Name: Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer multiplex CRISPR-gebaseerde enhancer-inmenging in cellijnen om genregulatie te bestuderen. Deze methode maakt gelijktijdige targeting van meerdere enhancers mogelijk voor snelle identificatie van regulerende regio's.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de NIH/NHGRI R00 HG006922 en NIH/NHGRI R01 HG008974 aan J.G. en de jager Cancer Institute. J.B.C. werd gesteund door de NIH trainingsprogramma in genetica T32GM007464.

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadow+enhancers+foster+robustness+of+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation.</a> Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).</li>
<li>Lam, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+redundant+enhancers+cooperatively+maintain+Mammalian+pomc+expression+above+a+critical+functional+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold.</a> PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Savic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-distal+RNA+polymerase+II+binding+discriminates+active+from+inactive+CCAAT%2F+enhancer-binding+protein+beta+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites.</a> Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Hilton, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+editing+by+a+CRISPR-Cas9-based+acetyltransferase+activates+genes+from+promoters+and+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.</a> Nat Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Kearns, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+native+enhancers+with+a+Cas9-histone+demethylase+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion.</a> Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Groner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAB-zinc+finger+proteins+and+KAP1+can+mediate+long-range+transcriptional+repression+through+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading.</a> PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Fulco, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+functional+enhancer-promoter+connections+with+CRISPR+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference.</a> Science. 354 (6313), 769-773 (2016).</li>
<li>Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li>
<li>Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Engineering+and+Analysis+of+Combinatorial+Enhancer+Activity+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells.</a> Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).</li>
<li>Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Enhancer+Interference+Reveals+Collaborative+Control+of+Gene+Regulation+by+Estrogen+Receptor+alpha-Bound+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers.</a> Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad+proteins+contain+a+dominant+transcription+repression+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mad proteins contain a dominant transcription repression domain.</a> Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).</li>
<li>Alland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+N-CoR+and+histone+deacetylase+in+Sin3-mediated+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression.</a> Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li>
<li>Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+repression+of+AXIN2+and+MYC+gene+expression+using+designer+TALEs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).</li>
<li>Stampfel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+form+diverse+groups+with+context-dependent+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions.</a> Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li>
<li>Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Inducible+CRISPR-dCas9-KRAB+Effector+System+to+Dissect+Transcriptional+Regulation+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).</li>
<li>Romanienko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vector+with+a+Single+Promoter+for+In+Vitro+Transcription+and+Mammalian+Cell+Expression+of+CRISPR+gRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs.</a> PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).</li>
<li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+RNAi+and+CRISPR+technologies+by+large-scale+gene+expression+profiling+in+the+Connectivity+Map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map.</a> PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>O'Geen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCas9-based+epigenome+editing+suggests+acquisition+of+histone+methylation+is+not+sufficient+for+target+gene+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression.</a> Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en flexibele methode voor het ontleden van versterker functie op de endogene genomic locus zonder te fysiek veranderen de opeenvolging van DNA. Terwijl gelijkaardig in concept aan de eerder gepubliceerde CRISPR interferentie protocollen met behulp van dCas9-KRAB27, verschilt Enhancer-i op 3 belangrijkste punten van deze protocollen. Eerst, Enhancer-i maakt gebruik van het domein SIN3A interactie van MAD120 tot deactivering van de versterker. Versterker deactivering kan worden gered met behulp van HDAC-remmers, suggereert dat het primaire mechanisme van deactivering HDAC afhankelijk is. In tegenstelling tot de interferentie van de CRISPR met dCas9-KRAB leidt Enhancer-i niet tot de afzetting van H3K9me3. Dit is waarschijnlijk vanwege het feit dat Enhancer-i is afhankelijk van de tijdelijke invoering van gids RNAs, met de cellen worden geoogst op 3 dagen transfectie post. In CRISPR de storing, wordt een toename van de H3K9me3 waargenomen op 7 dagen post transductie12. Tot slot biedt het Enhancer-i-protocol een strategie om te richten op meerdere sites tegelijk en bewaken van de efficiëntie van targeting. DCas9-KRAB wordt gebruikt tegelijkertijd richten op meerdere versterkers in mozaïek-seq17, maar deze techniek is afhankelijk van eencellige RNA sequencing om expressie veranderingen te identificeren, en vele genen (zoals oestrogeen-responsief genen) onopgemerkt blijven als gevolg van de lage gevoeligheid van eencellige RNA-seq. Enhancer-i biedt een betrouwbare methode om te studeren versterkers afzonderlijk en in combinatie voor elke gen.
De meest kritische stap van Enhancer-i is transfectie, die moet worden geoptimaliseerd voor de cellijn van belang. Dit protocol is gebaseerd op puromycin behandeling te verrijken voor transfected cellen, maar het is mogelijk dat mede transfecting gids RNAs met een fluorescente proteïne en sorteren voor fluorescerende cellen met behulp van stroom cytometry kan blijken te zijn een betere methode voor verrijking voor sommige cel typen. Het is raadzaam om toezicht op het niveau van de expressie van gids RNAs en SID4x-dCas9-KRAB door qPCR oplossen en bevestigen van transfectie. Als RNA richtniveaus laag zijn (cyclus drempel > 30), gebruikers kunnen ook overwegen alternatieve gids RNA productiestrategieën zoals in vitro transcriptie28. Het is ook mogelijk dat ondanks de hoge gRNA niveaus, gids RNA richten van het eiwit SID4x-dCas9-KRAB is inefficiënt, in welk geval selecteren verschillende begeleiden RNA-sequenties kunnen het nodig zijn. Door het uitvoeren van ChIP-seq op de fusieproteïne met chromatine uit Enhancer-i behandeld cellen, kan de efficiëntie van targeting worden gecontroleerd. Als er hoog signaal van SID4x-dCas9-KRAB in de regio van belang is, en geen expressie veranderingen in haar vermeende target-gen zijn waargenomen, dan bijdraagt de regio waarschijnlijk niet tot de uitdrukking van dit gen onder de voorwaarden die studeerde.
Een mogelijke beperking van Enhancer-i is dat af-target effecten zich ophopen kunnen als te veel sites tegelijkertijd zijn gericht. Toch hebben CRISPR interferentie strategieën voor knockdown minder af target effecten dan RNAi29, met name wanneer een polyclonal cellijn uiting van dCas9-KRAB wordt gebruikt. Terwijl we hebben gezien de genomic bindende uit-target van SID4X-dCas9-KRAB bij het uitstippelen van 10 sites tegelijk, hebben we gen expressie veranderingen als gevolg van deze bindende gebeurtenissen niet geïdentificeerd. Zoals sommige versterkers kunnen contact opnemen met meerdere initiatiefnemers en/of andere versterkers, is het mogelijk dat vele genen expressie op het richten van een interne versterker, veranderen kunnen, maar het is onduidelijk of deze vorm van genexpressie gemeenschappelijk is. Om te bevestigen dat de expressie veranderingen waargenomen zijn te wijten aan gericht op een specifieke versterker, en niet uit-target effecten, kunnen gebruikers Enhancer-i uitvoeren met twee verschillende sets van niet-overlappende gids RNAs gericht op hetzelfde gebied. Daarnaast kan de genetische schrapping van de regio met behulp van de nuclease-bevoegde Cas9 verder te bevestigen de effecten ervan op de genexpressie.
Als Enhancer-i functies door Histon deacetylation, is het mogelijk dat de deactivering capaciteiten beperkt zijn tot versterkers die aanzienlijke niveaus van Histon acetylation hebben. Er zijn een verscheidenheid van alternatieve repressieve fusies die meer effectief op gericht op specifieke versterkers kan zijn. DNA methyltransferase fusies te dCas9 kunnen worden gebruikt voor het verminderen van genexpressie wanneer gericht op de versterkers van de distale30, maar deze repressie is vaak niet van voorbijgaande aard. Een andere repressieve fusion gebruikt het domein van de vriend van GATA1 (FOG1), die leidt tot Histon H3 lysine 27 trimethylation en verdringt genexpressie op niveaus die vergelijkbaar is met dCas9-KRAB over een verscheidenheid van cel lijnen en initiatiefnemers31. Interessant, verminderd toe te voegen meer kopieën van FOG1 aan dCas9 het repressieve potentieel aan initiatiefnemers, suggereren dat één exemplaar van het domein-SID meer enhancer deactivering dan de 4 exemplaren die momenteel worden gebruikt in Enhancer-i kan leveren. Het is mogelijk dat sommige loci profiteren kunnen van de dual richten door verschillende combinaties van de bovenstaande dCas9 fusies. Stabiel op lange termijn onderdrukking kan bijvoorbeeld worden bereikt door gelijktijdige transductie van dCas9-DNMT3a en dCas9-KRAB32. De meeste van deze repressieve fusies hebben alleen is gericht op een interne locus tegelijk, en blijft het onduidelijk welke is het meest effectief in het manipuleren van meerdere versterkers gelijktijdig.
Versterker-i, terwijl een geschikte methode voor het bestuderen van combinaties van versterkers voor een handvol genen, is nog enigszins beperkt in doorvoer, als de gebruiker wenst te studeren putatief versterkers voor honderden genen. Toekomstige toepassingen van deze techniek zal imaging gebaseerde technologieën om te kwantificeren van meerdere genen in meerdere monsters tegelijk opnemen. Nog belangrijker is, zijn deze technologieën compatibel met directe detectie van molecules van RNA van lysate, eliminerend de behoefte aan tijdrovende RNA isolatie. Deze aanpassingen vergemakkelijkt de ondervraging van grotere soorten versterkers.

Grootschalige projecten zoals ENCODE1en routekaart Epigenomics2FANTOM sequencing3 hebben miljoenen van vermeende versterkers binnen het menselijk genoom geïdentificeerd over honderden celtypes. Geschat wordt dat elke promotor met een gemiddelde van 4,9 versterkers koppelt en elke enhancer contact op met een gemiddelde van 2,4 genen3, suggereert dat genexpressie vaak het resultaat van de integratie van meerdere gedistribueerde regelgevende interacties is. Een belangrijke resterende uitdaging is om te definiëren hoe afzonderlijke versterkers van niet alleen bijdragen tot genexpressie, maar hoe ze combineren om invloed op de expressie. Genetische benaderingen worden algemeen gebruikt als aanduiding van de relaties tussen versterkers in modelorganismen van Drosophila4 tot en met5van de muizen. Deze experimenten zijn echter tijdrovend en lage-doorvoer voor de studie van meerdere versterkers op meerdere genen.
Een benadering voor het bestuderen van de versterker functie op grote schaal houdt massaal parallelle verslaggever testen. Deze tests zijn voorzien van de gelijktijdige screening van duizenden van de opeenvolgingen van DNA om hun vermogen om de uitdrukking van een reporter gene6rijden. Terwijl deze tests is gebleken dat DNA-sequentie alleen voldoende zijn kan om overbrengen van gene verordening informatie7, komen ze met het voorbehoud van wordt uitgevoerd buiten de context van de inheemse chromatine en met een heteroloog promotor. Bovendien, is de grootte van de DNA-sequentie wordt geanalyseerd in massively parallel verslaggever testen meestal minder dan 200 basepairs, waarin relevante omliggende volgorde kunnen uitsluiten. Nog belangrijker is, als verslaggever testen alleen de activiteit van één opeenvolging tegelijk meten, doen ze niet rekening houden met de complexe relaties die tussen de versterkers optreden kunnen. Dus, hoewel massaal parallelle verslaggever testen kunnen informatief over de intrinsieke activiteit van een DNA-sequentie, ze doen niet per se mee te delen van de functie van dat DNA-sequentie in het kader van het genoom.
Onlangs hebben ontwikkelde CRISPR/Cas9 tools8 vergemakkelijkt de studie van genregulatie zoals zij toestaan voor de verwijdering van versterkers op de endogene locus. Echter tegelijkertijd verwijderen van meerdere versterkers kan leiden tot instabiliteit van het genoom, en het is tijdrovend voor het genereren van opeenvolgende enhancer verwijderingen in de lijn van een enkele cel. Bovendien, nieuwe genomic volgorde wordt gemaakt op de site van de verwijdering na reparatie, en deze reeks kan winnen regulerende functie. Een alternatieve versie van Cas9 is speciaal ontwikkeld voor modulerende genexpressie, vertrouwen op fusies van9,10 te activeren of onderdrukken van11,12 domeinen aan de nuclease-deficiënte formulier van Cas9 (dCas9). Deze fusie-eiwitten zijn ideaal voor het bestuderen van meerdere loci gelijktijdig als ze niet fysiek de opeenvolging van DNA veranderen, en in plaats daarvan het moduleren van epigenetica om het ondervragen van een regelgevende regio. De meest gebruikte repressieve fusie is KRAB, die het KAP1 mede onderdrukker complex werft, bevordering van de afzetting van de repressie-geassocieerde Histon H3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, ook bekend als CRISPR interferentie14, is gebruikt om afzonderlijke versterkers van target en scherm voor hun bijdragen aan gen expressie15,16; echter, het is niet geoptimaliseerd voor het targeten van meerdere regio's tegelijkertijd. Één versie van multiplex CRISPR interferentie voor enhancers, mozaïek-seq17, eencellige RNA-seq gebruikt als een uitlezing, maar deze technologie is duur en enkel geschikt voor de studie van zeer uitgesproken genen vanwege de lage gevoeligheid van één cel RNA-seq.
We gestreefd naar de ontwikkeling van een CRISPR storing gebaseerde methode voor het ontleden van combinatoriële enhancer functie in het kader van een transcriptionele reactie op oestrogeen. Ongeveer de helft van de oestrogeen-responsief genen bevatten 2 of meer versterkers gebonden door de oestrogeen receptor-alpha (ER) in de buurt van18, suggereren dat meerdere versterkers kunnen worden deel te aan de oestrogeen-reactie nemen, en begrijpen dat de regelgevende logica zou vereisen gelijktijdig meerdere versterkers gericht op. Zoals de aanvankelijke studies met behulp van CRISPR-interferentie bij initiatiefnemers voorgesteld dat niet alle initiatiefnemers even reageren op KRAB-gemedieerde repressie19 zijn, redeneerde we dat de toevoeging van een afzonderlijke repressieve domein dCas9 het deactiveren van vergemakkelijken kan de versterkers van het divers. We kozen de Sin3a interactie domein van Mad1 (SID)20 omdat het leidt tot de aanwerving van Histon deacetylases21, waarvan verwijderen acetylgroepen op histonen die geassocieerd met een transcriptionele activiteit worden. Nog belangrijker is, het domein-SID was effectief in het verminderen van genexpressie wanneer gesmolten dCas922 te verhalen23, en Sin3a heeft aangetoond dat een krachtige repressieve co-factor in een verscheidenheid van contexten24van de volgorde van de versterker. We SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) gebruikt om te richten van 10 verschillende versterkers gebonden aan de ER, en ER bandplaatsen (ERBS) die nodig voor de oestrogeen transcriptionele reactie op 4 genen18 zijnidentificeren. Wij ook de combinaties van versterkers te identificeren van de sites die in de productie van het oestrogeen transcriptionele antwoord samenwerken gericht. We vonden dat maximaal 50 sites kan mogelijk worden gericht gelijktijdig met detecteerbare gen expressie veranderingen. Met behulp van ChIP-seq en RNA-seq, we laten zien dat Enhancer-i een zeer specifieke techniek is voor het bestuderen van meerdere versterkers gelijktijdig.
In dit protocol beschrijven we de stappen betrokken bij het uitvoeren van Enhancer-i, een flexibele techniek waarmee de functionele studie van meerdere versterkers gelijktijdig in de instelling van een weefselkweek. Versterker-i is sterk gecorreleerd met genetische schrappen maar biedt tijdelijke deactivering die afhankelijk is van Histon deacetylases (HDACs). Door het leveren van gids RNAs via voorbijgaande transfectie in tegenstelling tot stabiele integratie via virale vectoren, vermijdt dit protocol afzetting en potentiële verspreiding van H3K9me3. Dit protocol details gids RNA ontwerp en klonen via assemblage van Gibson, de transfectie van gids RNAs met behulp van lipofection en de analyse van de resulterende genexpressie verandert door qPCR. Wij omvatten ook de methoden voor de evaluatie van de specificiteit van de Enhancer-i gericht op op het niveau van het genoom en de transcriptome. Hoewel deze techniek werd ontwikkeld om te bestuderen Genregulering door ER gebonden versterkers in menselijke kanker cellijnen, is van toepassing op de dissectie van alle zoogdieren versterker.

<table><tbody><tr><td>ZR 96-well Quick-RNA Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step</td><td>Applied Biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>AflII restrictie-enzym</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF Buffer</td><td>NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>Human: Ishikawa-cellen</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac konijn polyklonaal</td><td>Active Motif&nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 konijn polyklonaal</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>FLAG muis monoklonaal</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ER alpha konijn polyklonaal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro plasmide</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen et al., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector plasmide</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali et al., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 puromycin plasmide</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB plasmide</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-vrij gedistilleerd water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, met KAPA mRNA Capture Beads</td><td>Kapa Biosytems</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease en Fosfatase Inhibitor Mini Tablets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Geneticine Selectieve Antibiotica (G418 Sulfaat) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

dissectie van enhancer functie met behulp van multiplex crispr gebaseerde enhancer inmenging in cellijnen

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Meerdere versterkers reguleren vaak een bepaald gen, maar voor de meeste genen, blijft het onduidelijk welke versterkers zijn nodig voor de expressie van genen, en hoe deze versterkers combineren om te produceren een transcriptionele reactie. Zoals miljoenen van versterkers zijn geïdentificeerd, zijn high-throughput hulpmiddelen nodig voor het bepalen van de versterker functie op de schaal van een genoom-brede. Huidige methoden voor het bestuderen van de versterker functie omvatten genetische verwijderingen met behulp van de nuclease-bedreven Cas9 maken, maar het is moeilijk te bestuderen van de combinatorische effecten van meerdere versterkers met behulp van deze techniek, zoals meerdere opeenvolgende klonale cellijnen moeten worden gegenereerd. Hier presenteren we Enhancer-i, een CRISPR storing gebaseerde methode waarmee voor functionele ondervraging van meerdere versterkers gelijktijdig op hun endogene loci. Versterker-i maakt gebruik van twee repressieve domeinen gesmolten tot nuclease-deficiënte Cas9, SID en KRAB, om enhancer deactivering via Histon deacetylation op gerichte loci. Dit protocol maakt gebruik van voorbijgaande transfectie van gids RNAs om voorbijgaande inactivatie van de beoogde regio's en is met name effectief op het weren van afleidbare transcriptionele reacties op stimuli in weefselkweek instellingen. Versterker-i is zeer specifiek, zowel in de genomische gericht op en de gevolgen voor mondiale genexpressie. De resultaten van dit protocol helpen te begrijpen of een versterker draagt bij tot de genexpressie, de omvang van de bijdrage, en hoe de bijdrage wordt beïnvloed door andere nabijgelegen versterkers.

Figuur 1 toont een schematische voorstelling van de werkstroom die is beschreven in het protocol. Om te bepalen dat de bijdragen van ER-gebonden versterkers in de buurt van het oestrogeen-gereglementeerde gen MMP17, die heeft 3 bandplaatsen in de buurt zoals gedefinieerd door ChIP-seq (figuur 2A), begeleiden RNAs werden ontworpen voor elke regio. Te ontwerpen gids RNAs, een 600-900 bp venster van sequentie rond elke ER was bindende site van belang geselecteerd en zet in het programma voor het ontwerpen van een gids-RNA. Als gevolg van gids sequenties RNA met 0-2 uit doel sites werden aangepast aan het menselijk genoom met behulp van BLAT voorspeld. Vier niet-overlappende begeleiden RNAs die de regio gedefinieerd door ChIP-seq overspannen en DNaseI overgevoeligheid werden gekozen voor targeting (figuur 2B). Aanvullende reeks (tabel 1) werd toegevoegd aan elk uiteinde om downstream klonen en de daaruit voortvloeiende 59 fragmenten van de nucleotide werden besteld. Bij aankomst, werd gids RNAs waren verdund en gebundeld door site, en een korte PCR uitgevoerd om toe te voegen homologie regio's voorafgaand aan de vergadering van de Gibson. Figuur 2C toont de verwachte gids RNA product na een korte PCR met behulp van de "U6_internal" inleidingen (tabel 1), die 20 basepairs van sequentie aan elk uiteinde van de 59 basepair toevoegen zal begeleiden RNA fragment, wat resulteert in een reeks van ~ 100 basepair. Na assemblage van Gibson, deze gids RNA zwembaden werden omgevormd tot bacteriën en plasmide minipreps de volgende dag werden voorbereid. Figuur 2D ziet u resultaten van een versterker dissectie experiment, waar meerdere versterkers in de buurt van MMP17 alleen zijn gericht en in combinatie met de Enhancer-i. Sites gericht door Enhancer-i worden aangeduid met een zwarte zeshoek. Gids RNA plasmiden, gericht op de aangegeven locaties zijn transfected in een oestrogeen-beroofd Ishikawa cellijn stabiel SID4X-dCas9-KRAB te uiten. Twee dagen later, de media werd veranderd en puromycin werd toegevoegd om te verrijken voor transfected cellen. De volgende dag, zijn de cellen geoogst na een behandeling van 8 h 10 nM estradiol. RNA werd geïsoleerd, en een one-step-qPCR werd uitgevoerd. In dit voorbeeld zijn sites 1 en 2 nodig voor een volledige oestrogene reactie van MMP17, terwijl de site 3 draagt niet onder deze omstandigheden (figuur 2D, rijstroken ii-iv). Wanneer alleen de sites 2 of 3 actief zijn (vi en vii), de oestrogeen-reactie is vergelijkbaar met wanneer geen sites zijn actief (viii), wat suggereert dat deze sites onafhankelijk kunnen niet bijdragen. Site 1 enkele expressie kan bijdragen door zelf (v), maar de grootste activiteit wordt gezien wanneer sites 1 en 2 zijn actieve (iv).
Om te manipuleren 10 versterkers in de buurt van 4 verschillende genen tegelijk (figuur 3A), complexe zwembaden van begeleiden RNAs werden gegenereerd met 42 enhancer gidsen en 16 promotor gidsen. Gids RNA oligos werden samengevoegd voordat de eerste gids RNA extensie PCR (stap 3.3), en de resulterende PCR producten werden gezuiverd en gecombineerd met de lege puromycin U6 klonen vector met behulp van Gibson vergadering. Na de vergadering van de Gibson, meerdere onafhankelijke transformaties werden uitgevoerd en verguld. De platen zijn geschraapt in LB en toegestaan om te groeien uit voor 2-4 uur voorafgaand aan de maxiprep. Figuur 3B toont representatieve reducties in genexpressie door qPCR wanneer deze gids RNA zwembaden waren transfected in een oestrogeen-beroofd Ishikawa cellijn stabiel uiting van SID4X-dCas9-KRAB en behandeld zoals beschreven hierboven (figuur 2D). Inkomstenbelastingsverlagingen Enhancer-i zijn vergelijkbaar met die welke zijn verkregen door de promotor van het vermeende target-gen richten. Figuur 3 c toont de effecten van verdunning van gids RNAs op vermindering van de reactie van de oestrogeen met behulp van Enhancer-i. Een 1:50 verdunning van een pool van de gids RNA gericht op de versterker in de buurt van G0S2 nog steeds aanzienlijke vermindering van genexpressie levert, suggereren dat Enhancer-i kan worden gebruikt voor het richten van maximaal 50 sites tegelijk. Echter kan de deactivering worden verdund, die aangeeft dat honderden sites tegelijk kunnen niet worden gericht, tenzij gevoeliger detectiemethoden werkzaam zijn.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> Figuur 1. Protocol schematische voor multiplex enhancer dissectie met behulp van Enhancer-i. Gids RNAs (rood en blauw) zijn ontworpen met behulp van e-knapperig en geselecteerde de UCSC genome browser gebruikt. Vier gids RNAs worden gekozen dat de regio's van belang (transcriptie factor bandplaatsen zoals gedefinieerd door ChIP-seq) omvatten. Gids RNA oligonucleotides, die door de regio van belang (rood en blauw) hebben zijn gebundeld ondergaan een PCR om toe te voegen homologie regio's (oranje) voorafgaand aan de vergadering van de Gibson en transformatie. Resulterende plasmide zwembaden zijn transfected via lipofection naar cellijnen stabiel uiting van SID4X-dCas9-KRAB of wild-type cellen in combinatie met SID4X-dCas9-KRAB plasmide. Gids RNA plasmide zwembaden kunnen individueel zijn transfected te richten op één plaats tegelijk, of in combinatie te richten op meerdere sites tegelijk. Transfected cellen worden behandeld met antibiotica te verrijken voor cellen met gids RNAs. Op ~ 72 h post transfectie, worden de cellen geoogst. Nucleic zuren kunnen worden geëxtraheerd voor qPCR, RNA-seq of ChIP-seq. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> Figuur 2. Begeleiden van RNA ontwerp en enhancer dissectie voor MMP17. (A) Genome browser screenshot van de alpha-gebonden ER versterkers (grijs) worden gericht in de buurt van MMP17. Dit cijfer is gewijzigd vanaf Carleton, et al.. 18. (B) gids RNA ontwerpt voor de 3 sites18bindend. De bindende site voor ER zoals gedefinieerd door ChIP-seq is het doel, en de tegel van de RNAs 4 gids over deze streek. Het DNaseI gevoeligheid signaal, dat de bindende site omspant, kan ook worden gebruikt om doel reeks definiëren voor gids RNA ontwerp. ChIP-seq zowel DNaseI HS gegevens werden verkregen uit Ishikawa cellen behandeld met 10 nM estradiol voor 1 h. (C) vertegenwoordiger gids RNA-sequenties die klaar zijn voor de assemblage van Gibson, een korte PCR om toe te voegen homologie regio's hebben ondergaan. (D) relatieve uitdrukking van MMP17 gemeten via qPCR na gericht op specifieke regio's met de Enhancer-i en een 8-h10 nM estradiol behandeling. Expressie is ten opzichte van CTCF en expressie niveau van MMP17 in cellen niet behandeld met estradiol. Controleaanwijzing RNAs de promotor van richten IL1RN. Alle foutbalken vertegenwoordigen SEM, dubbele sterretjes geven p < 0.01 en één sterretjes geven p < 0.05 in een gepaarde t-toets. Dit cijfer is gewijzigd vanaf Carleton, et al.. 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> Figuur 3. Targeting op meerdere versterkers in de buurt van verschillende genen tegelijk met gebundeld Enhancer-i. (A) schema van de bandplaatsen en initiatiefnemers in gepoolde Enhancer-i worden gericht. (B) de effecten op expressie zoals gemeten door qPCR na E2 behandeling op Ishikawa cellen transfected met Enhancer-i plasmide zwembad (groen), de promotor-i plasmide zwembad (blauw) of de controle gRNAs (wit)18. Een aanzienlijke vermindering in alle genen wordt waargenomen met de Enhancer-i. Dit cijfer is bewerkt vanaf Carleton, et al.. 18. (C) de effecten op G0S2 meningsuiting niveaus na E2 behandeling op Ishikawa cellen transfected met verschillende hoeveelheden gids RNAs gericht op G0S2. Een aanzienlijke vermindering kan worden gezien zelfs met kleine hoeveelheden gids RNA (1:50 verdunning), suggereren dat maximaal 50 plaatsen kan gericht gelijktijdig. Alle foutbalken vertegenwoordigen SEM, dubbele sterretjes geven p < 0.01 en één sterretjes geven p < 0.05 in een gepaarde t-toets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Naam</td>
			<td>Volgorde</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Inleidingen gebruikt voor gids RNA extensie en sequencing, qPCR, en detectie van de fusie-eiwit.

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren multiplexed targeting van versterkers met de deactivering fusieproteïne SID4X-dCas9-KRAB, ook bekend als enhancer interferentie (Enhancer-i). Dit protocol stelt de identificatie van versterkers die regelen van genexpressie en vergemakkelijkt de dissectie van de relaties tussen de versterkers van regulering van een gemeenschappelijk doel-gen.

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van genomics en genexpressie, zoals hoe meerdere genexpressieregio's, ook bekend als enhancers, samenwerken om transcriptie te controleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere enhancers in de buurt van meerdere verschillende genen tegelijkertijd kunnen worden getest om snel regio's te identificeren die betrokken zijn bij genexpressie. Om te beginnen met het ontwerpen van geleidings-RNA, genereer eerst DNA-sequenties zoals beschreven in het tekstprotocol.Gebruik een programma zoals E-CRISP op de gegenereerde DNA-sequenties om geleidings-RNA's met lage off-targets te vinden. Geleidings-RNA's bestaan uit 20 nucleotiden stroomopwaarts van een protospacer-aangrenzend motief, dat de vorm NGG aanneemt voor de dCas9 van S.pyogenes. Selecteer op de E-CRISP-website het organisme van interesse via de vervolgkeuzelijst.De genoomsamenstelling verschijnt rechts van de soortnaam. Selecteer de radioknop Input is FASTA-sequentie. Kopieer de FASTA-sequenties van boven en plak ze in het dialoogvenster.Zorg ervoor dat voor elke sequentie een FASTA-header is opgenomen. Selecteer de medium-radioknop en Single design in de vervolgkeuzelijst. Klik op de knop Start single gRNA search.Een nieuwe browsertabblad wordt geopend en de resultaten worden weergegeven. Download de kandidaatsequenties door op de knop te klikken, Download een in Excel geformuleerd tabelrapport voor alle vraagsequenties samen. Gebruik vervolgens de UCSC-genoombrowser om volledige geleidings-RNA-sequenties te BLAT naar het genoom.Navigeer in een browser naar de website van de UCSC-genoombrowser. Zoek onder de sectie Onze tools het woord BLAT en klik erop. De BLAT-zoektool wordt geopend.Gebruik de vervolgkeuzemenu's onder de tekst BLAT search genome om het organisme en de genoomsamenstelling van interesse te selecteren. Kopieer de geleidings-RNA-sequenties uit het tabelrapport gegenereerd door E-CRISP en plak ze in het dialoogvenster. Zorg ervoor dat elke sequentie een unieke FASTA-header heeft en klik vervolgens op de knop Versturen onderaan het dialoogvenster.Op de BLAT-zoekresultatenpagina verschijnen uitlijningen van elke geleidings-RNA-sequentie, waarbij elke regel een uitlijning vertegenwoordigt. Idealiter zou er voor elke geleidings-RNA één uitlijning moeten zijn, wat de uniciteit van die geleidings-RNA aangeeft. Vermijd indien mogelijk geleidings-RNA's die op meerdere locaties in het genoom worden afgebeeld.Om geleidings-RNA-lokalisatie en -verdeling binnen het gebied van belang te bekijken, klik op de browserlink onder de sectie Acties voor een van de opgevraagde geleidings-RNA's. De genoombrowser verschijnt en wordt gecentreerd op de geselecteerde geleidings-RNA. Gebruik de knoppen voor in- en uitzoomen bovenaan de pagina om de verdeling van andere geleidings-RNA's te visualiseren die door E-CRISP zijn geïdentificeerd binnen het gebied van belang.Selecteer vier, bij voorkeur niet-overlappende, geleidings-RNA's die over het gebied van belang zijn verdeeld. Als het gebied van belang meer dan 600 basenparen omvat, overweeg dan om één tot twee extra geleidings-RNA's toe te voegen. Vermijd geleidings-RNA's met homopolymere reeksen en extreem GC-gehalte, aangezien deze kenmerken het geleidings-RNA-kloneringproces kunnen belemmeren en de doeltreffendheid van geleidings-RNA-targeting kunnen verminderen.Reconstitueer geleidings-RNA-oligo's tot een eindconcentratie van 100 micromolar in ultrapuur water. Er moeten ten minste vier afzonderlijke geleidings-RNA-oligo's zijn voor elke regio van belang. Maak voor elke relevante regulatoire regio een pool van alle oligo's die overeenkomen met de regio van belang.Combineer in een Eppendorf-buis vijf microliter van elk afzonderlijk gereconstitueerd geleidings-RNA-oligo voor elke regio. Meng de pool goed door te vortexen en verwijder vervolgens één microliter en verdun deze eloquat 1-op-200 in ultrapuur water. Voer een korte PCR uit met de USICS-primers om homologiegebieden aan de oligo's te hechten, zoals beschreven in het tekstprotocol.Er worden ongeveer 40 basen toegevoegd aan elk oligo, waardoor een product van ongeveer 100 basenpaar ontstaat dat voldoende homologie bevat met het USIC-spekter aan beide uiteinden. Stel vervolgens Gibson Assembly-reacties in op ijs in. Gebruik 50 nanogram van de verteerde vector en zeven nanogram van de inzet in een reactie van 20 microliter.Stel ook een Gibson Assembly-reactie van slechts verteerde vector in met 50 nanogram van de vector en vervang de inzet door water. Incubeer de Gibson Assembly-reacties gedurende 15 minuten bij 50 graden Celsius, gevolgd door een houdtijd bij 4 graden Celsius. Nadat de geassembleerde producten naar ijs zijn overgebracht, verdun ze 1-op-4 in ultrapuur water op ijs.Voeg bijvoorbeeld vijf microliter Gibson Assembly-product toe aan 15 microliter ultrapuur water. Transformeer vervolgens de verdunde Gibson Assembly-producten. Laat hoge competente cellen op ijs vallen en maak 25 microliter eloquats voor elke transformatie.Als een complexe pool die meerdere sites target gewenst is, laat dan voldoende cellen in verschillende buizen vallen om meerdere onafhankelijke transformaties uit te voeren. Plateer 50 microliter van de getransformeerde cellen en plaats de platen overnacht in een incubator van 37 graden Celsius. Voor mini-preps van de pools die individuele sites targeten, plaats de cellen direct in drie tot vijf milliliter LB-bouillon met ampicilline of carbencillin.Incubeer de cellen overnacht met schudden bij 250 rpm en 37 graden Celsius. Gebruik voor grote bibliotheken een platenschraper om alle kolonies van elke individuele plaat in één maxi-prep te verzamelen. Dit kan worden vergemakkelijkt door ongeveer vijf milliliter LB met het juiste antibioticum in een 15 milliliter Falcon-buis te gieten en de kolonies in de buis te schrapen.De dag voor transfectie plateer de cellen in een 24-wellsplaat bij 30 tot 50%confluency. Plateer voldoende cellen zodat transfecties in duplica

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

CRISPR/Cas9 is een robuust systeem om genen en genetische elementen te onderbreken. Hier beschrijven we een protocol voor het efficiënt creëren van genomische deleties in zoogdiercellijnen met behulp van CRISPR/Cas9.

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Genoombewerkingstools zoals het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) systeem hebben de efficiëntie van gentargeting in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) aanzienlijk verbeterd. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het genereren van een lijnspecifiek hiPSC-reporter met behulp van CRISPR/Cas systeem-ondersteunde homologe recombinatie.

Efficiënte generatie van iPSC Neural Lineage Specifieke Knockin Reporters Met de CRISPR / Cas9 en Cas9 Double Nickase System

Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Protocollen bij HPSC mutant lijnen met behulp van de iCRISPR platform te genereren en om hPSCs in glucose-responsief β-achtige cellen te onderscheiden zijn beschreven. De combinatie van genoom editing-technologie met HPSC gerichte differentiatie biedt een krachtig platform voor de systematische analyse van de rol van de lijn determinanten in de menselijke ontwikkeling en de progressie van de ziekte.

Genoom bewerken en Directed Differentiatie van hPSCs voor ondervragen Lineage Determinanten in Human eilandjes Development

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

Directe levering van voorgemonteerde Cas9/gids RNA RiboNucleoProteïne-complexen is een snel en efficiënt middel voor genoom bewerking in hematopoietische cellen. Hier gebruiken we deze aanpak om een RUNX1 intronic geluiddemper te verwijderen en de transcriptionele responsen in OCI-AML3 leukemische cellen te onderzoeken.

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

We rapporteren de toepassing van kwantitatieve chromosoomconformatievangst gevolgd door high-throughput sequencing in embryoïndische lichamen gegenereerd uit embryonale stamcellen. Deze techniek maakt het mogelijk om de contacten tussen putatieve versterkers en promotorgebieden van een bepaald gen te identificeren en te kwantificeren tijdens embryonale stamceldifferentiatie.

Identificatie van enhancer-promotor contacten in embryoïide lichamen door kwantitatieve chromosoomconformatie Capture (4C)

Dit protocol beschrijft een high-throughput clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genbewerkingsworkflow voor microRNA-clusternetwerkanalyse die de snelle generatie van een panel van genetisch gemodificeerde cellijnen met unieke miRNA-clusterliddeletiecombinaties zo groot als 35 kb binnen een enkel experiment mogelijk maakt.

CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

De THP-1-cellijn wordt veel gebruikt als model om de functies van menselijke monocyten/macrofagen in verschillende biologiegerelateerde onderzoeksgebieden te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol voor efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde engineering en isolatie van single-cell kloons, waardoor de productie van robuuste en reproduceerbare fenotypische gegevens mogelijk wordt.

Op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-out in THP-1-cellen en isolatie van eencellige klonen

Het protocol beschrijft methoden voor geclusterde, regelmatig tussenliggende korte palindromale herhalingen (CRISPR)-gebaseerde epigenoombewerking in menselijke cellijnen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectie.

CRISPR-epigenoombewerking in menselijke cellen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectieafgifte

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

Leer multiplex CRISPR-gebaseerde enhancer-inmenging in cellijnen om genregulatie te bestuderen. Deze methode maakt gelijktijdige targeting van meerdere enhancers mogelijk voor snelle identificatie van regulerende regio's.

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Meer video's verkennen