Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van nierziekte te beantwoorden. In het bijzonder in het begrip van glomerulus in normale en zieke staten. Glomerulaire biologie kan moeilijk te bestuderen zijn vanwege de verscheidenheid aan aanwezige celtypen en hun unieke structuur.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om een direct beschikbare bron van intacte glomeruli met behulp van eenvoudige methoden en apparatuur. Deze techniek heeft implicaties voor ons begrip van de filtratiebarrière in de normale en zieke nier. In het bijzonder kan het licht werpen op ons begrip van proteinuric chronische nierziekte waarbij glomerulaire schade leidt tot de abnormaal hoge afscheiding van serumeiwitten in de urine.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn bij deze techniek moeite hebben om voldoende opbrengst en zuiverheid te verkrijgen in het uiteindelijke monster. Het aantonen van de procedure zal Brittney Rush zijn, een technicus van mijn laboratorium. Om te beginnen, gebruik haarknippers om haar te verwijderen uit de voorste buik van een geëuthanaseerde rat.

Gebruik 70% ethanol om de blootgestelde huid schoon te maken. Dan, met behulp van chirurgische schaar, maak een middellijn incisie in de huid. Om interne organen bloot te leggen, maak een middellijn incisie door de spierlaag.

Zoek en isoleer de nieren en plaats in een steriele 50 milliliter plastic conische buis met 30 milliliter van hank's gebufferde zoutoplossing of HBSS geplaatst op ijs. Breng de buis op ijs naar een steriele cel cultuur kap. Breng de nieren over op een steriel petrischaaltje met vijf milliliter HBSS op ijs.

Gebruik een schaar en scherpe tangen te verwijderen en te ontdoen perirenal vet. Om de capsules rond de nier te verwijderen en weg te gooien, maak je een kleine oppervlakkige incisie en gebruik je vervolgens scherpe tangen om het voorzichtig van de nier weg te trekken. Plaats de nieren op een steriel gaas in een tweede petrischaaltje met vijf milliliter HBSS en verdeel elke nier in de helft door een mid-sagittale sectie.

Gebruik een scalpel om de medulla te verwijderen en weg te gooien die kan worden geïdentificeerd door zijn donkere kleur en centrale locatie. Breng de resterende stukken met voornamelijk de nierschors, in een derde petrischaaltje met vijf milliliter HBSS. Gebruik een steriel scheermesje om ze gehakt totdat de stukken zijn minder dan een millimeter groot of totdat een pasta wordt gevormd.

Gebruik 1%BSA PBS om de boven- en onderkant van een zeef van 180 micrometer over een afvalbeker van 500 milliliter nat te maken. Deze stap is van cruciaal belang omdat het de zeef bedekt met eiwit en de hechting van glomeruli vermindert, wat de opbrengst vervolgens zal verbeteren. Plaats de gemengde cortex op een kleine rand van de zeef.

Gebruik de getextureerde zuiger flens van een 10 milliliter wegwerpspuit om het weefsel door de zeef in een onderste pan geplaatst op ijs te brij. Spoel periodiek met HBSS met behulp van zo weinig mogelijk om monsterverdunning te voorkomen en hergebruik de vloeistof verzamelen in de onderste pan om de zeef te spoelen. Na het voltooide zeven, zorgvuldig wassen van de onderkant van de zeef met HBSS van de onderkant van de pan om eventuele loshangende glomeruli vast te leggen.

Verdeel alle vloeistof uit de onderste pan in 10 milliliter spuiten uitgerust met 20 meter naalden. Geef de vloeistof minstens drie keer door de naald in de onderste pan. Voor de laatste collectie, houd de glomeruli met vloeistof in de spuit tot klaar om het door de 90 micrometer zeef.

Was ondertussen de onderste pan door het door te spoelen met 1%BSA PBS en in een afvalbeker. Gebruik 1%BSA PBS om de boven- en onderkant van een zeef van 90 micrometer nat te maken en plaats deze vervolgens op de bovenkant van de onderste pan. Breng het monster in de spuiten aan op één rand van de zeef.

Gebruik een getextureerde zuiger flens om het weefsel brij door de zeef zoals eerder gedaan. Gebruik de oplossing uit de onderste pan om het weefsel te wassen en alles te verzamelen van een rand van de zeef. Zodra het zeven is voltooid, zorgvuldig wassen de onderkant van de zeef met HBSS buffer van de bodem van de pan om een glomeruli die losjes kan worden gehecht vast te leggen.

Verzamel alle vloeistof uit de onderste pan in een 50 milliliter plastic conische buis. Gebruik 1%BSA PBS om de onderste pan in een afvalbeker te wassen. Gebruik vervolgens 1%BSA PBS om de boven- en onderkant van een zeef van 75 micrometer nat te maken.

Plaats de zeef op de onderste pan geplaatst op ijs. Breng het monster aan op één rand van de zeef met vloeistof die er gemakkelijk doorheen stroomt. Spoel de bovenkant van de zeef met minimaal 20 milliliter van 1%BSA PBS in een afvalbeker en was de onderkant van de zeef voorzichtig.

Om de glomeruli te verzamelen die op de top van de 75 micrometerzeef bleven, spoel je de zeef ondersteboven met zoveel HBSS als nodig is om glomeruli in een petrischaaltje te verzamelen. Verzamel de gezeefde glomeruli in een 50 milliliter plastic conische buis op ijs. Na het centrifugeren op 1800 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, verwijder de supernatant voorzichtig met behulp van een pipet.

Stel de pellet opnieuw op in 10 milliliter koude HBSS. Combineer de monsters en herhaal de centrifugatie. Schors de glomeruli opnieuw in vijf milliliter HBSS.

Om de totale glomeruli te tellen, plaatst u een 10 microliter druppel van het monster op een glazen schuif, tel onder een microscoop en meerdere bij 500 om de totale opbrengst te krijgen. Geïsoleerde structuren moeten bestaan uit bijna alle glomeruli zonder buisvormige structuren. Als tubuli aanwezig zijn en uw downstream-toepassing zouden beïnvloeden, kunnen ze worden verwijderd door het hele monster toe te passen op de 90 micrometerzeef en het protocol vanaf dat punt te herhalen.

Het hier beschreven protocol is efficiënt in het isoleren van glomeruli en de uiteindelijke suspensie is dicht verpakt met glomeruli met een zuiverheid van meer dan 95% en minimale verontreiniging van buisvormige segmenten of andere celtypes. Deze glomeruli kunnen worden gekleurd met hematoxyline en eosine vlekken om hun morfologie te bekijken. Bovendien behouden ze hun structuur gedurende het hele protocol, zelfs na verwerking.

Ze behouden intacte en levensvatbare podocyten, mesangial cellen en endotheelcellen. De geïsoleerde glomeruli zijn blootgesteld aan chemische verwondingen om in vivo pathologie te simuleren. Specifiek protaminesulfaat dat de lading van de glomerulaire filtratiebarrière verstoort.

In tegenstelling tot gezonde glomeruli, protamine sulfaat behandeld glomeruli, hebben een prominente vermindering van nephron en een aantal kernen positief voor WT1. Wanneer bekeken met transmissie elektronenmicroscopie, gezonde glomeruli tonen typische voetprocessen. Na protaminesulfaatbehandeling worden voetprocessen langwerpig of uitgewist, wat wijst op podocyteletsel.

Om de levensvatbaarheid van de cel in geïsoleerde glomeruli te bepalen, werd gespleten caspase drie waargenomen als een apoptosemarkering. Er was geen gespleten caspase drie op nul en een uur na isolatie van glomeruli. Een paar cellen vertoonden tekenen van apoptose op twee en vier uur met een progressieve toename in de tijd.

Het grootste aantal apoptotische cellen werden opgemerkt op 24 en 48 uur. Op basis van deze resultaten raden we aan om geïsoleerde glomeruli onmiddellijk na isolatie te gebruiken voor de meeste experimenten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel en efficiënt te werken.

Vanaf het moment dat de nier geïsoleerd is, beginnen glomeruli te verslechteren. Hoe sneller je de glomeruli isoleren, hoe meer tijd je moet poseren, isolatie, manipulatie. Na isolatie kan geïsoleerde glomeruli worden blootgesteld aan chemische of biologische agentia om fysiologische of pathologische aandoeningen te stimuleren.

En specimens kunnen worden verwerkt voor eiwit of RNA isolatie, histologie of immunofluorescentie en elektronenmicroscopie. Sinds de ontwikkeling in de jaren 1950 heeft deze techniek onderzoekers geholpen bij het bestuderen van glomerulaire biologie. Over het algemeen biedt dit protocol een methode om de morfologische en cellulaire kenmerken van intacte glomeruli in normale en zieke toestanden te evalueren.

Deze methode kan helpen ons begrip van proteinuric chronische nierziekte en hulp bij de ontwikkeling van toekomstige therapieën.