Name: Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Leer genetische modificatie van muizen met behulp van TALENs voor gerichte genoombewerking. Deze methode omvat micro-injectie van bevruchte eicellen en overdracht naar pleegmoeders om genfunctie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, en Ewa Skoczylas bedanken voor een uitstekende technische bijstand. Deze studie werd gefinancierd door SNF Sinergia subsidie ​​CRSI33-125073 naar PP.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).</li>
<li>Johansson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+zoo+of+mice+for+genetic+analyses%3A+a+comprehensive+protocol+for+the+rapid+generation+of+BAC+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice.</a> Genesis. 48, 264-280 (2010).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Meyer, M., de Angelis, M. H., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022-15026 (2010).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+integration+in+rat+and+mouse+embryos+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29, 64-67 (2011).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+production+of+mouse+disease+models+by+embryo+microinjection+of+TALENs+and+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct production of mouse disease models by embryo microinjection of TALENs and oligodeoxynucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 3782-3787 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-Step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genetics. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>ZFN, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 49-55 (2013).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li>
<li>Reyon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH+assembly+of+TALENs+for+high-throughput+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 30, 460-465 (2012).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nat. Protoc. 7, 171-192 (2012).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+library+of+TAL+effector+nucleases+spanning+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.</a> Nat. Biotechnol. 31, 251-258 (2013).</li>
<li>Schmid-Burgk, J. L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligation-independent+cloning+technique+for+high-throughput+assembly+of+transcription+activator-like+effector+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes.</a> Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).</li>
<li>Hermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+OPEN+zinc+finger+nucleases+for+direct+gene+targeting+of+the+ROSA26+locus+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation of OPEN zinc finger nucleases for direct gene targeting of the ROSA26 locus in mouse embryos.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Meyer, M., Ortiz, O., Hrabe de Angelis, M., Wurst, W., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+disease+mutations+by+gene+targeting+in+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modeling disease mutations by gene targeting in one-cell mouse embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 9354-9359 (2012).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+zinc-finger-nuclease+activity+with+improved+obligate+heterodimeric+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.</a> Nat. Methods. 8, 74-79 (2011).</li>
<li>Wefers, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Wefers, B., Wurst, W., Kühn, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWefers%2C+B+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22">Current Protocols in Mouse Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Haueter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+vasectomy-overexpression+of+Prm1-EGFP+fusion+protein+in+elongating+spermatids+causes+dominant+male+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic vasectomy-overexpression of Prm1-EGFP fusion protein in elongating spermatids causes dominant male sterility in mice.</a> Genesis. 48, 151-160 (2010).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Brown, M. T., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+to+the+ROSA26+locus+directed+by+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3741-3752 (2012).</li>
<li>Bultmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transcriptional+activation+of+silent+oct4+pluripotency+gene+by+combining+designer+TALEs+and+inhibition+of+epigenetic+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted transcriptional activation of silent oct4 pluripotency gene by combining designer TALEs and inhibition of epigenetic modifiers.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5368-5377 (2012).</li>
<li>Valton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+TALE+DNA+binding+domain+sensitivity+to+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Overcoming TALE DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation.</a> J. Biol. Chem. 287, 38427-38432 (2012).</li>
<li>Cradick, T. J., Ambrosini, G., Iseli, C., Bucher, P., McCaffrey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN-Site+searches+genomes+for+zinc+finger+nuclease+target+sites+and+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">ZFN-Site searches genomes for zinc finger nuclease target sites and off-target sites.</a> BMC Bioinform. 12, (2011).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40, 117-122 (2012).</li>
<li>Byers, S. L., Payson, S. J., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+ten+inbred+mouse+strains+following+assisted+reproductive+technologies+%28ARTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs).</a> Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).</li>
<li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22International+Society+for+Transgenic+Technologies.+Advanced+protocols+for+animal+transgenesis+%3A+an+ISTT+manual%22">International Society for Transgenic Technologies. Advanced protocols for animal transgenesis : an ISTT manual</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Designer-nuclease gedreven genoom bewerken benaderingen zijn aanzienlijk uitgebreid het aantal soorten vatbaar zijn voor gerichte aanpassingen van hun respectieve genomen 10,12. Bij muizen, heeft-gen-targeting in ES-cellen een standaard techniek voor meer dan twee decennia; echter is het moeilijk aan te passen ES cellen uit andere soorten dan de muis aangetoond, hoewel er recente succes in ratten ES-cellen is. Zelfs met de beschikbaarheid van &quot;off-the-shelf&quot;-gen gerichte muis ES-cel klonen die door consortia, zoals EUCOMM, KOMP of NorCOMM 3 genoom uitgeven door ZFN en TALEN biedt een hogere precisie en flexibiliteit met betrekking tot het spectrum van aanpassingen die kunnen worden ingebracht in het muis genoom. Oprichter dieren dragen nuclease gemedieerde mutaties lijken sterk kiem-lijn bevoegde 4-6,20,21, wat niet altijd het geval voor chimaera afkomstig van blastocyst injecties van ES-cellen zijn. In bepaalde gevallen micro-injectie van designer nucleases kan resulteren in aanzienlijk sneller genereren van nieuwe muis lijnen met gerichte genoom wijzigingen. De succesvolle productie van knockout muizen door injectie van ZFN TALEN en hangt in grote mate af van de activiteit van de geïnjecteerde nuclease paar. Talens is aangetoond dat een hoog slagingspercentage hebben gericht op een groot aantal genen in verschillende organismen; Echter, recente studies suggereren dat TALEN binding gevoelig is voor cytosine methylering 30,31. dus nieuw gegenereerde nuclease paren, bijvoorbeeld Talens gekloneerd in pCAG T7-vectoren kunnen worden transiënt getransfecteerd in een muizen cellijn zoals NIH-3T3 of Neuro -2a, die chromatine stand van de muis embryo nabootsen enigszins. Hier kunnen nucleaseactiviteit worden geschat met behulp van de T7 endonuclease assay of een restrictiedigest van PCR-product zoals beschreven in paragraaf 5 voorafgaand aan mRNA-synthese en micro-injectie. Wij raden sequencing van het genoom regio van belang in het respective cellijn en de muis stam gebruikt voor micro-injectie experimenten. In muis zygoten zullen verschillende TALEN of ZFN paren optimaal werken bij verschillende mRNA-concentraties en bijgevolg de optimale werking concentratie van de micro-injectie nuclease mRNA wellicht proefondervindelijk worden bepaald. Afhankelijk van de nuclease pair, zal een te lage concentratie resulteren in geen decollete terwijl een te hoog kan leiden tot embryo letaliteit. Afhankelijk van de nuclease paar, hebben we succes gehad met totale concentraties zo laag als 2 ng / ul en zo hoog als 200 ug / ul mRNA. Deze effecten zijn moeilijk te voorspellen uit experimenten in celkweek en de concentratie nuclease optimaal voor zowel embryo overleving en modificatieverhouding van de doelwitlocus moet empirisch worden bepaald. Zeer actieve ZFN of TALEN kunnen hun doelsequentie aanhangen dan de een-cel stadium van de gemicroinjecteerd embryo en dus leiden tot complexe patronen van mutagenese eend mozaïcisme in oprichters. Wij en anderen 4 hebben drie of meer verschillende gemuteerde allelen in een oprichter (figuur 5C) waargenomen. Dus, als de oprichting van een nieuwe muis lijn van deze oprichters, nakomelingen zorgvuldig worden gescreend door sequencing op de aanwezigheid van de gunstige mutatie sinds de spijsvertering testen leveren bewijs alleen dat een ongedefinieerde mutatie aanwezig is. Een kritiek gehoorde tegen ZFN en TALEN systemen is de mogelijkheid dat deze nucleasen ook in staat splitsen sequenties die ergens anders in het genoom die vergelijkbaar is met de doelplaatsen zijn. Dergelijke off-target effecten zijn waargenomen met de vroege generatie reagentia met de homodimere FokI domein en heterodimer constructen werden ontworpen om off-target effecten 25 verlichten. Potentiële off-target sites kunnen worden voorspeld tot op zekere hoogte in silico 32,33 en gescreend door PCR en sequencing. Een duidelijk voordeel of behulp ZFNs en Talens voor het genereren van muizen in plaats van cellijnen is de mogelijkheid van het verwijderen van de palen mutaties gekoppelde gewenste genoom wijziging door het uitvoeren van verscheidene terugkruisingen naar een wild-type stam keuze. Voor de analyse van een groot aantal oprichter muizen volgende generatie diepe sequencing van PCR-producten gegenereerd uit de nuclease gerichte locus en in silico voorspelde off-target loci kan een alternatieve kwalitatieve en kwantitatieve uitlezing bieden om de destructie analyses van PCR-producten. De kunstmatige voortplantingstechnieken beschreven in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor standaard muis stammen gebruikt voor micro-injectie experimenten zoals C57BL/6J of B6D2F1. Muizen van verschillende oorsprong, zoals outbred stammen, kan in principe worden gebruikt voor het genoom bewerken benaderingen en wellicht een meer geschikte genetische achtergrond voor specifieke onderzoeksvragen te bieden. De prestaties van geassisteerde voortplantingstechnieken zoals superovulatie kan predi zijncted een aantal stammen 34-36 maar kan verdere optimalisatie van afwijkende stammen verlangen bij een voldoende aantal embryo&#39;s te verkrijgen voor nuclease micro-injectie. Naast ZFN en TALEN, hebben nieuwe designer nucleases zoals de RNA-begeleide CRISPR/Cas9 systeem 9,37,38 nu ingevoerd voor genoom toepassingen voor het bewerken. Alle methodes voor micro-injectie en analyse van oprichter dieren die hier worden beschreven zijn ook van toepassing op CRISPR/Cas9 en toekomstige vormen van genoom bewerken.

Muizen zijn veruit de meest populaire platform voor het genereren van transgene diermodellen. De veelzijdige toolbox voor genetische manipulatie van de muis embryo 1-3 is onlangs uitgebreid met genoom bewerken benaderingen op basis van designer nucleases zoals zink finger nucleases (ZFN) 4-6, transcriptie activator-achtige effector nucleases (TALEN) 7,8, en de geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindromische herhalingen (CRISPR) /-CRISPR geassocieerd (CAS) 9 systeem 9. ZFN en TALEN functie als paren van twee speciaal ontworpen eiwit gebaseerde DNA-bindende domeinen (arrays van zinkvinger eiwitten en herhaalde variabele di-residuen (RVDS), respectievelijk) die elk zijn gekoppeld met de FokI endonuclease 10-12. Omgekeerd wordt de specificiteit van Cas9-gemedieerde DNA-splitsing door transactiverende CRISPR RNA (crRNA en tracrRNA, die ook kunnen worden gecombineerd tot een enkel chimeer RNA-molecuul aangeduid lijst RNA) 11 die elk een complex met deCRISPR eiwit. Talens met een gedefinieerde opeenvolging van RVDS kan snel worden gebouwd door individuele onderzoekers met een veelheid van vergadering strategieën te kiezen 13-17. CRISPR/Cas9 belooft nog minder arbeidsintensieve productie van designer nucleasen, maar de specificiteit van de geleider RNA-DNA-binding nog niet volledig opgelost 18,19. Generatie van aangepaste ZFNs is tot nu toe beperkt tot gespecialiseerde academische laboratoria en commerciële leveranciers zoals Sangamo Biosciences en de Sigma CompoZr service. In het algemeen genoom bewerken met designer nucleases wordt beoogd dubbele breuken (DSB) op bepaalde genomische loci, die vervolgens aan te trekken niet-homologe eind mee (NHEJ) of homologe recombinatie (HR) DNA-reparatie machines 10,12. NHEJ gemedieerde reparatie van DSB resulteert vaak in de inleiding van inserties en deleties in de nabijheid van de plaats van reparatie. Zo NHEJ reparatie ceen worden benut voor het uitspelen van de functie van een target-gen door de invoering van een frame-shift mutatie in de genen-eiwit coderende sequentie 4,7,9. Alternatief kan gedefinieerd toevoeging of vervanging van genetische informatie worden bereikt door een DNA-donor samen met de ontwerper nucleasen. Een DNA donor omvat onderzoekers ontworpen DNA-sequenties geflankeerd door gebieden met homologie met de doelwitlocus, dus dienen als een sjabloon voor DSB reparatie door HR. Beide plasmiden 5,6,20 en enkelstrengs oligonucleotiden 8,9,21 zijn met succes gebruikt als donor. Noch NHEJ-nor-HR gemedieerde genoom bewerkt moeten de introductie van een selecteerbare merker in het genoom van de muis embryo, dat deze strategieën bijzonder geschikt voor het maken van kleine veranderingen in de nucleotidesequentie zonder de totale genetische architectuur maakt. In dit protocol beschrijven we alle essentiële voorwaarden voor genoom bewerken in demuis embryo met behulp van Talens. Deze omvatten 1) identificatie van een TALEN target site 22, 2) bouw van Talens door gouden poort klonen 13, 3) in vitro synthese van TALEN mRNA, 4) micro-injectie van TALEN mRNA in bevruchte muis eicellen, 5) chirurgische procedures voor de embryo transfer en 6) analyseren van TALEN geïnduceerde mutagenese in grondlegger dieren. Wij richten ons op TALEN mRNA micro-injectie en screening van oprichters voor NHEJ-geïnduceerde inserties / deleties. Hiervoor hebben we bifunctionele TALEN constructen die zowel expressie in zoogdiercellen uitgevoerd wanneer getransfecteerde plasmiden en in vitro synthese van TALEN mRNA voor micro-injectie in muisembryo&#39;s gegenereerd. Deze constructen omvatten een afgeknotte TALE ruggengraat 23 gefuseerd heterodimere FokI domeinen 24,25 optimale genoom bewerking in zoogdiercellen. Dit protocol kan ook voor micro-injectie van andere designer nucleasen of gecombineerde injecties van ontwerper nucleases worden aangenomenen donor constructies (ontwerp van DNA donoren is in uitstekende technische publicaties beschreven door Wefers et al.. 26,27). Ethische verklaring Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Kantonnale Veterinair Bureau van het kanton Zürich.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S of L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S of L</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe nuclease</td><td>Epicentre</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Spin Columns</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde Load Dye</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA Millennium Markers</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonuclease</td><td>NEB</td><td>M0302S of L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>human chorionic gonadotropin (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 embryo culture medium</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 embryo culture medium</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil, embryo tested</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment/Tools</td></tr><tr><td>Inverted microscope met Nomarski DIC-optica (bijvoorbeeld Nikon Eclipse TE200)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator units (bijvoorbeeld Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryo holding capillaries</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Embryo injection capillaries</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Capillary puller (bijvoorbeeld Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (bijvoorbeeld Narishige MF-900)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton skin scissors</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>Surgical probe</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>Reflex wound clip system (9 mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Reflex wound clips (9 mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont fine forceps 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria curved forceps</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Moria fine forceps</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>Dietrich bulldog clamp</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J muizen</td><td>Jackson Labs</td><td>strain code 000664</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 muizen</td><td>Charles River</td><td>strain code 000664</td><td></td></tr></tbody></table>

mouse genome engineering behulp designer nucleasen

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgene muizen die site-specific genoom modificaties (knockout, knock-in) zijn van vitaal belang voor het ontleden van complexe biologische systemen als voor het modelleren van menselijke ziekten en het testen van therapeutische strategieën. Recente ontwikkelingen in het gebruik van designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens), en geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindromische herhalingen (CRISPR) /-CRISPR geassocieerde (CAS) 9 voor plaatsspecifieke specifieke genoom techniek opent de mogelijkheid om snelle en gerichte genoom modificatie uit te voeren in vrijwel elk laboratorium soorten zonder de noodzaak om vertrouwen op embryonale stamcellen (ES)-technologie. Een genoom bewerken proef begint typisch met identificatie van designer nuclease doelplaatsen binnen een gen van belang, gevolgd door constructie van custom DNA-bindende domeinen nuclease activiteit rechtstreeks aan de onderzoeker bepaalde genomische locus. Ontwerper nuclease plasmiden in vitro &lt;/ Em&gt; getranscribeerd naar mRNA te genereren voor micro-injectie van bevruchte eicellen muis. Hier bieden we een protocol voor het bereiken van gerichte genoom wijziging door directe injectie van TALEN mRNA in bevruchte muis eicellen.

We geconstrueerde plasmiden bestemming verenigbaar met de Gouden GateTALEN samenstel gepubliceerd door Cermak et al.. 13 dat expressie van Talens in zoogdiercellen en in vitro mRNA synthese uit de faag T7 promotor (figuur 1C) mogelijk. Deze plasmiden dragen heterodimere FokI domeinen (ELD of KKR mutaties) die zijn aangetoond off-doeleffecten opzichte FokI homodimeren verminderen en splitsing activiteit te verhogen in vergelijking met de eerste generatie FokI heterodimeren 25,29. Golden schuifelementsamenstel reacties # 1 en # 2 zijn meestal zeer efficiënt en elke witte kolonie, wanneer geanalyseerd door kolonie PCR toont het verwachte patroon voor het specifieke aantal RVDS gekloneerd (Figuren 1B en 1D). Gel-analyse van in vitro gesynthetiseerde mRNA (figuur 2) moet een onderscheiden band met weinig of geen uitstrijk voor ieder monster geanalyseerd onthullen. Er moet een duidelijk formaat verschuiving tussen monsters L1/R1 en L2/R2, L3/R3, die succesvol polyadenylering aangeeft zijn. Grondlegger dieren kunnen worden gescreend NHEJ-geïnduceerde gemuteerde allelen genotypering met behulp van PCR gevolgd door T7 endonuclease digestie (Figuur 3) of restrictie digestie met een enzym dat splitst de wildtype sequentie in het spacergebied van het nuclease paar (figuur 4). De T7 endonuclease test is van toepassing op elke vorm van mutatie, ongeacht de specifieke genomische sequentie in het spacergebied van het nuclease paar geïnjecteerd; echter, het detecteert alleen mismatches tussen DNA-strengen in heteroduplex PCR-producten. Dus, in het zeldzame geval dat een oprichter draagt ​​twee identiek gemuteerde allelen, PCR producten zou geen T7 verteringpatroon tonen. Dergelijke onderscheid is echter altijd mogelijk wanneer een bepaalde restrictieplaats binnen de nuclease spacergebied die worden geëlimineerd door NHEJGeïnduceerde inserties / deleties (Figuur 5). Hier, onverteerd bands wijzen op de aanwezigheid van mutaties, en het ontbreken van enige verteerd producten wijst er sterk op een van de oprichters die mutaties in beide allelen van het beoogde gen (aangeduid met sterretjes in figuur 4b). <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Figuur 1. Golden Gate klonen van TALEN RVDS in heterodimerische pCAG-T7-Destination vectoren. A) Montage van de RVD arrays in pfu vectoren. Hier is een voorbeeld opgenomen voor een TALEN paar met individuele VERHAAL arrays met 15 RVDS en 17 RVDS, respectievelijk (voor VERHAAL arrays langer dan 21 RVDS worden drie pfu-RVDS assemblages vereist, niet afgebeeld). Pijlen geven primers voor pfu-specifieke kolonie-PCR reacties. B) PCR-productengeamplificeerd uit juiste pfu samenstellingen vertonen doorgaans een band die overeenkomt met de gecombineerde lengte van alle RVDS gekloneerd (bijv. ongeveer 1,1 kb 10 RVDS) en een &quot;ladder&quot; kleinere minder duidelijke banden vanwege het repetitieve aard van RVD arrays. C) eindmontage van pfu-RVD arrays en een plasmide dat de laatste herhaling (PLR) in heterodimerische TALEN expressie vectoren met FokIELD en FokIKKR varianten, respectievelijk. De TALEN backbone (geannoteerd als N-en C) lijkt de architectuur gepubliceerd door Miller et al.. 23 CAG (CMV vroege enhancer element / chicken beta-actine) promoter zorgt voor een hoge expressie niveaus in getransfecteerde zoogdiercellen, terwijl de faag T7-promotor kan in vitro synthese van mRNA (gebruik Sacl voor linearisatie van de vector stroomafwaarts van de nuclease STOP codon). D) Colony PCR met behulp van primers aangegeven met pijlen in C) maakt de identificatie van correct gemonteerd Talens. Full-length PCR-producten zijn vaak minder opvallend, terwijl de &quot;ladder effect&quot; is een robuuste indicator van succesvolle vergadering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> Figuur 2. . Kwaliteitscontrole van nuclease mRNA in vitro synthese onder toepassing van agarosegelelektroforese worden ZFN mRNA als voorbeeld weergegeven (L, links ZFN, R, rechts ZFN). Monsters L1/R1 mRNA tonen voorafgaand aan polyadenylering, monsters L2/R2 tonen gepolyadenyleerde mRNA en L3/R3 tonen gezuiverd gepolyadenyleerd mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img<html> alt = &quot;Figuur 3&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figuur 3. Voorbeeld van een T7 endonuclease test gebruikt voor de identificatie van de oprichter van dieren uitvoeren nuclease-geïnduceerde mutaties van de doelwitlocus. A) Een TALEN paar werd ontworpen om te splitsen in het coderende gebied van de muis prion eiwit gen (PRNP, kan TALEN doelsequentie worden verstrekt op aanvraag). Een PCR-product gegenereerd met een voorwaartse primer (F) gelegen 110 bp stroomopwaarts en een reverse primer (R) 250 bp stroomafwaarts van de TALEN splitsingsplaats. B) Het PCR-product wordt vervolgens onderworpen aan vorming en T7 endonuclease heteroduplex. C) TALEN geïnduceerde mutagenese in het beoogde genomische regio enkele stichters blijkt uit de aanwezigheid van een volledige lengte PCR product met digestieproducten van 250 en 110 bp.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor grotere afbeelding. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> Figuur 4. Voorbeeld van een restrictiedigest van PCR-producten die worden gebruikt voor de identificatie van de oprichter van dieren uitvoeren nuclease-geïnduceerde mutaties van de doelwitlocus. ZFN specifiek voor de muis Rosa26 locus 29 doel een Xbal restrictieplaats binnen intron 1. A) Founders werden gescreend door genotypering van PCR met behulp van een voorwaartse primer (F) op 500 bp stroomopwaarts en een reverse primer (R) 250 bp stroomafwaarts van de splitsings-plaats. B) Spijsvertering van PCR-producten met Xbal onthult digestiepatronen aangeeft muizen met bi-allele mutaties (gemarkeerd met sterretjes), mono -allele mutaties (verteerd en onverteerde bands, bijvoorbeeld dier 2)en wt muizen (volledige spijsvertering, bijv. dier 21). C) Sequencing van muizen met potentiële bi-allele wijzigingen toont tot 3 (dier 24) onderscheiden inserties / deleties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Naam van Primer </td><td> Sequentie 5 &#39;naar 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Sequenties van primers die voor kolonie PCR en sequencing binnen de Golden Gate TALEN montageprotocol. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plasmide / Collectie </td><td> Inzender </td><td> Addgene ID </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN en TAL Effector Kit 2.0 </td><td> Voytas lab </td><td> 1000000024 </td><td> Bevat alle plasmiden die nodig zijn voor het Golden Gate TALEN montage </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD bestemming vectoren </td><td> Pelczar lab </td><td> 40131, 40132 </td><td> Add-on plasmiden voor TALEN expressie in zoogdiercellen en in vitro mRNA-synthese </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Plasmiden en plasmide collecties nodig voor Golden Gate TALEN montage kan worden verkregen bij Addgene ( <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> OnlineHulpbron </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Ontwerp van TALEN; TALEN off-target voorspelling </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Ontwerp van TALEN, OPEN ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Ontwerp van TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 off-target voorspelling </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Assemblage van TALEN sequenties voor de bevestiging van sequencing resultaten </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Ontwerp van modulaire opbouw ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Ontwerp van modulaire opbouw ZFN </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Online bronnen voor het ontwerpen ZFN, TALEN, en CRISPR/Cas9. </sTrong&gt;

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo&#39;s wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Het algemene doel van deze procedure is om snel gendeficiënte muizen te genereren met behulp van designer-staartnucleasen of talons. Dit wordt bereikt door eerst DNA-constructen te ontwerpen en samen te stellen die coderen voor specifieke talonparen, die dienen als sjablonen voor in vitro transcriptie om Talon-mRNA's te genereren. De volgende stappen van de procedure zijn het isoleren van bevruchte muiscyten en vervolgens deze micro-injecteren met de T. De laatste stap is om de geïnjecteerde cyten chirurgisch over te dragen naar de pseudo-zwangere draagmoeders.De resulterende F nul nakomelingen vertonen vaak locatiespecifieke deleties van genomische sequenties die vaak leiden tot het verlies van de doelgenfunctie. Hoewel de hier gepresenteerde methode inzicht kan geven in genfunctie bij muizen, kan de basisbenadering ook worden aangepast aan andere modelorganismen zoals ratten en vissen. Eerst, bezoek de TAL effector nucleotide targeter website op de site.Kies het TN targeter programma en plak de sequentie van het doelgen. Voor dit protocol. Gebruik de P-C-A-G-T zeven TALEN expressieconstructen en de golden gate Talen en T effector kit die beschikbaar zijn op ad gene.Als andere constructen of assemblagekits worden gebruikt voor Talen-assemblage, kunnen de instellingen voor de optimale spacerlengte en het aantal staart RV's anders zijn. Kies de Miller Etal 2011 optie onder het gebruik van een voorinstelling architectuurinstelling. Selecteer vervolgens NN onder het G vervangen tabblad. Het programma genereert een tekstbestand met potentiële doelsites gegenereerd uit deze lijst.Selecteer de vereiste Talen-paar of -paren en ga door met de Golden gate-assemblage. Dit protocol werkt met de meest gebruikte laboratoriummuisstammen, inclusief C 57 BL zes J en BDF een super ovulate 10 donorvrouwtjes op vier weken leeftijd met behulp van een intraperitoneale injectie van vijf eenheden van zwanger merrie serum gonadotrofine. 48 uur later geef de vrouwtjes vijf eenheden van humaan choriongonadotrofine ook door intraperitoneale injectie onmiddellijk na de humaan choriongonadotrofine injectie, mate de vrouwtjes een-op-een met paringsleeftijdsmannen op dezelfde dag, bereid de pseudo-zwangere draagmoeders voor.Andere.De volgende ochtend, offer de vrouwtjes op en herstel de bevruchte eicellen door de ucts te dissecteren. Laat vervolgens de oöcytklompen los in een orgaancultuurbakje met een milliliter M twee medium. Verwijder alle cumuluscellen door 10 microliters van 0,1% bovien hyaluronidase-oplossing toe te voegen aan een bakje met cyteklompen in M twee medium.Gebruik vervolgens de mondpipet om de embryo's door twee of drie veranderingen van M twee medium te spoelen om de hyaluronidase te verwijderen. Ga door met de hyaluronidase-behandeling voor embryo's die nog niet zijn losgekomen van cumuluscellen. De geïsoleerde embryo's kunnen worden bewaard in M 16 medium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat ze worden geïnjecteerd.Bereid 100 microliters injectieoplossing voor die 10 nanogram per microliter van elk staart bevat. Nuclease, mRNA, paar en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 30.000 G om te pelleten. Eventuele deeltjes die de injectienaalden kunnen verstoppen.Bewaar vervolgens het mengsel op ijs. Plan om de oöcyten te injecteren in hun pronucleaire fase in de vroege middag. Dompel ongeveer 100 embryo's onder in M twee medium onder een laag minerale olie en werk aan een omgekeerd microscoop met geen marsy DIC-optica.Onder 20 x vergroting, selecteer cyten met duidelijke pronuclei. Sorteren van oöcyten kan worden gedaan met behulp van een lege injectiecapillair. Laad het injectiecapillair net voordat het wordt gebruikt met een tot twee microliters van de injectieoplossing. Bevestig het vervolgens aan het micro-injectiehoofd.Zuig vervolgens een geselecteerde cyte aan met een houdende capillair en maak een ondiepe injectie van het nuclease mRNA in het cytoplasma. Vermijd contact met de pronuclei. Het injectievolume moet laag worden gehouden.Bij het eerste teken van cytoplasmatische verwijding, trek de naald terug. Normaal gesproken zou ongeveer 80 tot 90% van de embryo's moeten overleven zonder onmiddellijk. Om de hoeveelheid geïnjecteerd mRNA te verhogen, maak de oplossing meer geconcentreerd na micro-injectie van de beschikbare cyten.Breng ze over in M 16 media met behulp van een mondpipet. Incubeer de embryo's gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng vervolgens degenen die overleven over naar pseudo-zwangere draagmoeders.De dag voor de micro-injectie induceer pseudozwangerschap bij drie tot zes maanden oude CD een vrouwelijke muizen door ze te laten paren met VAs sectoriseerde mannetjes. De volgende ochtend selecteer vrouwtjes met een duidelijke atorische plug om als embryo-ontvangers te gebruiken. Ongebruikte vrouwtjes zullen binnen drie weken terugkeren van hun pseudo-zwangere toestand en kunnen daarna opnieuw worden gebruikt.Plaats een verdoofde draagmoeder vrouw op haar buik over een warm oppervlak. Desinfecteer vervolgens het gebied van de incisie door erop te sproeien met 70% ethanol. Kam het natte haar weg van de geplande incisieplaats.Snij nu de buikholte open met schaar en breng het baarmoederhoorn naar buiten. Om dit te doen. Trek aan het vetkussen dat aan de eierstok is bevestigd en immobiliseer de voortplantingsorganen met een bulldogklem.Zorg er ook voor dat de organen vochtig worden gehouden met verwarmde 0,9% natriumchloride-oplossing. Op dit punt, sorteer 12 tot 20 levensvatbare embryo's en laad ze in een dunne glazen capillair. Gebruik de mondpipet eerst om een kleine luchtbel aan te zuigen, trek vervolgens de embryo's aan met behulp van fijne tang.Grijp voorzichtig de UCT net stroomopwaarts van de amp en maak een klein gaatje in de UCT-wand met een 30 gauge naald. Breng de geladen capillair in het gat en blaas de embryo's voorzichtig naar buiten in de amp totdat u ziet dat de luchtbel uit de capillair is verplaatst. Verwijder vervolgens

mouse-genome-engineering-using-designer-nucleases

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De CompoZr Custom Zink-vinger Nuclease (ZFN) Service maakt een nauwkeurige genoom bewerken in een organisme of cel lijn op elk locus bepaald door de gebruiker. In dit artikel beschrijft het proces voor het ontwerp, de fabricage, validatie en implementatie van de CompoZr Custom ZFN Service.

Genoom bewerken met CompoZr Custom Zinc Finger Nucleasen (ZFNs)

CRISPR/Cas9 is een robuust systeem om genen en genetische elementen te onderbreken. Hier beschrijven we een protocol voor het efficiënt creëren van genomische deleties in zoogdiercellijnen met behulp van CRISPR/Cas9.

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Het huidige protocol beschrijft zygote micro-injectie van CRISPR-Cas9 en donor-DNA om efficiënt gencassette knock-in en floxed muizen te produceren.

Zygote micro-injectie voor het maken van gencassette knock-in en flox-allelen bij muizen

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

De efficiëntie van de Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD)-methode is vergelijkbaar met traditionele micro-injectie, waarbij zygoten moeten worden verzameld bij donorvrouwtjes en moeten worden overgedragen aan pseudo-zwangere vrouwtjes. Dit protocol demonstreert zijn effectiviteit door CRISPR/Cas9-geïnduceerde mutaties te introduceren in de ROSA26-locus op chromosoom 6.

Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

Experimentele benaderingen van Tissue Engineering

Leer genetische modificatie van muizen met behulp van TALENs voor gerichte genoombewerking. Deze methode omvat micro-injectie van bevruchte eicellen en overdracht naar pleegmoeders om genfunctie te bestuderen.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

Meer video's verkennen