Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten
1 november 2018
De belangrijkste focus van dit protocol is efficiënt isoleren levensvatbare primaire glomeruli culturen met minimale contaminanten voor gebruik in een verscheidenheid van downstream toepassingen. De geïsoleerde glomeruli structurele relaties tussen component celtypes behouden en kunnen gekweekte ex vivo voor een korte tijd.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van nierziekte te beantwoorden. In het bijzonder in het begrip van glomerulus in normale en zieke staten. Glomerulaire biologie kan moeilijk te bestuderen zijn vanwege de verscheidenheid aan aanwezige celtypen en hun unieke structuur.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om een direct beschikbare bron van intacte glomeruli met behulp van eenvoudige methoden en apparatuur. Deze techniek heeft implicaties voor ons begrip van de filtratiebarrière in de normale en zieke nier. In het bijzonder kan het licht werpen op ons begrip van proteinuric chronische nierziekte waarbij glomerulaire schade leidt tot de abnormaal hoge afscheiding van serumeiwitten in de urine.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn bij deze techniek moeite hebben om voldoende opbrengst en zuiverheid te verkrijgen in het uiteindelijke monster. Het aantonen van de procedure zal Brittney Rush zijn, een technicus van mijn laboratorium. Om te beginnen, gebruik haarknippers om haar te verwijderen uit de voorste buik van een geëuthanaseerde rat.
Gebruik 70% ethanol om de blootgestelde huid schoon te maken. Dan, met behulp van chirurgische schaar, maak een middellijn incisie in de huid. Om interne organen bloot te leggen, maak een middellijn incisie door de spierlaag.
Zoek en isoleer de nieren en plaats in een steriele 50 milliliter plastic conische buis met 30 milliliter van hank's gebufferde zoutoplossing of HBSS geplaatst op ijs. Breng de buis op ijs naar een steriele cel cultuur kap. Breng de nieren over op een steriel petrischaaltje met vijf milliliter HBSS op ijs.
Gebruik een schaar en scherpe tangen te verwijderen en te ontdoen perirenal vet. Om de capsules rond de nier te verwijderen en weg te gooien, maak je een kleine oppervlakkige incisie en gebruik je vervolgens scherpe tangen om het voorzichtig van de nier weg te trekken. Plaats de nieren op een steriel gaas in een tweede petrischaaltje met vijf milliliter HBSS en verdeel elke nier in de helft door een mid-sagittale sectie.
Gebruik een scalpel om de medulla te verwijderen en weg te gooien die kan worden geïdentificeerd door zijn donkere kleur en centrale locatie. Breng de resterende stukken met voornamelijk de nierschors, in een derde petrischaaltje met vijf milliliter HBSS. Gebruik een steriel scheermesje om ze gehakt totdat de stukken zijn minder dan een millimeter groot of totdat een pasta wordt gevormd.
Gebruik 1%BSA PBS om de boven- en onderkant van een zeef van 180 micrometer over een afvalbeker van 500 milliliter nat te maken. Deze stap is van cruciaal belang omdat het de zeef bedekt met eiwit en de hechting van glomeruli vermindert, wat de opbrengst vervolgens zal verbeteren. Plaats de gemengde cortex op een kleine rand van de zeef.
Gebruik de getextureerde zuiger flens van een 10 milliliter wegwerpspuit om het weefsel door de zeef in een onderste pan geplaatst op ijs te brij. Spoel periodiek met HBSS met behulp van zo weinig mogelijk om monsterverdunning te voorkomen en hergebruik de vloeistof verzamelen in de onderste pan om de zeef te spoelen. Na het voltooide zeven, zorgvuldig wassen van de onderkant van de zeef met HBSS van de onderkant van de pan om eventuele loshangende glomeruli vast te leggen.
Verdeel alle vloeistof uit de onderste pan in 10 milliliter spuiten uitgerust met 20 meter naalden. Geef de vloeistof minstens drie keer door de naald in de onderste pan. Voor de laatste collectie, houd de glomeruli met vloeistof in de spuit tot klaar om het door de 90 micrometer zeef.
Was ondertussen de onderste pan door het door te spoelen met 1%BSA PBS en in een afvalbeker. Gebruik 1%BSA PBS om de boven- en onderkant van een zeef van 90 micrometer nat te maken en plaats deze vervolgens op de bovenkant van de onderste pan. Breng het monster in de spuiten aan op één rand van de zeef.
Gebruik een getextureerde zuiger flens om het weefsel brij door de zeef zoals eerder gedaan. Gebruik de oplossing uit de onderste pan om het weefsel te wassen en alles te verzamelen van een rand van de zeef. Zodra het zeven is voltooid, zorgvuldig wassen de onderkant van de zeef met HBSS buffer van de bodem van de pan om een glomeruli die losjes kan worden gehecht vast te leggen.
Verzamel alle vloeistof uit de onderste pan in een 50 milliliter plastic conische buis. Gebruik 1%BSA PBS om de onderste pan in een afvalbeker te wassen. Gebruik vervolgens 1%BSA PBS om de boven- en onderkant van een zeef van 75 micrometer nat te maken.
Plaats de zeef op de onderste pan geplaatst op ijs. Breng het monster aan op één rand van de zeef met vloeistof die er gemakkelijk doorheen stroomt. Spoel de bovenkant van de zeef met minimaal 20 milliliter van 1%BSA PBS in een afvalbeker en was de onderkant van de zeef voorzichtig.
Om de glomeruli te verzamelen die op de top van de 75 micrometerzeef bleven, spoel je de zeef ondersteboven met zoveel HBSS als nodig is om glomeruli in een petrischaaltje te verzamelen. Verzamel de gezeefde glomeruli in een 50 milliliter plastic conische buis op ijs. Na het centrifugeren op 1800 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, verwijder de supernatant voorzichtig met behulp van een pipet.
Stel de pellet opnieuw op in 10 milliliter koude HBSS. Combineer de monsters en herhaal de centrifugatie. Schors de glomeruli opnieuw in vijf milliliter HBSS.
Om de totale glomeruli te tellen, plaatst u een 10 microliter druppel van het monster op een glazen schuif, tel onder een microscoop en meerdere bij 500 om de totale opbrengst te krijgen. Geïsoleerde structuren moeten bestaan uit bijna alle glomeruli zonder buisvormige structuren. Als tubuli aanwezig zijn en uw downstream-toepassing zouden beïnvloeden, kunnen ze worden verwijderd door het hele monster toe te passen op de 90 micrometerzeef en het protocol vanaf dat punt te herhalen.
Het hier beschreven protocol is efficiënt in het isoleren van glomeruli en de uiteindelijke suspensie is dicht verpakt met glomeruli met een zuiverheid van meer dan 95% en minimale verontreiniging van buisvormige segmenten of andere celtypes. Deze glomeruli kunnen worden gekleurd met hematoxyline en eosine vlekken om hun morfologie te bekijken. Bovendien behouden ze hun structuur gedurende het hele protocol, zelfs na verwerking.
Ze behouden intacte en levensvatbare podocyten, mesangial cellen en endotheelcellen. De geïsoleerde glomeruli zijn blootgesteld aan chemische verwondingen om in vivo pathologie te simuleren. Specifiek protaminesulfaat dat de lading van de glomerulaire filtratiebarrière verstoort.
In tegenstelling tot gezonde glomeruli, protamine sulfaat behandeld glomeruli, hebben een prominente vermindering van nephron en een aantal kernen positief voor WT1. Wanneer bekeken met transmissie elektronenmicroscopie, gezonde glomeruli tonen typische voetprocessen. Na protaminesulfaatbehandeling worden voetprocessen langwerpig of uitgewist, wat wijst op podocyteletsel.
Om de levensvatbaarheid van de cel in geïsoleerde glomeruli te bepalen, werd gespleten caspase drie waargenomen als een apoptosemarkering. Er was geen gespleten caspase drie op nul en een uur na isolatie van glomeruli. Een paar cellen vertoonden tekenen van apoptose op twee en vier uur met een progressieve toename in de tijd.
Het grootste aantal apoptotische cellen werden opgemerkt op 24 en 48 uur. Op basis van deze resultaten raden we aan om geïsoleerde glomeruli onmiddellijk na isolatie te gebruiken voor de meeste experimenten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel en efficiënt te werken.
Vanaf het moment dat de nier geïsoleerd is, beginnen glomeruli te verslechteren. Hoe sneller je de glomeruli isoleren, hoe meer tijd je moet poseren, isolatie, manipulatie. Na isolatie kan geïsoleerde glomeruli worden blootgesteld aan chemische of biologische agentia om fysiologische of pathologische aandoeningen te stimuleren.
En specimens kunnen worden verwerkt voor eiwit of RNA isolatie, histologie of immunofluorescentie en elektronenmicroscopie. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1950 heeft deze techniek onderzoekers geholpen bij het bestuderen van glomerulaire biologie. Over het algemeen biedt dit protocol een methode om de morfologische en cellulaire kenmerken van intacte glomeruli in normale en zieke toestanden te evalueren.
Deze methode kan helpen ons begrip van proteinuric chronische nierziekte en hulp bij de ontwikkeling van toekomstige therapieën.
Overzicht
Dit protocol richt zich op de efficiënte isolatie van levensvatbare primaire glomerulusculturen met minimale contaminanten. De geïsoleerde glomeruli behouden de structurele relaties tussen celtypen en kunnen gedurende korte perioden ex vivo worden gekweekt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Nefrologie
- Celbiologie
- Onderzoek naar nierziekten
Achtergrond
- Het bestuderen van de glomerulaire biologie is uitdagend vanwege de diverse celtypen en structuren.
- Het begrijpen van glomeruli is cruciaal voor inzichten in de filtratiebarrières van de nieren.
- Deze techniek helpt bij het bestuderen van chronische nierziekten met proteïnurie.
- Nieuwe gebruikers kunnen moeite hebben met de opbrengst en zuiverheid bij de isolatie van glomeruli.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het isoleren van intacte glomeruli.
- Om het begrip van de mechanismen van nieraandoeningen te vergroten.
- Om downstream-toepassingen in niereonderzoek te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van ratnieren met behulp van chirurgische technieken.
- Isolatie van de nierschors en glomeruli via zeven.
- Centrifugatie en resuspensie van glomeruli in HBSS.
- Tellen en beoordelen van de zuiverheid van de geïsoleerde glomeruli.
Belangrijkste resultaten
- Geïsoleerde glomeruli vertonen een zuiverheid van meer dan 95% met minimale contaminatie.
- Glomeruli behouden hun levensvatbaarheid en structurele integriteit gedurende het gehele protocol.
- De methode maakt kleuring en morfologische beoordeling van glomeruli mogelijk.
- Het protocol is efficiënt en reproduceerbaar voor onderzoeksapplicaties.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het isoleren van levensvatbare glomeruli.
- Het biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van nierfunctie en nierziekten.
- Toekomstige toepassingen kunnen het onderzoeken van mechanismen van glomerulaire beschadiging omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Efficiënte isolatie van intacte glomeruli uit nieren van volwassen ratten maakt getrouwe modellering van glomerulaire beschadiging en disfunctie van de filtratiebarrière mogelijk, wat cruciaal is voor vroege stadia van geneesmiddelenontwikkeling binnen de nefrologie. Deze methode ondersteunt mechanische risicoanalyse en targetvalidatie door structureel behouden, levensvatbare glomeruli te leveren die geschikt zijn voor kwantitatieve en translationele assays. De reproduceerbaarheid en hoge opbrengst van het protocol faciliteren een robuuste preklinische evaluatie van kandidaat-therapeutica gericht op glomerulaire pathologieën.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar mechanismen van glomerulaire beschadiging mogelijk onder gecontroleerde ex vivo condities.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door de integriteit van podocyten, mesangiale cellen en endotheelcellen te behouden.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie voor targets die gerelateerd zijn aan proteïnurie en de filtratiebarrière.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, hoogzuivere glomerulaire preparatie voor reproduceerbare screening van verbindingen.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van letsel mogelijk via immunofluorescentie, western blotting en elektronenmicroscopie.
- Ondersteunt de ontwikkeling van assays voor nefrine en WT1 als translationele biomarkers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Komt overeen met ziekterelateerde modellen van glomerulaire beschadiging en proteïnurie.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie met behulp van intacte glomerulaire systemen.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde voortgang van nefrologische activa door voorspellende read-outs van beschadigingen te verschaffen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze zeefmethode is geïntegreerd in het vroege continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek, waardoor hypothesetesten, targetvalidatie en translationele biomarkerbeoordeling in onderzoek naar glomerulaire ziekten mogelijk worden gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het toetsen van nulhypothesen met betrekking tot mechanismen van glomerulaire beschadiging en betrokkenheid van signaalpaden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de evaluatie van verbindingen in glomerulaire systemen.
- Analytica: Biedt robuuste morfologische en moleculaire read-outs voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo ziekte-modellen door behoud van de glomerulaire architectuur.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een schaalbaar, aanpasbaar platform voor diverse R&D-toepassingen binnen de nefrologie.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van glomerulaire targets en mechanistische studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert glomerulaire isolatie voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen onderzoeksteams.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen door een robuuste, kwantitatieve beoordeling van letsel mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van nefrologieprogramma's via betrouwbare preklinische gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist technische expertise in weefseldissectie en zeven voor een optimale opbrengst en zuiverheid.
- Toegang tot basiscellocultuur, microscopie en analytische instrumentatie is noodzakelijk.
- Snel verwerken na excisie is vereist om de levensvatbaarheid en structuur van de glomeruli te behouden.
- De aanpasbaarheid van het protocol maakt gebruik mogelijk in verschillende nephron-schademodellen en downstream-assays.
- De levensvatbaarheid van geïsoleerde glomeruli neemt na verloop van tijd af, waardoor onmiddellijk experimenteel gebruik noodzakelijk is.
