Name: Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer de techniek voor het isoleren van mediastinale lymfeklieren bij muizen na injectie van immunostimulerende nanomaterialen. Deze methode onderzoekt de activatie van lymfoïde dendritische cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door creatieve materialen ontdekking programma via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomst Planning (NRF-2017M3D1A1039421) en mariene biotechnologie-programma gefinancierd door de Ministerie van oceanen en visserij, Republiek Korea en een grant (20150220).

Alle experimentele procedures, met inbegrip van dierlijke behandeling, offer en orgel isolatie werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de regels van de internationale Animal Care en gebruik Comité bij Shanghai volksgezondheid klinische Center en Asan Medical Center. Het studie-protocol is goedgekeurd door de respectieve commissies op de ethiek van dier experimenten op Shanghai volksgezondheid klinische Center (muis protocolnummer: SYXK-2010-0098) en Asan Medical Center (2016-02-168).
1. bereiding van materiaal
Opmerking: Een nano-adjuvans, INP, bestaat uit een drager van zelf geassembleerde lipide-DNA, namelijk U4T, en apr-motief met oligonucleotide, eCpG, was werkzaam in de huidige studie voor het testen van de route van de passende injectie voor immunotherapie en vaccinatie in muizen2 . Nog belangrijker is, andere potentiële therapeutische moleculen zoals antigenen en antistoffen adjuvans agenten kunnen worden vervangen voor INP en getest met behulp van dezelfde methode die hieronder worden beschreven.
<ol><li>INP formulering,2,,4,7<ol>
<li>Gloeien U4T (160 µM, vervoerder) met eCpG (80 µM, met een opeenvolging van de agonist TLR9) in aanwezigheid van 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) en MgCl2 (2 mM). De standaard volume voor gloeien is tussen de 50 en 110 µL in een PCR-buis. Verwarm het mengsel tot 95 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens langzaam afkoelen (1 ° C/16 min) tot 25 ° C, met behulp van een thermocycler. De onthardende protocol vereist ongeveer 2 h. Let op: De U4T-bevattende vloeistof is zeer schuimende en moet zorgvuldig worden behandeld.</li>
		<li>Maken van 50 µL aliquots van het INP-preparaat; gebruik 50 µL van het materiaal voor elke injectie. Opmerking: In het geval van 100 µL per injectie, herhaal stap 1.1 met juiste berekening van de ingrediënten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. algemene dier Procedures
Opmerking: Alternatieve methoden voor de behandeling van de muizen kunnen afhankelijk van de vereisten van het laboratorium en de goedgekeurde dierlijke protocollen8worden gebruikt. Het type van muizen gebruikt is 6-week-oude C57BL/6 en vrouwelijke muizen.
<ol><li>Materiaallijst<ol>
<li>De vloeibare verdoving (Isofluraan), verdoving machine, kooldioxide (CO2) inademing chamber, gesteriliseerd gaas, pincet, muis afdekking, handschoenen, verslaafd pincet, 1-inch ontleden schaar, 2-inch ontleden schaar, alcohol voor te bereiden sterilisatie, en insuline spuiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inhalant anesthesie Opmerking: Anesthesie is verplicht voor intranasale, subcutane, struikrover, en intraveneuze injecties van muizen9. Een inductie-kamer met een vaporizer-machine en zuurstof-tank aangesloten wordt gebruikt voor deze procedure.<ol>
<li>Plaats het dier in de kamer van de inductie en zorg ervoor dat strak sluit het deksel.</li>
		<li>Stromen van de zuurstof op 1 L/min en de vaporisator instellen op een niveau van de inductie van 4% voor Isofluraan.</li>
		<li>Variëren de belichtingstijd van dieren in de kamer afhankelijk van dierlijke gewicht; echter, meer dan 10 s van blootstelling en het toezicht op elke 5 min voor anesthesie10noodzakelijk is. Opmerking: Geen pedaal reflex geeft succesvolle anesthesie.</li>
		<li>Uitschakelen van de spoel Isofluraan en stromen van 1 L/min. van zuurstof om te voorkomen dat personeel Isofluraan gas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Offer<ol>
<li>Voorbereiden op een kamer CO2 inademing offer volgens de NIH "richtsnoeren voor euthanasie van knaagdieren met behulp van kooldioxide"11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test gag reactie om te bevestigen dat het dier volledig wordt opgeofferd.<ol>
<li>Controleer of dat de muis correct wordt opgeofferd door knijpen op het uiteinde van de voet en de bevestiging van geen grap-reactie. Als er een reactie, herhaal stap 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfectie<ol>
<li>Desinfecteer alle oppervlaktes gebruikt voor injecties of dissecties met alcohol spray en gesteriliseerd gaas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orgel-opslag<ol>
<li>Gebruik pincet te verwijderen alle vet en bloed rond de geoogste organen. Deze geoogste weefsels individueel opslaan in een petrischaal gevuld met 3 mL PBS. De container en de media kunnen verschillen afhankelijk van de vereisten van de vervolgprocedure.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. injectie Routes
<ol><li>Gebruik de zes injectie methoden te onderzoeken van injectie-afhankelijke immuunrespons: orale, subcutane, intranasale struikrover, intraperitoneaal, en intraveneuze8,12,13.</li>
</ol>4. isolatie van lymfklieren en de milt
Opmerking: Gebruik jong en gezond mager muizen (6 weken oud) voor deze procedures, omdat de vetten die meestal opgebouwd rond de lymfklieren in oudere muizen moeilijk te zijn verwijderen en kunnen voorkomen dat goede visualisatie van het orgel.
<ol><li>Vooraf oogsten stappen Opmerking: Deze sectie beschrijft het na injectie oogsten van de iLN, milt en mLN van muizen voor het analyseren van immuun stimulatie. Verwijzen naar stappen 2.3-2.5 voor offer, gag respons, en ontsmetting methoden.<ol>
<li>De ledematen van de muis op het bord van de chirurgische schuim PIN en steriliseren van de ventrale zijde van de muis met 70% ethanol.</li>
		<li>Kies een locatie 2 cm boven de schaamstreek en gebruik verslaafd Tang te trekken van de buitenhuid cover zoals een tent. Maken van een vermindering van ongeveer 1 cm op deze locatie en schuif de schaar (2-inch) onder de huid, waardoor verdere dissectie bezuinigingen.</li>
		<li>Voor de omhulling, snijden verticaal door de buitenhuid met beide takken van de schaar (2-inch). De inwendige organen bedekt met buikvlies bloot.</li>
		<li>PIN de buitenste laag van de huid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolatie van de inguïnale lymfeklieren (iLN)
	<ol>
<li>Zoek de iLN aan de linker kant van het been na de combinatie van het bloedvat naar beneden het linker been, die wordt weergegeven als een gekantelde letter 'Y'. Opmerking: Voor subcutaan ingespoten muizen, kiest u een iLN op dezelfde kant van de locatie van de injectie.</li>
		<li>Ontdek de laag met twee pincet te rippen van de overdekte lipide-laag en de oogst van de bleke geel iLN (Boon vorm, 2 mm). Zie stap 2.6 voor latere bewerking en opslag van het weefsel wordt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolatie van de milt 14<ol>
<li>Maak een tent in het midden van het buikvlies via verslaafd pincet in de ene hand en gebruik kleine dun schaar (1 inch) in de andere hand te snijden het buikvlies.</li>
		<li>Gebruik verslaafd pincet in de linkerhand wegknipt het over te vinden van de rode bean-achtige milt (lengte van ongeveer 14 mm) gekoppeld aan de linker bovenzijde van de buik van de muis te begrijpen van de darm.</li>
		<li>Trek voorzichtig uit de milt met een andere set van pincet in de rechterhand terwijl het loskoppelen van andere organen met het verslaafd pincet. Volg stap 2.6 voor het opslaan van de milt. Opmerking: Zorg is vereist bij het verzamelen van de milt, zoals het is een gemakkelijk beschadigd zachte orgaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolatie van de mediastinale lymfeklieren (milj.) Opmerking: De mLN is ongeveer 1 cm onder de ribben gelegen en is verzekerd door andere organen zoals het hart en de longen. Vanwege de locatie en de kleine grootte is het belangrijk om zorgvuldig de omgeving met behulp van Tang en schaar (1-inch) bloot te stellen.<ol>
<li>Knip het middenrif en het loskoppelen van de ribben. Houd het lichaam van de ribben met een tang en snijd vervolgens de linker- en rechterzijde van de ribben met een schaar (1 inch). PIN de cutoff ribben over de schouder van de muis op het recht op het blootstellen van het hart en de longen. Opmerking: Wees voorzichtig niet te knippen om het even welk van de bloedvaten rond het hart en de longen, zoals lekken van bloed maakt het erg moeilijk om te vinden van de kleine doorschijnend mLN. Als bloedvaten zijn afgesneden, zachtjes absorberen het bloed in het gebied met gaas.</li>
		<li>Met behulp van verslaafd pincet in de rechterhand, spiegelen het hart en de longen zachtjes naar rechts totdat de ruggengraat wordt blootgesteld. Gebruik een paar normale pincet in de linkerhand te verwijderen van de iLN met de verslaafd pincet in de rechterhand om te helpen met deze oogsten.</li>
		<li>Pak de longen en spiegelen ze totdat de ruggengraat wijd wordt blootgesteld. De mLN (een doorschijnend boonvormige structuur van ongeveer 2 mm groot) is gelegen tussen de longen en de wervelkolom.</li>
		<li>Gebruik maken van de verslaafd verlostang om het gebied rond de mLN bloot te stellen en de andere verlostang uitpakken van het weefsel. Opmerking: De mLN is omgeven door talrijke andere weefsels die zorgvuldig moeten worden verwijderd met een tang vóór oogst.</li>
		<li>Zie stap 2.7 voor instructies over het opslaan van de geoogste mLN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. bereiding van de monsters voor stroom cytometry
Opmerking: Om de activering van DCs in de geoogste iLN, milt en mLN assay, eencellige schorsingen van deze weefsels zijn gekleurd met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen als DC-specifieke markers, co-stimulatory moleculen, en grote histocompatibility complex moleculen en geanalyseerd door stroom cytometry.
<ol><li>
Voorbereiding van eencellige schorsingen: milt
	<ol>
<li>Voeg 5 mL van de verse kweekmedium (CM) in 6-mm cultuur schotel en plaats de monsters op ijs.</li>
		<li>Verwijder van omliggende weefsels van bloed en vet en plaats het weefsel in het deksel van de schotel cultuur.</li>
		<li>Snijd van de weefsels in kleine fragmenten (< 1 mm) met een gebogen schaar. Opschorten van de fragmenten in PBS gevolgd door spinnen omlaag het weefsel met behulp van een centrifuge op 646 × g gedurende 5 minuten en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.</li>
		<li>Opschorten van de monsters weer in 3 mL CM en verteren de fragmenten met 200 µL van oplossing van 2% foetale runderserum (FBS) aangevuld met collagenase IV voor 20 min.</li>
		<li>Voorzichtig schudden en Incubeer het monster bij 37 ° C voor 1 h. filteren de verteerd weefsels via nylon gaas (100 nm) en draai ze naar beneden. Wassen van de afzonderlijke cellen in 5 mL PBS en verwijder de bovendrijvende vloeistof door middel van centrifugeren.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 5 mL cel isoleren oplossing. Re-vracht naar een andere laag van 5 mL cel wissen isolatie-oplossing voor het vormen van een waterige laag-voor-laag stapel.</li>
		<li>Centrifugeer het preparaat van de cel bij 2012 × g voor 10 min. verkrijgen het supernatant, oftewel de lichtere fractie dichtheid (< 1.077 g/cm3), voor latere stroom cytometry analyse.</li>
		<li>Het aantal cellen met een hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van eencellige schorsingen: lymfeklier
	<ol>
<li>Volg stap 5.1.1-5.1.2.</li>
		<li>Voeg 5 mL van de CM met behulp van een pipet 10 mL tot schorsing van de cellen door pipetteren 3 - 4 keer. Na grondig schorsing gebruiken de gewenste cellen, steriele nylon gaas voor het filteren van de cellen voor collectie in een conische buis 15 mL.</li>
		<li>Draai de cellen naar beneden bij 646 ×g gedurende 7 minuten bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.</li>
		<li>Voeg een extra 5 mL van CM in 10 mL pipet op te schorten beter de cellen door pipetteren.</li>
		<li>Wassen met PBS en het aantal cellen tellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stroom cytometry analyse
	<ol>
<li>Aliquot 0,5-1 × 106 cellen in elke fluorescentie-activated cell sorting (FACS) buis.</li>
		<li>Centrifugeer bij 646 × g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en het supernatant gecombineerd.</li>
		<li>5 µL van elk verdund fluorescentie-geconjugeerde antilichaam voorbereiding aan de cellen resuspendeer de pellet van de cel en de vortex toevoegen. Opmerking: Het is belangrijk dat de cel pellet van lichte blootstelling zoveel mogelijk beschermen omdat fluorescently gelabelde antilichamen lichtgevoelig zijn. Genereren van een antilichaam master mix en altijd Fc blok toevoegen.</li>
		<li>Bereiden FACS buffer met behulp van 100 µL van PBS, 1% van de warmte-geïnactiveerd regelmatige FBS en 0,1% natriumazide.</li>
		<li>Leg het monster in de buis bij 4 ° C gedurende 30 min. spoelen de cellen met 2-4 mL FACS buffer en Centrifugeer het monster van 1700 toeren per minuut gedurende 7 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 500 µL van FACS buffer in het donker. Het analyseren van de cellen door stroom cytometry.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
<li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li>
<li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.7b00440">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li>
<li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li>
<li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li>
<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://staff.unimelb.edu.au/__data/assets/pdf_file/0009/1974339/STANDARD-Anaesthesia-for-mice-and-rats-FINAL.pdf">General anesthesia of mice and rats</a>. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nri1669">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Veel vooruitgang in nanotechnologie en immunologie hebben bereikt door middel van therapeutische onderzoek voor drug delivery en immunostimulation. Zorgvuldige selectie van de injectie-methode is bekend als belangrijk voor immunostimulation, die was de focus van de huidige studie.
Verschillende injectie routes werden geëvalueerd voor een natuurlijk niet-giftige en biologisch afbreekbare op basis van DNA materiaal, INP (immunostimulerende nanoparticle), om te bepalen welke route het beste resul...

Immunologie en nanomaterialen vooruitgang hebben geleid tot een overvloed aan potentiële nieuwe therapeutische strategieën voor toepassingen in biologie, met inbegrip van de drug delivery en immunostimulation. Optimalisatie van de route van de administratie is een essentieel element beïnvloeden de effectiviteit van immunostimulerende agenten. Een immunostimulerende nanoparticle (INP) bestaande uit DNA is een nieuw ontwikkelde nano-immuun adjuvans zelf geassembleerd door microphase scheiding vanwege de amfifiele structuur van lipide-DNA1. Daarom, protocollen voor INP met betrekking tot beheer van de materiële1 in vivo via verschillende routes en drie procedures voor oogsten van passende weefsels zoals de inguïnale lymfeklieren (iLN), mediastinale LN (milj.), en de milt, zijn beschreven. Ten slotte, deze weefsels werden geanalyseerd voor dendritische cellen (DC) activeren, de meest krachtige presentatie van antigeen cellen in het immuunsysteem. Dit protocol kan ook worden toegepast voor de beoordeling van de antigenen, antilichamen of andere immuun hulpstoffen2.
We testten de INP formulering, want het is een agent die heeft aangetoond grote belofte. INP is een Toll-like receptor 9 (TLR9) adjuvante materiaal dat bevat van nucleïnezuren, voor welke beoordeling van immunostimulation doeltreffendheid vereist is om te testen verschillende injectie methoden3. In dit verband is de stimulatie van DCs een potente eindpunt voor in vivo evaluatie. Nadat het antigeen of immunostimulerende moleculen zijn in de perifere weefsels of bloed door DCs phagocytosed, migreren deze cellen naar lymfoïde organen zoals de milt en de LNs4,5. Dus, DC activering werd geanalyseerd in de milt, iLN en mLN van de geïnjecteerde dieren. Goed oogsten van deze weefsels is daarom ook belangrijk voor de evaluatie van de immuunrespons op een roman adjuvante of ziekteverwekkers5. Dergelijke weefsel oogsten is ook belangrijk voor de ontwikkeling van een nieuwe immunologische methodologie als een kankertherapie. Bovendien, dit protocol kan worden gebruikt om te controleren of de efficiëntie van andere drugs, zoals anti-menselijke immunodeficiency virus therapeutics6.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfaat bufferoplossing zout</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td>Organen wassen</td></tr><tr><td>(PBS, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>isofluraanoplossing&nbsp;</td><td>Aesica Queenborough limited</td><td>26675-46-7</td><td>Anesthesieproces</td></tr><tr><td>Tuberculin 1mL spuit -</td><td>Junglim</td><td>N/A</td><td>Injectie</td></tr><tr><td>50 mL conische buis&nbsp;</td><td>S.P.L</td><td>50050</td><td>Anesthesieproces</td></tr><tr><td>1mL Insuline spuit&nbsp;</td><td>(BD Ultra-FineTM&shy;II)_korte naald</td><td>324826</td><td>Intramusculaire injectie</td></tr><tr><td>DMEM Hoge Glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30081.01</td><td>Organen opslaan</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>&nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>FACS analyse</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol anhydrisch 99,5 %&nbsp;</td><td>Daejung</td><td>4022-4110</td><td>Ontsmettingsmiddel</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100 (Thermocycler)</td><td>Ssufine</td><td>-</td><td>Anealing</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>FACS buis&nbsp;</td><td>FALCON</td><td>2052</td><td>FACS analyse</td></tr><tr><td>Geautomatiseerde hoge prestatie flowcytometer</td><td>BD (USA), FACSVerse</td><td>-</td><td>FACS analyse</td></tr></tbody></table>

immunostimulerende agent evaluatie: lymfoïde weefsel extractie en injectie route-afhankelijke dendritische cel activeren

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Voor de evaluatie van een nieuwe therapeutische agent voor immunotherapie of vaccinatie is analyse van immuun cel activatie in het lymfatische weefsel essentieel. Hier, we onderzochten immunologische effecten van een immunostimulant roman lipide-DNA in nanoparticle vorm van beheer van de verschillende routes in de muis: orale, subcutane, intranasale struikrover, intraperitoneaal en intraveneuze. Deze injecties zal direct invloed uitoefenen op de immuunrespons en oogsten van lymfatische weefsels en analyse van de activering van dendritische cellen (DC) in de weefsels zijn cruciale onderdelen van deze evaluaties. De winning van mediastinale lymfklieren (mLNs) is belangrijk maar vrij complex vanwege de grootte en de locatie van dit orgel. Een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van de inguïnale lymfeklieren (iLN), de mLN, en de milt en het analyseren van DC activering door stroom cytometry wordt beschreven.

Om te beoordelen van passende injectie routes van INP voor lymfatische weefsel DC activering, de DC-bevolking als geslacht werd gedefinieerd als -CD11c+ cellen in de milt, iLN en mLN en de niveaus van de expressie van co-stimulatory moleculen geanalyseerd. Behandeling van INP door onderhuidse (sc) en intraveneuze (IV) injectie bevorderd aanzienlijke stijgingen van de interactie CD40 CD80 en CD86 uitdrukking in de milt en iLN DCs (<strong class="xfig...

Experimentele procedures voor de verdere winning van lymfatische weefsels voor het testen van lymfoïde dendritische cel activatie worden beschreven na behandeling van een immuniteitsverhoging nanomateriaal.

Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Het algemene doel van deze procedure is om de unieke techniek die nodig is bij het isoleren van mediastinale lymfeklier van muizen vertrouwd te maken. De operatie werd uitgevoerd na het injecteren van immunostimulant materiaal op zes verschillende routes bij muizen. In deze studie gebruikten we een nieuwe klasse van materiaalvormende nano-sized structuren.Oppervlakteactieve stoffen bestaan uit hydrofiele kopgroep en hydrofobe staart. Die vormen bolvormige micelle of andere secundaire structuur als gevolg van microfaag scheiding. We gebruikten deze eigenschap om een bio macromolecule dat is DNA.DNA amphiphile, hier getoond, als regelmatige nucleotiden zoals A, C, G, T, heeft hydrofiele blokken, terwijl lipide gemodificeerde neuro-cel nucleobases fungeren als de hydrofobe eenheden. De gemodificeerde oligo werd gesynthetiseerd door DNA synthesizer in grootschalige octogrammen. In equi-media vormen de amphifiele lipide NC's spontaan nano-sferische micelles.Wanneer micelle wordt gevormd, blijft het DNA enkelstrengs als een lege drager met een diameter van ongeveer 10 nanometer. Om de drager uit te rusten met immuun-stimulerend middel, is het eenvoudige kwestie van het uitbreiden van de DNA-sequentie met tol-achtige receptor negen adjuvans namelijk eCpG. Lipide DNA en eCpG basis hier daarom wordt de buitenoppervlakte van micelle afgebroken met CpG opeenvolging.We noemen dit immuunstimulerende Nano deeltje dan als het INP. Om de juiste manier van INP's voor immuunrespons te bepalen, injecteerden we INP's naar muizen in 64 injectieroutes en bijgevolg werd een goed lymfeklierweefsel geanalyseerd. Voor meer gedetailleerde injectie instructie vindt u een JOB artikel gepubliceerd door Charles River in 2012.Het belangrijkste voordeel van deze video is visueel laten zien hoe mediastinale lymfeklier te verkrijgen. De video toont expliciet de locatie van mediastinale lymfeklier die veel mensen moeilijk vinden bij het isoleren van de organen. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee in het Shanghai Public Health Clinical Center, of University of Ulsan College of Medicine.Dit deel toont de specifieke locatie van organen of weefsels, die cruciaal zijn voor immunologische analyse. Milt en twee lymfeklieren worden geïsoleerd. Allereerst werden muizen opgeofferd door de inademing van kooldioxide euthanasie en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren als gevolg van de begeleiding van Institutional Animal Care and Use Committee.Laten we vanaf nu de organen vinden en isoleren. Bevestig eerst de muis goed op het bedieningsbureau met vier pinnen op de palm van de muis. Steriliseer het dissectiegebied met alcohol.Ontleden de buitenste dekking van de onderkant van de muis buik met een grote sized schaar. Gebruik tangen om de beide zijden van de bevestiging te openen en te repareren met pinnen op de operatietafel. De locatie van inguinale lymfeklier wordt blootgesteld door het vinden van de combinatie van het vat naar beneden in de richting van het linkerbeen.De vorm van het vat ziet eruit als gekantelde alfabet letter Y.Ontdek de laag met de tangen en trek het uit de huid. Snijd het buikvlies met een kleinere schaar om inwendige organen bloot te leggen. Verplaats de darm naar rechts met behulp van tangen wikkel dan in de vorm van milt, die laten zien aan de linkerkant, linkerbovenzijde van de buik.Extra aandacht is vereist tijdens de procedure, omdat milt is gemakkelijk te verstoren. Tot slot het belangrijkste punt van deze video: het oogsten van mediastinale lymfeklier. Het is gelegen onder de bovenkant van de long, die moeilijk te zien is vanwege de kleine omvang en enigszins verborgen locatie.Voorzichtig bloot het gebied met behulp van kleine schaar en tangen. Snijd beide zijden van de ribben en het middenrif ook. Knip de afgesneden ribben boven de borst.Tijdens de procedure voorkomen dat schadelijke hart en bloedvaten, omdat het de site zou kunnen verblinden, het vinden van de doorschijnende mediastinale lymfeklier. Als per ongeluk het bloedvat barstte, veeg dan voorzichtig het bloed met gaas uit. Pak de linkerkant van de long en draai het zachtjes naar de andere kant om onder de long te zien.Trek de mediastinale lymfeklier op met tangen. Na het oogsten van de mediastinale lymfeklier, zorg ervoor dat perfect verwijderen van al het vet en bloed rond de lymfeklier, omdat ongewenst weefsel kan de analyse beïnvloeden. Tot slot, alle geïsoleerde organen op een petrischaal gevuld met media.Totaal 0.1 keer 10 tot de zesde cellen werden geanalyseerd op deze stroom cytometrie. Op basis van kracht getter en grootte getter leukocyte bevolking werd gated en dat cellen werden uitgesloten door donkere vlekken. 24 uur na inp-injectie door 64 injectieroutes werden milt, inguinale lymfeklier en mediastinale lymfeklier geoogst en geanalyseerd dc-activering door stroomcytometrie.Gebaseerd op de strategie van flow cytometrie DC populatie werd gedefinieerd als CD11C positieve en afstamming negatieve cellen in de live leukocyte. Met name de intranasale injectie van INP bevorderde een aanzienlijke toename van de CD40, 80, 86 expressie in de mediastinale lymfeklier in vergelijking met PBS voor de controle. Daarom suggereerde deze gegevens dat intranasale injectie van INP kan worden gebruikt als slijmvlies adjuvans voor verbetering van de immuniteit in de longen.

immunostimulatory-agent-evaluation-lymphoid-tissue-extraction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a method of converting dendritic cells (DCs) to tolerogenic DCs (TolDCs) using an immunomodulatory pharmacological agent. This conversion is confirmed by evaluating the TolDC function through their immunosuppressive effect on CD4+ T cells.

Effect of an Immunomodulatory Pharmacological Agent on the Interaction Between Dendritic Cells and CD4+ T Cells

De meest gebruikte methode voor het genereren van grote aantallen autologe dendritische cellen (DCs) voor gebruik bij tumor immunotherapie beschreven. De methode maakt gebruik van IL-4 en GM-CSF om DCs te onderscheiden van monocyten. De onrijpe DCs worden gestimuleerd om te rijpen en daarna beladen met antigenen voordat ze geïnjecteerd terug in de patiënt.

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

Profylactische en therapeutische vaccinatie vaak niet sterke immuunrespons stimuleren door week afvoer van het vaccin knooppunten en daardoor slechte medewerking van immuuncellen lymfe. Door directe injectie van vaccin lymfeklieren, zogenaamde intralymfatische injectie vaccindoeltreffendheid sterk worden verbeterd en vaccindoses worden verminderd.

Intralymfatische Immunotherapie en Vaccinatie in Muizen

Immature dendritische cellen kunnen selectief worden gedifferentieerd in tolerogeen of rijpe dendritische cellen om het evenwicht tussen immuniteit en tolerantie te reguleren. Dit werk presenteert een manier om vanuit onrijpe, uit monocyten afgeleide dendritische cellen (moDC's) in vitro tolerogeen en rijpe moDC's te genereren die verschillen in metabolische fenotypen.

Generatie van onrijpe, Ouder en tolerogene dendritische cellen met verschillende Metabolic Phenotypes

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Wij presenteren hier een aanvraag voor een standaard immunologische techniek (CFSE gekleurd OT-ik proliferatie) willen snel controleren adjuvans-gemedieerde cytotoxische T lymfocyten (CTL) generatie in vivo. Deze snelle inschatting van CTL capaciteiten is nuttig voor de ontwikkeling van profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen, alsmede therapeutische kanker vaccins.

Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

Hier presenteren we een protocol voor de in vivo bepaling van naïeve CD4 T cel (T-cel) activering, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door GM-CSF beenmerg (BM)-afgeleide dendritische cellen (DC's). Dit protocol beschrijft Daarnaast BM en T-cel isolatie, DC generatie en DC en T-cel adoptief overdracht.

Een muismodel In Vivo maatregel naïef CD4 T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door het beenmerg-afgeleide dendritische cellen

De transimmunisatie (TI) apparaat of plaat en aanverwante protocollen zijn ontwikkeld om de belangrijkste kenmerken van extracorporele fotochemo therapie (ECP) te repliceren, in een experimentele setting, waardoor voor de productie van fysiologisch geactiveerd, tunable dendritische cellen (DCs) voor kanker immunotherapie.

Nieuw protocol voor het genereren van fysiologische immunogeen dendritische cellen

De methodologie beschrijft de generatie van van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen (MoDC's) en hun toepassing voor de in vitro evaluatie van antigene kandidaten tijdens de ontwikkeling van potentiële veterinaire vaccins bij runderen.

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

Leer de techniek voor het isoleren van mediastinale lymfeklieren bij muizen na injectie van immunostimulerende nanomaterialen. Deze methode onderzoekt de activatie van lymfoïde dendritische cellen.

Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

Meer video's verkennen