Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren
February 16th, 2018
Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.
Het algemene doel van dit protocol is om een populatie microglia met hoge zuiverheid van knaagdieren te isoleren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuro-informatie, zoals het identificeren van de immunomodulerende eigenschappen van stamcellen op microglia of het uitvoeren van geneesmiddelscreeningstests. Het grote voordeel van deze techniek is de isolatie van een populatie microglia met hoge zuiverheid zonder de noodzaak van een langdurige cultuurtijd.
Om deze procedure te beginnen, steekt u de punten van de schaar door de opening in het ruggenmergkanaal en maakt u laterale insnijdingen naar de gehoorgang. Schuif vervolgens voorzichtig het weefsel naar de snuit om de schedel bloot te leggen. Maak vervolgens een incisie langs de sagittale naad richting het bregma.
Steek vervolgens de punt van de schaar in het bregma en maak laterale insnijdingen. Vervolgens, verwijder voorzichtig de schedel om de hersenen bloot te leggen. Gebruik gekromde pincetten om het te verwijderen en breng het over in een steriele container van vijf milliliter.
Was het twee tot drie keer met vijf milliliter ijskoud wasmedium per wasbeurt om het bloed te verwijderen. Plaats de inhoud van de vijf-milliliter container in een kleine petrischaal op ijs in een laminaire stromingskast. Gebruik een steriele scalpel of steriele schaar om het cerebellum en de reukbol te verwijderen.
Maak vervolgens een middenlijnsnede om de twee hemisferen te scheiden. Vervolgens identificeert u de meningeale laag als een zeer dunne laag cellen met een rode tint op het oppervlak van de hersenen met zichtbare bloedvaten. Verwijder voorzichtig de meningeale laag met fijne pincetten, zorg ervoor dat u de cortices niet beschadigt.
Als de meningeale laag breekt, verwijdert u de gescheurde fragmenten totdat deze volledig verwijderd is. Breng vervolgens de hemisferen over naar een nieuwe kleine petrischaal op ijs en vul deze met wasmedium. Hak de hersenen in kleine stukken met een steriele scalpel.
Voeg vervolgens 100 microliter papaïne en 150 microliter DNase1 toe aan het medium en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na de vertering, tritureer het weefsel met een P1000 pipet. Als de weefselstukken te groot zijn om in de pipet te passen, overweeg dan om een paar steriele schaar te gebruiken om de pipetpunt te verbreden.
Zorg er tijdens dit proces voor dat u geen luchtbellen in het medium introduceert, aangezien dit de celviabiliteit kan verminderen. Bereid in een laminaire stromingskast een 50-milliliter kegelbuis voor met een 100-micrometer celstrainer. Giet het verteringsmedium en hersendelen op de zeef.
Duw door de stukken hersenen door de zuiger van een steriele drie-milliliter spuit in een malende beweging tot er geen weefsel meer zichtbaar is. Was de filter continu met het wasmedium gedurende dit proces. Dit zal alle cellen wegspoelen die in de zeef zijn vastgehouden.
Centrifugeer daarna de enkele celsuspensie gedurende vijf minuten bij 500 G en vier graden Celsius. Bereid vervolgens de stock isotone Percoll voor door een verhouding van negen-tot-één van dichtheidsgradiëntmedium toe te voegen aan 10X steriele HBSS. Bereid gradiënten voor als 30%SIP in DMEM en 70%SIP in een-X HBSS.
Voorbeeld: om 10 milliliter 30%SIP te bereiden, voegt u drie milliliter SIP toe aan zeven milliliter DMEM. Aspirieer vervolgens het supernatant uit de kegelbuis en suspendeert u het cellenpellet met acht milliliter 30%SIP in DMEM. Breng het volledige volume over naar een nieuwe 15-milliliter kegelbuis.
Onderlaag vervolgens de 70%SIP-oplossing door een overdrachtpipet te vullen met 70%SIP en voorzichtig door de overdrachtpipet naar de bodem van de kegelbuis te duwen. Zodra de punt dicht bij de bodem is, duwt u voorzichtig de inhoud door de overdrachtpipet. Centrifugeer vervolgens de SIP-lagen inclusief de cellen bij 650 G met rem nul en versnelling vier gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur.
De 70%Percoll-laag moet met grote zorg onderlaagd worden. Verstoring van deze interface kan de opsluiting van de microglia in de cellagen ernstig beïnvloeden en de opbrengsten ernstig verminderen. Aspirieer vervolgens vier milliliter van het medium met cellulaire resten vanaf de bovenkant van de buis om de verwijdering van mononucleaire cellen in de volgende stap te vergemakkelijken.
Vervolgens, laat de pipetpunt voorzichtig zakken naar de interface en isoleer de mononucleaire cellen van de 30/70 dichtheidsgradiëntmedium-interface. Verzamel ongeveer drie milliliter van de troebele interface en breng het over naar een nieuwe 15-milliliter kegelbuis. Verdun vervolgens het mengsel met negen milliliter HBSS om de verwijdering van het dichtheidsgradiëntmedium te vergemakkelijken.
Centrifugeer het verdunde dichtheidsgradiëntmedium-interface dat de mononucleaire cellen bevat gedurende vijf minuten bij 500 G. Aspirieer het supernatant en suspendeer het opnieuw met één milliliter groeimedium. Vervolgens kleurt u de gesuspendeerde cellen met Trypan blauw en voert u een celtelling uit met behulp van een hemocytometer.
In deze stap centrifugeert u de verzamelde mononucleaire cellen gedurende 10 minuten bij 300 G en vier graden Celsius om het groeimedium te verwijderen, aangezien dit interfereert met de magnetische isolatie. Gebruik dezelfde celtelling die eerder is verkregen, suspendeer bij een keer 10 tot acht nucleaire cellen per milliliter in PBS met 2%FBS en één millimolair EDTA binnen een volumebereik van 0,1 tot 2,5 milliliter. Voeg vervolgens het volledige volume van nucleaire cellen in PBS toe aan een nieuwe vijf-milliliter polystyreen rondbodembuis.
Voeg vervolgens 50 microliter CD11b PE-labelingsreagens toe per één milliliter monster. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten beschermd tegen licht. Voeg vervolgens 70 microliter selectiecocktail toe per één milliliter monster.
Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten beschermd tegen licht. Meng vervolgens de
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van primaire microglia uit muizenhersenen, wat ons begrip van neurologische aandoeningen verbetert. De methode integreert dichtheidsgradiëntcentrifugatie en magnetische scheiding om efficiënt microgliale monsters met hoge zuiverheid te bereiken. Belangrijke stappen voor celkarakterisering worden ook geschetst.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Microglia spelen een cruciale rol in het zenuwstelsel en hun isolatie is essentieel voor het bestuderen van hun functies.
- Dit protocol helpt belangrijke vragen te beantwoorden over microgliaal gedrag en hun interacties met andere celtypen.
- Microglia met hoge zuiverheid zijn vitaal voor nauwkeurige experimentele resultaten in neurologisch onderzoek.
- Het protocol minimaliseert de behoefte aan verlengde kweektijden, waardoor de onmiddellijke gebruik van vers geïsoleerde cellen mogelijk wordt.
Doel van de studie
- Om een robuust protocol te ontwikkelen voor de isolatie van pure microgliale cellen uit knaagdierdierenhersenen.
- Om het begrip van de rol van microglia in neuro-inflammatie en andere neurologische aandoeningen te verbeteren.
- Om downstream-toepassingen zoals geneesmiddelenscreening en immunomodulatiestudies mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Ex vivo isolatie van hersenweefsel gevolgd door mechanische en enzymatische vertering.
- Het biologische model bestaat uit muizenhersenen voor microgliale isolatie.
- Methoden omvatten dichtheidsgradiëntcentrifugatie en magnetische scheiding.
- Belangrijke stappen omvatten zorgvuldige weefselbehandeling en specifieke incubatiecondities om hoge celviabiliteit te garanderen.
- Hoge precisietechnieken voor het isoleren en karakteriseren van cellen werden gedurende het hele protocol benadrukt.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol levert met succes een hoge zuiverheid populatie van microglia op die klaar is voor analyse.
- Geïsoleerde microglia kunnen voor verschillende assays worden gebruikt, waardoor inzichten worden verkregen in hun functionele eigenschappen en reacties.
- De methode biedt snelle toegang tot vers geïsoleerde cellen, wat cruciaal is voor onmiddellijke experimentele behoeften.
- De robuustheid van het protocol werd benadrukt, wat reproduceerbare en betrouwbare resultaten garandeert in verschillende experimenten.
Conclusies
- Deze studie stelt onderzoekers in staat om gemakkelijk microgliale cellen te isoleren, waardoor een dieper begrip van hun rol in gezondheid en ziekte wordt mogelijk gemaakt.
- De beschreven technieken vormen een basis voor verdere exploratie van neuro-inflammatoire processen en bijbehorende therapieën.
- Inzichten verkregen uit deze methode kunnen de kennis over microgliale functies en hun implicaties in neurologisch onderzoek bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid isolation and characterization of primary mouse microglia enables high-fidelity modeling of neuroinflammatory mechanisms in early discovery and preclinical research. This protocol delivers high-purity microglial populations without extended culture, supporting robust target validation and functional screening in CNS drug discovery. The approach enhances predictive confidence for neuroimmune modulation strategies and accelerates translational insights into neurodegenerative and neurodevelopmental disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial activation states and polarization in disease-relevant contexts.
- Supports mechanistic de-risking by providing primary cells for functional assays and pathway analysis.
- Facilitates rapid hypothesis testing on microglial responses to candidate therapeutics or environmental stimuli.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for quantitative in vitro assays, including drug screening and immunomodulation studies.
- Reduces variability and artifacts associated with prolonged culture, improving assay reproducibility and standardization.
- Enables scalable preparation of microglial samples for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for neuroinflammation, perinatal brain injury, and neurodegeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional and phenotypic characterization of microglia.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers and therapeutic modulation of microglial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-purity microglia for target validation, mechanistic studies, and functional screening.
- Discovery Biology: Delivers primary microglia for hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways and cell-type specific responses.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and immunomodulatory profiling.
- Analytics: Enables robust measurement of cell viability, apoptosis, and functional phenotypes post-stimulation.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for neuroinflammatory and neurodegenerative conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for microglial isolation applicable across CNS research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and functional de-risking.
- Operational Value: Streamlines microglial preparation, reducing time and resource requirements for assay development.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reproducible functional data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS programs targeting microglial modulation.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in tissue dissection, density gradient centrifugation, and magnetic cell separation.
- Demands access to specialized instrumentation for gradient preparation and cell sorting.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for different species or developmental stages.
- Yield and purity are sensitive to procedural precision, particularly during gradient layering and cell collection.
