Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits
February 16th, 2014
Faagdisplay is een krachtige techniek om eiwitten of eiwitcomponenten die interageren met een geïmmobiliseerd molecuul van belang vangen. Zodra een beslissing van de aard van de faag cDNA bibliotheek creëren en het scherm is gemaakt, de hier beschreven protocol maakt efficiënte affiniteit selectie leidt tot de identificatie van interactoren.
Het algemene doel van deze procedure is om eiwitinteracties te ontdekken met geïmmobiliseerde aasmoleculen. Dit wordt bereikt door eerst het aas te verwerven en te immobiliseren. De tweede stap is om de fagenbibliotheek die getest moet worden onder voorwaarden die binding bevorderen aan het aas te introduceren.
Vervolgens worden de ongebonden fagen verwijderd door streng wassen. Terwijl gebonden fagen worden gebruikt om de bacteriën te infecteren voordat ze worden teruggewonnen. De laatste stap is om de gebonden fagen te amplificeren voor de volgende iteratie van affiniteitsselectie.
Uiteindelijk, wanneer het fagengetal geen plateau meer bereikt, worden enkele plaques geselecteerd en gesequenced om te laten zien welke eiwitten de hoogste affiniteit hebben voor het geïmmobiliseerde aas onder de experimentele bindingsomstandigheden. Dit proces kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over eiwit-eiwitinteracties. Deze procedure begint met gezuiverde recombinante eiwitten die worden geplaatst op de bodem van microtiterplaten zoals beschreven in het tekstprotocol.
De volgende stap is om 50 milliliter Luria burani-medium te inoculeren met 100 microgram per milliliter ampicilline in een 250 milliliter erlenmeyer kolf met een enkele kolonie die eerder is gekweekt zoals beschreven in het tekstprotocol. Incubeer bij 37 graden Celsius, 200 RPM in een horizontale shaker en gebruik een spectrofotometer om de celdichtheid te controleren totdat een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5 tot 0,6 wordt verkregen. Giet vervolgens de cellen in een 50 milliliter Falcon buis of iets dergelijks en bewaar bij vier graden Celsius tot gebruik. De cellen blijven meestal ongeveer een week levensvatbaar op dag één. Bereid u voor op affiniteitsselectie zoals beschreven in het tekstprotocol op de ochtend van dag twee.
Plaats negen autoclaaf lege, 250 milliliter erlenmeyer kolven in de klemmen van een incuberende shaker. Inoculeer 500 milliliter lal burani met 500 microliter van een van de overnachtelijke culturen van fagen geïnfecteerde BLT 5 4 0 3 cellen die 's nachts zijn gestart na het plaatsen van de kolf in de incubator. Zet de spectrofotometer aan en stel deze in om de absorptie bij 600 nanometer te lezen. Haal ondertussen de microtiterplaat van vier graden Celsius en verwijder de plastic film. Verwijder eventueel ongebonden eiwit van de plaat door 10 keer te wassen met 200 microliter per putje van een X tris gebufferde zoutoplossing of TBS pH 7,5 en sla de plaat ondersteboven op het keukenpapier tussen wasbeurten door.
Blok met 200 microliter per putje van 5% blokkeerreagens in TBS gedurende één uur. Met de plaat in plasticfolie gewikkeld, was de blokkeeroplossing 10 keer af met 200 microliter van een X-T-B-S-T door de plaat ondersteboven op vier lagen keukenpapier te slaan tussen wasbeurten.
Gebruik hiervandaan filterbarrièretips om fagen kruisbesmetting te voorkomen. Pipetteer 100 microliter van de fagenbibliotheek in met de eiwitten. Sluit de plaat weer af met plasticfolie en incubeer gedurende één uur op kamertemperatuur.
Na één uur verwijdert u de plasticfolie van de plaat en was onmiddellijk door de fagen in het biogevaarlijk afval te schudden. Gebruik vervolgens een multipipetter om snel 200 microliter van een X-T-B-S-T aan elke putje toe te voegen. Zet een timer voor één minuut.
Na één minuut schudt u de buffer in het biogevaarlijk afval, sla de plaat ondersteboven op keukenpapier en plaats het terug op de werktafel. Herhaal de wasstappen 10 keer na de 10e wasbeurt. Neem 200 microliter BLT 5 4 0 3 cellen vanuit de 50 milliliter Falcon buis bij vier graden Celsius en breng over naar de bodem van elk van de negen putjes waarvan de laatste wasbeurt is verwijderd.
Wickel de platen in plasticfolie en zet ze 20 minuten op 37 graden Celsius om eventuele fagen die nog aan het aas vastzitten te laten infecteren met de bacteriën. Na 20 minuten verwijdert u de plasticfolie. Vervolgens verwijdert u 10 microliter bacteriën van de BSA bij 25 graden Celsius replicatie één putje en breng over naar de 990 microliter medium gemarkeerd één.
Herhaal dit proces nog twee keer voor dat putje, wat resulteert in drie drievoudigen van één tot 100 verdunning van de fagen van dat putje. Dit is BSA replicatie één drie keer bemonsterd. Deze verdunning zal worden gebruikt om het gemiddelde getal plus of min de standaarddeviatie van het gemiddelde voor die replicatie van BSA te schatten. Doe hetzelfde voor replicatie twee en drie van BSA voor de drie gerepliceerde putjes van het vergiftigde aas-eiwit en voor de aaseiwitset. Zet deze 27 EOR buisjes opzij. Als de bacteriën in de kolf een optische dichtheid hebben van 0,6 tot 1,0, decant 50 milliliter van de cellen uit de fern kolf in elk van de 9 250 milliliter erlenmeyer kolven.
Neem de resterende 170 microliter fagen geïnfecteerde BLT 5 4 0 3 bacteriën in de BSA replicatie één put en voeg toe aan de 50 milliliter cellen gemarkeerd BSA rep.Een. Doe dit voor alle negen putjes voordat u de kolven in de 37 graden Celsius incubator schudt. Voer ondertussen verdunningsstappen uit van de oorspronkelijke 27 verdunningsstappen door 100 microliter van de LB met bacteriën van Einor buis één te nemen en toe te voegen aan de 900 microliter LB in einor buis.
Vier voor de 10 tot de min derde verdunning, gooi de filterbarrièretip weg voor een nieuwe voordat u 100 microliter van de LB met bacteriën van einor buis vier neemt en toevoegt aan de 900 microliter LB in eph buis. Zeven voor de 10 tot de min vierde verdunning, vervolg de verdunning voor alle drievoudigen van alle replicaties van alle eiwitten en behandelingen. Er zouden in totaal 135 buisjes moeten zijn eens de cellen zijn gelyseerd.
Breng de cultuur naar 0,5 molair natriumchloride door vijf m
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de fagdisplay-techniek die wordt gebruikt om eiwitinteracties met geïmmobiliseerde lokaasmoleculen te identificeren. Het protocol maakt efficiënte affiniteitsselectie en identificatie van interactoren mogelijk.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Eiwitinteracties
- Fagdisplaytechnologie
- Affiniteitsselectie
Achtergrond
- Fagdisplay is een methode voor het bestuderen van eiwitinteracties.
- Het omvat het gebruik van een cDNA-bibliotheek.
- Geïmmobiliseerde lokaasmoleculen zijn essentieel voor het proces.
- De techniek maakt de identificatie van specifieke interactoren mogelijk.
Doel van de studie
- Om eiwitinteracties met geïmmobiliseerde lokaasmoleculen te ontdekken.
- Om een gedetailleerd protocol voor fagdisplay te bieden.
- Om de efficiëntie van affiniteitsselectie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Acquisitie en immobilisatie van lokaasmoleculen.
- Introductie van fagbibliotheek naar het lokaas.
- Streng wassen om vrije fag te verwijderen.
- Besmetting van bacteriën met gebonden fag voor herstel.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van eiwitinteractoren.
- Efficiënte amplificatie van gebonden fag.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol.
- Mogelijke toepassingen in verschillende biologische studies.
Conclusies
- Fagdisplay is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitinteracties.
- Het beschreven protocol verbetert het identificatieproces.
- Verder onderzoek kan de toepassingen in de biologie uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Phage display enables high-confidence identification of protein-protein interactions through iterative affinity selection and titer monitoring, supporting target validation in early discovery. By requiring independent clone recovery and amplicon consistency, the method reduces false positives and increases predictive confidence in bait interactors. This workflow informs lead identification by prioritizing targets with reproducible binding evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying proteins that consistently bind immobilized bait under stringent conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through replicate screening and titer progression tracking to distinguish specific from nonspecific binding.
- Predictive Value: Increasing phage titer and insert retention across rounds provide quantitative evidence for target engagement strength and specificity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated phage libraries for downstream screening by enriching for high-affinity binders through controlled washing and amplification steps.
- Reproducibility: Monitoring phage titer after each selection round provides a quantifiable metric to assess selection efficacy and control consistency across replicates.
- Scalability: The protocol accommodates multiple baits in parallel using microtiter plates, enabling medium-throughput interaction profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Confirmed interactors from phage display can be forwarded to orthogonal validation (e.g., co-IP, yeast two-hybrid) to support preclinical target assessment.
- Mechanistic De-risking: Isolation of independent plaques and sequencing of amplicons helps confirm that observed binding reflects specific protein-protein interactions rather than artifacts.
- Risk-Adjusted Advancement: The settling of amplicons on identically sized bands after multiple rounds signals clonal enrichment, supporting go/no-go decisions in target prioritization.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead identification, providing biochemical evidence to inform downstream validation efforts.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about protein interactions by selecting for phage encoding proteins that bind bait under defined conditions.
- Screening: Generates enriched phage pools suitable for further characterization through iterative binding and amplification.
- Analytics: Titer measurements and amplicon analysis enable quantitative assessment of selection progress and clone enrichment.
- Translational Research: Identified interactors serve as candidates for functional validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: The standardized workflow can be applied across multiple baits and targets, supporting platform reuse in interaction discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by requiring reproducible recovery of independent clones presenting the same protein.
- Operational Value: Employs standardized washing, blocking, and infection steps to minimize variability and cross-contamination.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by filtering out nonspecific binders early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on binding consistency and enrichment metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology techniques including phage handling, bacterial culture, and nucleic acid manipulation.
- Depends on access to incubators, shakers, spectrophotometers, and centrifugation equipment for titer determination.
- Necessitates standardized reagent preparation (e.g., TBS, blocking agents) and strict adherence to washing protocols to control background.
- Involves adaptation considerations when using non-protein baits, as blocking and washing conditions may require optimization.
- Practical limitations include the time required for multiple affinity selection rounds and the need for careful plaque picking to avoid confluent lysis.
