Biosensor-gebaseerde high throughput biopanning en bioinformatica analyse strategie voor de wereldwijde validatie van drug-eiwit interacties

De identificatie van interacties tussen kleine moleculaire eiwitten is essentieel voor de onderzoek en ontwikkeling van geneesmiddelen en bevordert ons begrip van de pathologische mechanismen die ten grondslag liggen aan virus DTC's. Deze methode vergemakkelijkt de hoogdoorvoerige biopanning van geneesmiddelherkennende peptiden en de wereldwijde validatie van geneesmiddelbindingsplaatsen op eiwitten voor kleine moleculaire geneesmiddelen van belang. Om een QCM sensorchip voor te bereiden, bevestigt u een keramisch sensorchip op de oscillator van een 27 megahertz QCM apparaat en registreert u de intrinsieke frequentie in de luchtfase vóór de immobilisatie van kleine moleculen.

Na de registratie verwijdert u het chip en voegt u voorzichtig een druppel van 20 microliter van een oplossing van een millimolair afgeleid klein molecuul in 70% ethanol toe om een zelf geassembleerde monolaag op de gouden elektrode van het sensorchip te creëren. Plaats de chip in een Petrischalen bekleed met bevochtigd weefsel, bescherm het tegen licht gedurende één uur bij kamertemperatuur voordat u het oppervlak van de elektrode voorzichtig wast met ultra zuiver water. Droog de chip met een zachte toepassing van lucht en laad de chip op het QCM apparaat.

Na één uur registreert u de frequentievermindering in de luchtfase om de hoeveelheid van het kleine molecuul te meten dat is geïmmobiliseerd. Voor T7 Fagen Bibliotheek Biopanning, plaatst u een cuvet met een toegewijde magnetische roerder op de QCM biosensor ingesteld op 1000 omwentelingen per minuut en voegt u acht milliliter reactiebuffer toe aan de cuvet Terwijl de buffer wordt geroerd, bevestigt u het QCM sensorchip aan de oscillator Houd de arm van de oscillator ingedrukt om de chip in de buffer te onderdompelen en begin met het bewaken van de QCM frequentie. Wanneer de sensorgram zich stabiliseert tot ongeveer drie Hertz per minuut frequentiedrijf, injecteert u acht microliter van een T7 fagen bibliotheek in de cuvet en markeert u het injectiepunt op de sensor.

Bewaakt u de frequentievermindering veroorzaakt door de T7 fagen die zich binden aan het kleine molecuul dat is geïmmobiliseerd op het gouden elektrodeoppervlak. Stop na 10 minuten de QCM frequentiemonitor en til snel de oscillator op om de sensorchip uit de batch te verwijderen, los de sensorchip van de oscillator en verwijder de buffer van de chip. Plaats de gedroogde sensorchip in een vochtige Petrischalen en voeg een druppel van 20 microliter van log fase E-coli gastheercellen toe op het gouden elektrodeoppervlak.

Incubeer de schotel op een 96-wells microplaatmixer bij 37 graden Celsius en 1000 tot 1500 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht om de herstel van de gebonden T7 zeven fagen te verbeteren. Aan het einde van de incubatie brengt u de 20 microliter E-coli suspensie over in 200 microliter LB-medium. Volgens de algemene procedure voert u de fagen plaque isolatie in het medium uit en DNA-sequencing die de geneesmiddelherkennende peptidesequenties codeert die op elke fagen capsid worden weergegeven.

Als naonderhoud van de sensorchip gebruikt u een met een 1% natriumdodecylsulfaatoplossing doordrenkte wattenstaafje om het elektrodeoppervlak te reinigen, wast u het gouden oppervlak met ultra zuiver water en droogt u het elektrode met lucht. Behandel vervolgens het elektrodeoppervlak met vijf microliter vers bereide Parana-oplossing gedurende vijf minuten gevolgd door een ultra zuiver waterwas en luchtdroging twee keer. Om bioinformatica-analyse uit te voeren met behulp van RELIC, pakt u het standalone RELIC-programma uit op een pc met een Windows-besturingssysteem en gebruikt u de aminozuursequenties van door geneesmiddel geselecteerde 15 mer-peptiden of enkele of meerdere eiwitten in elk tekstbestand met snel A-formaat.

Plaats de vereiste tekstbestanden in de map van AA-div, info, motief, match, hetero align, fast A con of fast A scan. Klik op elk uitvoerbaar bestand in de onafhankelijke map om de persoonlijke versie van FTN 95 te openen en voer de juiste bestandsnaam en extensie in in de opdrachtregel om elk programma uit te voeren en het resulterende tekstformaatbestand te verkrijgen. De resulterende tekstformaatbestanden die zijn verkregen, worden hier getoond.

Exporteer vervolgens het resulterende tekstbestand naar een spreadsheet om een plot van informatie-inhoud of cumulatieve gelijkenisscores te genereren die zijn berekend met behulp van een blow some 62. Met behulp van deze strategie zijn succesvol enkele en meerdere kleine molecuulbindingsplaatsen op de doelwitten geïdentificeerd voor zes kleine moleculaire geneesmiddelen. Bijvoorbeeld, 29 peptiden die het klinisch goedgekeurde geneesmiddel Irinotecan herkennen geïmmobiliseerd als een zelfgeassembleerde monolaag, werden geïdentificeerd door QCM biosensor gebaseerd op een cyclische biopanning Vervolgens yieldde de twee-aan-twee vergelijking van de 29 peptiden en acetylcholinesterase maximale scores voor specifieke aminozuurresiduen die consistent waren met die welke het Irinotecan bindingsplaats vormen.

Dezezelfde subset van peptiden werd ook succesvol geïdentificeerd in de nabijheid van de katalytische triade in Carboxylesterasen, wat aangeeft dat deze aminozuren een scaffold vormen voor Irinotecan herkenning tijdens de-esterificatie. De 27 peptiden die het anti-griepgeneesmiddel Oseltamivir herkennen die de gouden elektrodeoppervlak van het QCM sensorchip bedekken, hebben met succes de oseltamivir bindingsplaats in neuraminidase gedetecteerd. Deze bindingsplaats bestaat uit ongestructureerde peptidelussen die mogelijk dynamisch bewegen tijdens het docking met oseltamivir.

Geneesmiddelen, regio's, chemicaliën, recombinante bacteriofagen en bacteriën zijn biologische lijkwagens en moeten worden behandeld volgens het culture gain protocol. Vergeet niet om altijd handschoenen, veiligheidsbrillen en een laboratoriumjas te dragen voor de veiligheid. Volgens deze procedure kunnen doelwitten voor verschillende geneesmiddelen wereldwijd worden gevalideerd in mensen, pathologische virussen, zelfs planten om de moleculaire mechanismen en potentiële therapeutische werkzaamheid van geneesmiddelen van belang te begrijpen.