Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen
2 april 2014
Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.
Het algemene doel van deze procedure is om snel gendeficiënte muizen te genereren met behulp van designer-staartnucleasen of talons. Dit wordt bereikt door eerst DNA-constructen te ontwerpen en samen te stellen die coderen voor specifieke talonparen, die dienen als sjablonen voor in vitro transcriptie om Talon-mRNA's te genereren. De volgende stappen van de procedure zijn het isoleren van bevruchte muiscyten en vervolgens deze micro-injecteren met de T. De laatste stap is om de geïnjecteerde cyten chirurgisch over te dragen naar de pseudo-zwangere draagmoeders.
De resulterende F nul nakomelingen vertonen vaak locatiespecifieke deleties van genomische sequenties die vaak leiden tot het verlies van de doelgenfunctie. Hoewel de hier gepresenteerde methode inzicht kan geven in genfunctie bij muizen, kan de basisbenadering ook worden aangepast aan andere modelorganismen zoals ratten en vissen. Eerst, bezoek de TAL effector nucleotide targeter website op de site.
Kies het TN targeter programma en plak de sequentie van het doelgen. Voor dit protocol. Gebruik de P-C-A-G-T zeven TALEN expressieconstructen en de golden gate Talen en T effector kit die beschikbaar zijn op ad gene.
Als andere constructen of assemblagekits worden gebruikt voor Talen-assemblage, kunnen de instellingen voor de optimale spacerlengte en het aantal staart RV's anders zijn. Kies de Miller Etal 2011 optie onder het gebruik van een voorinstelling architectuurinstelling. Selecteer vervolgens NN onder het G vervangen tabblad. Het programma genereert een tekstbestand met potentiële doelsites gegenereerd uit deze lijst.
Selecteer de vereiste Talen-paar of -paren en ga door met de Golden gate-assemblage. Dit protocol werkt met de meest gebruikte laboratoriummuisstammen, inclusief C 57 BL zes J en BDF een super ovulate 10 donorvrouwtjes op vier weken leeftijd met behulp van een intraperitoneale injectie van vijf eenheden van zwanger merrie serum gonadotrofine. 48 uur later geef de vrouwtjes vijf eenheden van humaan choriongonadotrofine ook door intraperitoneale injectie onmiddellijk na de humaan choriongonadotrofine injectie, mate de vrouwtjes een-op-een met paringsleeftijdsmannen op dezelfde dag, bereid de pseudo-zwangere draagmoeders voor.Andere.
De volgende ochtend, offer de vrouwtjes op en herstel de bevruchte eicellen door de ucts te dissecteren. Laat vervolgens de oöcytklompen los in een orgaancultuurbakje met een milliliter M twee medium. Verwijder alle cumuluscellen door 10 microliters van 0,1% bovien hyaluronidase-oplossing toe te voegen aan een bakje met cyteklompen in M twee medium.
Gebruik vervolgens de mondpipet om de embryo's door twee of drie veranderingen van M twee medium te spoelen om de hyaluronidase te verwijderen. Ga door met de hyaluronidase-behandeling voor embryo's die nog niet zijn losgekomen van cumuluscellen. De geïsoleerde embryo's kunnen worden bewaard in M 16 medium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat ze worden geïnjecteerd.
Bereid 100 microliters injectieoplossing voor die 10 nanogram per microliter van elk staart bevat. Nuclease, mRNA, paar en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 30.000 G om te pelleten. Eventuele deeltjes die de injectienaalden kunnen verstoppen.
Bewaar vervolgens het mengsel op ijs. Plan om de oöcyten te injecteren in hun pronucleaire fase in de vroege middag. Dompel ongeveer 100 embryo's onder in M twee medium onder een laag minerale olie en werk aan een omgekeerd microscoop met geen marsy DIC-optica.
Onder 20 x vergroting, selecteer cyten met duidelijke pronuclei. Sorteren van oöcyten kan worden gedaan met behulp van een lege injectiecapillair. Laad het injectiecapillair net voordat het wordt gebruikt met een tot twee microliters van de injectieoplossing. Bevestig het vervolgens aan het micro-injectiehoofd.
Zuig vervolgens een geselecteerde cyte aan met een houdende capillair en maak een ondiepe injectie van het nuclease mRNA in het cytoplasma. Vermijd contact met de pronuclei. Het injectievolume moet laag worden gehouden.
Bij het eerste teken van cytoplasmatische verwijding, trek de naald terug. Normaal gesproken zou ongeveer 80 tot 90% van de embryo's moeten overleven zonder onmiddellijk. Om de hoeveelheid geïnjecteerd mRNA te verhogen, maak de oplossing meer geconcentreerd na micro-injectie van de beschikbare cyten.
Breng ze over in M 16 media met behulp van een mondpipet. Incubeer de embryo's gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng vervolgens degenen die overleven over naar pseudo-zwangere draagmoeders.
De dag voor de micro-injectie induceer pseudozwangerschap bij drie tot zes maanden oude CD een vrouwelijke muizen door ze te laten paren met VAs sectoriseerde mannetjes. De volgende ochtend selecteer vrouwtjes met een duidelijke atorische plug om als embryo-ontvangers te gebruiken. Ongebruikte vrouwtjes zullen binnen drie weken terugkeren van hun pseudo-zwangere toestand en kunnen daarna opnieuw worden gebruikt.
Plaats een verdoofde draagmoeder vrouw op haar buik over een warm oppervlak. Desinfecteer vervolgens het gebied van de incisie door erop te sproeien met 70% ethanol. Kam het natte haar weg van de geplande incisieplaats.
Snij nu de buikholte open met schaar en breng het baarmoederhoorn naar buiten. Om dit te doen. Trek aan het vetkussen dat aan de eierstok is bevestigd en immobiliseer de voortplantingsorganen met een bulldogklem.
Zorg er ook voor dat de organen vochtig worden gehouden met verwarmde 0,9% natriumchloride-oplossing. Op dit punt, sorteer 12 tot 20 levensvatbare embryo's en laad ze in een dunne glazen capillair. Gebruik de mondpipet eerst om een kleine luchtbel aan te zuigen, trek vervolgens de embryo's aan met behulp van fijne tang.
Grijp voorzichtig de UCT net stroomopwaarts van de amp en maak een klein gaatje in de UCT-wand met een 30 gauge naald. Breng de geladen capillair in het gat en blaas de embryo's voorzichtig naar buiten in de amp totdat u ziet dat de luchtbel uit de capillair is verplaatst. Verwijder vervolgens
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van gen-deficiente muizen met behulp van designer nucleasen zoals TALENs. De procedure omvat het ontwerpen van TALEN-constructen, het micro-injecteren van bevruchte eicellen en het overbrengen ervan naar draagmoeders, wat leidt tot nauwkeurige genetische modificaties.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetische manipulatie
- Muismodellen
- Transgene technologie
Achtergrond
- Designer nucleasen maken gerichte genoombewerking mogelijk.
- TALENs zijn een type designer nuclease dat in dit proces wordt gebruikt.
- Muis-preimplantatie-embryo's zijn een veelgebruikt model voor genetische studies.
- Het begrijpen van genfunctie is cruciaal voor biologisch onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een snelle methode te ontwikkelen voor het genereren van gen-deficiente muizen.
- Om TALENs te gebruiken voor nauwkeurige genetische modificaties.
- Om inzichten te verkrijgen in genfunctie en de implicaties daarvan.
Gebruikte methoden
- Ontwerpen en samenstellen van TALEN-constructen.
- Micro-injecteren van TALEN mRNA in bevruchte muizen-eicellen.
- Overbrengen van geïnjecteerde eicellen naar pseudo zwangere draagmoeders.
- Monitoren van de overleving en ontwikkeling van embryo's.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van gen-deficiente muizen met locatie-specifieke deleties.
- Hoge overlevingskans van embryo's na micro-injectie.
- Aanpasbaarheid van de methode voor andere modelorganismen.
- Inzichten verkregen in genfunctie door gerichte modificaties.
Conclusies
- De TALEN-gebaseerde methode is effectief voor het genereren van genetisch gemodificeerde muizen.
- Deze aanpak kan de begrip van genfunctie verbeteren.
- Mogelijke toepassingen strekken zich uit tot andere soorten dan alleen muizen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Designer nuclease-driven genome engineering in mice enables rapid, precise modeling of gene function and disease mechanisms, directly supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The ability to generate knockout and knock-in models without embryonic stem cell technology accelerates hypothesis testing and portfolio triage. This approach enhances predictive confidence for translational research and supports risk-adjusted advancement decisions across therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function through targeted knockout or knock-in mouse models.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene-disease relationships in vivo.
- Facilitates rapid hypothesis testing for target validation and prioritization.
- Provides a scalable platform for functional genomics studies across multiple targets.
Screening & Assay Development
- Generates validated biological systems for downstream phenotypic screening and assay development.
- Delivers reproducible, quantitative genetic modifications for robust assay standardization.
- Enables screening of compound effects in genetically defined backgrounds.
- Supports platform reuse for multiple gene targets and disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease genetics for improved translational relevance.
- Enables biomarker discovery and validation in genetically engineered mouse models.
- Supports continuity from early discovery through preclinical efficacy and safety studies.
- Reduces translational risk by providing mechanistically relevant in vivo data.
Pipeline & Workflow Integration
This genome engineering method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development, enabling seamless progression from hypothesis generation to in vivo functional testing.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene function studies and pathway analysis.
- Screening: Provides genetically defined models for reproducible, quantitative phenotypic assays.
- Analytics: Enables PCR-based and enzymatic assays for precise detection of genome edits and functional outcomes.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by modeling human disease mutations in mice.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for diverse gene targets and model organisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by enabling rapid model generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclease design, embryo manipulation, and molecular genotyping.
- Demands access to microinjection instrumentation and validated analytical assays (PCR, enzymatic digestion, sequencing).
- Necessitates cross-team standardization for construct design, injection protocols, and genotyping workflows.
- Adaptable to various mouse strains and potentially other model organisms with protocol optimization.
- Limitations include potential mosaicism and the need for rigorous founder screening and validation.
