Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen
June 2nd, 2018
Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren multiplexed targeting van versterkers met de deactivering fusieproteïne SID4X-dCas9-KRAB, ook bekend als enhancer interferentie (Enhancer-i). Dit protocol stelt de identificatie van versterkers die regelen van genexpressie en vergemakkelijkt de dissectie van de relaties tussen de versterkers van regulering van een gemeenschappelijk doel-gen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van genomics en genexpressie, zoals hoe meerdere genexpressieregio's, ook bekend als enhancers, samenwerken om transcriptie te controleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere enhancers in de buurt van meerdere verschillende genen tegelijkertijd kunnen worden getest om snel regio's te identificeren die betrokken zijn bij genexpressie. Om te beginnen met het ontwerpen van geleidings-RNA, genereer eerst DNA-sequenties zoals beschreven in het tekstprotocol.
Gebruik een programma zoals E-CRISP op de gegenereerde DNA-sequenties om geleidings-RNA's met lage off-targets te vinden. Geleidings-RNA's bestaan uit 20 nucleotiden stroomopwaarts van een protospacer-aangrenzend motief, dat de vorm NGG aanneemt voor de dCas9 van S.pyogenes. Selecteer op de E-CRISP-website het organisme van interesse via de vervolgkeuzelijst.
De genoomsamenstelling verschijnt rechts van de soortnaam. Selecteer de radioknop Input is FASTA-sequentie. Kopieer de FASTA-sequenties van boven en plak ze in het dialoogvenster.
Zorg ervoor dat voor elke sequentie een FASTA-header is opgenomen. Selecteer de medium-radioknop en Single design in de vervolgkeuzelijst. Klik op de knop Start single gRNA search.
Een nieuwe browsertabblad wordt geopend en de resultaten worden weergegeven. Download de kandidaatsequenties door op de knop te klikken, Download een in Excel geformuleerd tabelrapport voor alle vraagsequenties samen. Gebruik vervolgens de UCSC-genoombrowser om volledige geleidings-RNA-sequenties te BLAT naar het genoom.
Navigeer in een browser naar de website van de UCSC-genoombrowser. Zoek onder de sectie Onze tools het woord BLAT en klik erop. De BLAT-zoektool wordt geopend.
Gebruik de vervolgkeuzemenu's onder de tekst BLAT search genome om het organisme en de genoomsamenstelling van interesse te selecteren. Kopieer de geleidings-RNA-sequenties uit het tabelrapport gegenereerd door E-CRISP en plak ze in het dialoogvenster. Zorg ervoor dat elke sequentie een unieke FASTA-header heeft en klik vervolgens op de knop Versturen onderaan het dialoogvenster.
Op de BLAT-zoekresultatenpagina verschijnen uitlijningen van elke geleidings-RNA-sequentie, waarbij elke regel een uitlijning vertegenwoordigt. Idealiter zou er voor elke geleidings-RNA één uitlijning moeten zijn, wat de uniciteit van die geleidings-RNA aangeeft. Vermijd indien mogelijk geleidings-RNA's die op meerdere locaties in het genoom worden afgebeeld.
Om geleidings-RNA-lokalisatie en -verdeling binnen het gebied van belang te bekijken, klik op de browserlink onder de sectie Acties voor een van de opgevraagde geleidings-RNA's. De genoombrowser verschijnt en wordt gecentreerd op de geselecteerde geleidings-RNA. Gebruik de knoppen voor in- en uitzoomen bovenaan de pagina om de verdeling van andere geleidings-RNA's te visualiseren die door E-CRISP zijn geïdentificeerd binnen het gebied van belang.
Selecteer vier, bij voorkeur niet-overlappende, geleidings-RNA's die over het gebied van belang zijn verdeeld. Als het gebied van belang meer dan 600 basenparen omvat, overweeg dan om één tot twee extra geleidings-RNA's toe te voegen. Vermijd geleidings-RNA's met homopolymere reeksen en extreem GC-gehalte, aangezien deze kenmerken het geleidings-RNA-kloneringproces kunnen belemmeren en de doeltreffendheid van geleidings-RNA-targeting kunnen verminderen.
Reconstitueer geleidings-RNA-oligo's tot een eindconcentratie van 100 micromolar in ultrapuur water. Er moeten ten minste vier afzonderlijke geleidings-RNA-oligo's zijn voor elke regio van belang. Maak voor elke relevante regulatoire regio een pool van alle oligo's die overeenkomen met de regio van belang.
Combineer in een Eppendorf-buis vijf microliter van elk afzonderlijk gereconstitueerd geleidings-RNA-oligo voor elke regio. Meng de pool goed door te vortexen en verwijder vervolgens één microliter en verdun deze eloquat 1-op-200 in ultrapuur water. Voer een korte PCR uit met de USICS-primers om homologiegebieden aan de oligo's te hechten, zoals beschreven in het tekstprotocol.
Er worden ongeveer 40 basen toegevoegd aan elk oligo, waardoor een product van ongeveer 100 basenpaar ontstaat dat voldoende homologie bevat met het USIC-spekter aan beide uiteinden. Stel vervolgens Gibson Assembly-reacties in op ijs in. Gebruik 50 nanogram van de verteerde vector en zeven nanogram van de inzet in een reactie van 20 microliter.
Stel ook een Gibson Assembly-reactie van slechts verteerde vector in met 50 nanogram van de vector en vervang de inzet door water. Incubeer de Gibson Assembly-reacties gedurende 15 minuten bij 50 graden Celsius, gevolgd door een houdtijd bij 4 graden Celsius. Nadat de geassembleerde producten naar ijs zijn overgebracht, verdun ze 1-op-4 in ultrapuur water op ijs.
Voeg bijvoorbeeld vijf microliter Gibson Assembly-product toe aan 15 microliter ultrapuur water. Transformeer vervolgens de verdunde Gibson Assembly-producten. Laat hoge competente cellen op ijs vallen en maak 25 microliter eloquats voor elke transformatie.
Als een complexe pool die meerdere sites target gewenst is, laat dan voldoende cellen in verschillende buizen vallen om meerdere onafhankelijke transformaties uit te voeren. Plateer 50 microliter van de getransformeerde cellen en plaats de platen overnacht in een incubator van 37 graden Celsius. Voor mini-preps van de pools die individuele sites targeten, plaats de cellen direct in drie tot vijf milliliter LB-bouillon met ampicilline of carbencillin.
Incubeer de cellen overnacht met schudden bij 250 rpm en 37 graden Celsius. Gebruik voor grote bibliotheken een platenschraper om alle kolonies van elke individuele plaat in één maxi-prep te verzamelen. Dit kan worden vergemakkelijkt door ongeveer vijf milliliter LB met het juiste antibioticum in een 15 milliliter Falcon-buis te gieten en de kolonies in de buis te schrapen.
De dag voor transfectie plateer de cellen in een 24-wellsplaat bij 30 tot 50%confluency. Plateer voldoende cellen zodat transfecties in duplica
Overzicht
Dit protocol beschrijft het ontwerp en de uitvoering van multiplexed targeting van enhancers met behulp van het SID4X-dCas9-KRAB fusie-eiwit, wat de identificatie van enhancers die genexpressie reguleren, vergemakkelijkt.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genomics
- Genregulatie
- Enhancer Targeting
Achtergrond
- Enhancers zijn cruciale regulerende regio's die transcriptie controleren.
- Het begrijpen van enhancer-interacties is essentieel voor het verduidelijken van genexpressiemechanismen.
- Deze methode maakt gelijktijdige testen van meerdere enhancers mogelijk.
- Guide RNA ontwerp is een cruciale stap in dit protocol.
Doel van het onderzoek
- Het identificeren van enhancers die specifieke doelgenen reguleren.
- Het ontrafelen van de relaties tussen enhancers en genexpressie.
- Het bieden van een methode voor multiplexed enhancer targeting.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen van guide RNA's met behulp van E-CRISP voor lage off-target effecten.
- Het gebruik van UCSC genome browser voor alignering en lokalisatie van guide RNA's.
- Het uitvoeren van Gibson Assembly voor het construeren van plasmiden.
- Het transfecteren van cellen met plasmiden die guide RNA's bevatten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van enhancerregio's betrokken bij genregulatie.
- De mogelijkheid tot multiplexed enhancer targeting is aangetoond.
- Een gestroomlijnd protocol voor guide RNA ontwerp en samenstelling is geleverd.
- Verdere studies naar enhancer-geninteracties zijn vergemakkelijkt.
Conclusies
- Dit protocol maakt efficiënt enhancer targeting mogelijk voor genregulatiestudies.
- Het verhoogt het begrip van complexe genregulerende netwerken.
- Toekomstige toepassingen kunnen therapeutische interventies omvatten die enhancers targeten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding enhancer function is critical for target validation in drug discovery, as enhancers modulate disease-relevant gene expression. The Enhancer-i method enables rapid, multiplexed interrogation of regulatory elements, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery. This approach helps prioritize targets by clarifying which enhancers drive transcriptional responses in disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates enhancer contributions to gene expression, clarifying therapeutic hypothesis validity.
- Operational Value: Enables simultaneous testing of multiple enhancers, accelerating target de-risking.
- Predictive Value: Determines enhancer necessity and combinatorial effects, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of enhancer activity via transcriptional response measurement.
- Operational Value: Uses transient transfection for scalable, reproducible enhancer screening in cell lines.
- Assay Readiness: Produces standardized biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links enhancer function to disease-relevant gene regulation in human cell models.
- Mechanistic De-risking: Identifies non-contributing enhancers, reducing ambiguity in target modulation strategies.
- Preclinical Alignment: Supports biomarker-ready models by defining functional regulatory elements.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, enabling enhancer validation before assay development and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-gene relationships and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantifiable transcriptional outputs for compound testing.
- Analytics: Provides enhancer activity measurements that inform dose-response and target engagement studies.
- Translational Research: Connects enhancer modulation to phenotypic outcomes in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for enhancer screening across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by defining enhancer necessity and combinatorial logic.
- Operational Value: Offers standardized, transient enhancer modulation compatible with high-throughput workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on enhancer-driven expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in guide RNA design and CRISPR-based modulation techniques.
- Dependent on transfection efficiency and access to molecular cloning infrastructure (e.g., Gibson Assembly).
- Needs cross-team standardization for guide RNA validation and off-target assessment.
- Adaptable to various cell lines, though optimization may be needed for primary or hard-to-transfect systems.
- Limited to transcriptional readouts; requires integration with orthogonal assays for functional validation.
