor een toenemende fage-titer in de niet-gegifte lokaasputten naarmate het aantal ronden van affiniteitsselectie toeneemt. Dit biedt tevens bevestiging dat de techniek correct functioneert. De retentie van een toenemend percentage fagen met insert in de niet-gegifte lokaasputten naarmate het aantal affiniteitsselecties toeneemt, is eveneens gunstig na geavanceerde ronden van affiniteitsselectie.

Een toename van het aantal onafhankelijk teruggewonnen fagen die een insert hebben ten opzichte van de eerste ronde, en het concentreren van deze ampliconen in enkele banden van identieke grootte, is een goede indicatie dat specifieke klonen worden geselecteerd tijdens de affiniteitsselectie na deze procedure. Andere methoden, zoals yeast two-hybrid, kunnen worden uitgevoerd om de door phage display ontdekte interacties te valideren.