Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Het algemene doel van deze methode is het genereren van een zeer weefsel-specifieke gerichte expressie systeem. In deze methode demonstreerden we de generatie van een binaire transcriptie driver specifiek voor onze Drosophila FGF homolog, branchless. Dynamische, spatiotemporale expressie van branchless reguleert tak hemogenese van tracheale luchtweg epitheel.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de spatiotemporale expressie en migratie van vertakte producerende cellen, kan deze gemakkelijk worden toegepast op andere genen en weefsels in Drosophila of in andere modelorganismen, zoals C.Elegans en zebravissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het expressiesystemen genereert die zeer betrouwbaar zijn, weefsel- en genspecifiek, en uitsluitend actief in cellen waar de cis-regulerende elementen van het vervangen gen functioneel zijn. Binaire transcriptiesystemen zijn essentiële instrumenten voor gerichte genexpressie en -manipulatie.

Een trans activator, zoals GAL4 of LexA, uitgedrukt onder de controle van cis regulerende elementen van een gen, rijden een effector trans gen dat is geplaatst stroomafwaarts van specifieke transcriptie bindende sites, zoals UAS voor GAL4 en / of LexO voor LexA. Deze methode vervangt de eerste coderingsexon van het branchless-gen door de transcriptiedriver. De crispr Cas9-gebaseerde methode plaatst een LexA trans activator sequentie onder de endogene regulatie van het branchless gen, en vergemakkelijkt bijgevolg trans activatorexpressie uitsluitend in branchless specifieke spatiotemporale patronen.

Begin met het selecteren van twee leids-RNA-doelsites die specifiek gericht zijn op twee uiteinden van het geselecteerde interessegebied. Open het CRISPR-ontwerpgereedschap naar keuze. Fly CRISPR Optimal Target Finder wordt hier gebruikt.

Klik op Select Genome'insert the sequence of interest en selecteer de meest recente geüploade Drosophila melanogaster genoomannotatie, momenteel R onderstreept zes, in het vervolgkeuzemenu. Klik vervolgens op Hulplijnlengte selecteren en invoer 20. Selecteer Alle CRISPR-doelen en klik op CRISPR-doelen zoeken.

Evalueer alle kandidaatgids RNA-doelen door maximum in te stellen voor stringency en NGG only'for PAM. Om een tandemgeleider RNA-expressievector te genereren, versterkt pcr eerst een DNA-fragment om twee proto-afstandsequenties in een pCFD4 RNA-expressievectorbone te introduceren. Gebruik een voorwaartse en omgekeerde primer, elk met een proto spacer-sequentie, en overlap met de pCFD4-vectorsequentie in een PCR met behulp van high-fidelity polymerase en pCFD4-sjabloon-DNA.

Om pCFD4 voor te bereiden op klonen, verteer het plasmid met Bbs1 enzym. Stel een reactie in de juiste spijsverteringsbuffer met twee tot vijf microgram pCFD4 plasmide en één microliter Bbs1-enzym en een eindvolume van 50 microliter. Meng de reactie inhoud door gentling tikken op de buis en het verzamelen van alle verspreide druppels van de muur van de buis naar de bodem door een korte spin.

Incubeer de reactie mix op 37 graden Celsius gedurende twee uur na het uitvoeren van de PCR product en verteerd plasmid op een een procent agarose gel. Zuiver het 6,4 kilobasse paar lineaire plasmid en 600 base pair PCR product met behulp van standaard gel zuivering kolommen. Stel de DNA-montagereactie in volgens het protocol van de fabrikant.

Voor genomische knock-in van een GAL4- of LexA-sequentie ontwerp je een dubbelstrengde HDR-donor met de trans activator-sequentie, geflankeerd door twee homologiearmen. Om te voorkomen dat de gids RNA opnieuw richt op de ontworpen locus, ontwerpt u de vervangende donor zodanig dat de journaalherkenningsplaatsen van de gids worden verstoord door de exogene volgorde die wordt geïntroduceerd. Om te voorkomen dat de zuiverheid van cis-regulerende elementen verandert, selecteert u ook altijd de RNA-herkenningssites voor gids binnen het coderingsexongebied.

Plan de DNA-assemblagestrategie om vier segmenten samen te voegen om een vervangende cassette te genereren. De vijf eerste en drie eerste homologie armen, de middelste exogene trans activator DNA sequentie, en de lineaire klonen vector ruggengraat. PCR versterken een GAL4 of een LexA expressie cassette uit een geschikte vector en PCR versterken de homologie armen uit de genomische DNA gewonnen uit de moedervlieg lijn geselecteerd voor injectie.

Gebruik high-fidelity polymerase in elke PCR om de doelfragmenten te genereren. Om de DNA-assemblagereactie in te stellen, mengt u de gelineariseerde kloonvector en doelfragmenten die door PCR-klonen worden gegenereerd, met de DNA-assemblagemastermix en een eindreactievolume tot 20 microliters volgens de instructies van de fabrikant. Broed de reactiemix gedurende een uur bij 50 graden Celsius.

Wanneer Nos-Cas9 embryo's eerder geïnjecteerd met zowel de gids RNA expressie plasmid en de vervangende donor, ontwikkelen tot volwassenen, cross G0 vliegt individueel om uw vliegen evenwicht van een lijn geschikt voor de beoogde allel. Verdoven de F1 nakomelingen van elk G0 kruis op een kooldioxide pad. Kies willekeurig 10 tot 20 mannetjes onder een stereomicroscoop.

Individueel kruis elk geselecteerd mannetje aan een balancervrouw van een lijn aangewezen voor het gerichte allel. Wanneer de F2 larven uitkomen, kies de F1 vader van elk kruis. Haal genomisch DNA eruit door elke vlieg 10 tot 15 seconden te besmeuren met een pipetpunt, met 50 microliters squishing buffer zonder de buffer af te geven.

Dan, doe de resterende buffer in de buis en meng goed. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten. Na de incubatie, plaats de buizen in 95 graden Celsius warmteblok gedurende een tot twee minuten om de proteinase K. Na het spinnen naar beneden gedurende vijf minuten op 10,000 keer G, bewaar de voorbereiding op vier graden Celsius voor verdere PCR-analyse.

Voer pcr-gebaseerde schermen in drie stappen uit met behulp van primers één en draai één naar het scherm voor het bestaan van de invoeging of vervanging. Voer PCR uit met behulp van twee vooruit en twee priemgetallen omdraaien of vervangen van de drie hoofdregio's te verifiëren. Voer PCR uit met primers M13F en draai er drie om de eind-in'HDR te controleren.

Houd de vlieglijnen met de bevestigde ends-out'HDR en stel evenwichtige aandelen van de F2-generatie vast. Out-cross de balancer vliegt weer om onbedoelde mutaties op andere chromosomen te verwijderen. Branchless, of bnl expressie, wordt hier getoond in rood in de derde instar larven vleugel schijf, met de receptor ademloos uitdrukken cellen, weergegeven in het groen, in de groeiende lucht zak primordium.

Branchless uitdrukkende cellen worden hier weergegeven in de TR5 dwarse verbindingstak en TR2 dorsale tak. Ademloos uitdrukken van tracheale cellen worden hier in het groen weergegeven. Ademloze uitdrukkende cellen worden weergegeven in het groen, het markeren van de zich ontwikkelende embryonale luchtpijp van fase negen tot fase 14 en de vertakte uitdrukkende cellen worden weergegeven in rood.

Dit beeld toont branchless uitdrukking die in ectopische weefselplaatsen onder hypoxische voorwaarden, met betrekking tot controle wordt veroorzaakt. Deze methode is ontworpen om alle originele spatiotemporale voorschriften van branchless gentranscriptie te behouden. Daarom was het belangrijk om alleen de eerste coderingsexon van het gen te vervangen door de LexA trans activator coderingsequentie.

Na de ontwikkeling, deze nieuwe genetische toolset de weg vrijgemaakt om nieuwe weefsel expressie patronen van de vertakte gen te verkennen. Het maakte ook genmisexpressie mogelijk en neergehaald uitsluitend in branchless uitdrukkende cellen en hielp bij het monitoren van lineaire migratie en signalering interacties van de cellen.