Name: Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren van coderend en niet-coderend RNA uit varkensvolbloed met globine-reductie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar gastheer-pathogeen interacties en genomica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd vooral ondersteund door de door USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, en gedeeltelijk door NIFA AFRI 2015-67015-23216 van de USDA. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een afspraak aan de landbouw onderzoek onderzoek deelname serviceprogramma beheerd door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs (ORISE) door een interdepartementale overeenkomst tussen de ons Department of Energy ( DOE) en het Amerikaanse ministerie van landbouw. ORISE wordt beheerd door Oak Ridge Associated Universities DOE arbeidsovereenkomst niet. DE-AC05-06OR2310.
We zouden graag bedanken Dr Kay Faaberg voor de besmettelijke klonen van HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier voor haar hulp bij dieren die betrokken zijn bij het experiment, en Sue Ohlendorf voor secretariële assistentie ter voorbereiding van het manuscript.

<ol><li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq%3A+challenges+and+strategies+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li>
<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf">ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf</a> (2015).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf">http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf</a> (2007).</li>
<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
<li>New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.
Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in dit artikel is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het U.S. Department of Agriculture. USDA is een aanbieder van gelijke kansen en de werkgever.

De eerste kritieke stap in het protocol dat het geoptimaliseerd maakte opgenomen de toegevoegde globine uitputting stappen, waardoor het mogelijk is om kwaliteit leest van volbloed monsters. Een van de grootste beperkingen op het gebruik van volbloed in sequencing studies zijn het hoge aantal leest in de steekproef die zal toewijzen aan globine moleculen en verminderen de leest die naar andere moleculen van belang18 verwijzen kunnen. Daarom, in het optimaliseren van het protocol voor onze steekpro...

Volgende generatie sequencing (NGS) heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van de veranderingen die zich op het genomisch niveau van biologische organismen voordoen. Bereiding van de monsters voor NGS methoden kan gevarieerd worden afhankelijk van het organisme, weefseltype, en wat nog belangrijker is het vragen de onderzoekers graag adres. Vele studies hebben aan NGS gedraaid als een middel van het bestuderen van de verschillen in genuitdrukking tussen staten zoals gezonde en zieke personen1,,2,,3,4. De sequencing nemen plaats op basis van de hele genoom en laat een onderzoeker te vangen de meeste, zoniet alle, genomische informatie voor een bepaalde genetische marker tegelijkertijd wijs.
De meest voorkomende markeringen van meningsuiting waargenomen zijn de messenger RNAs (mRNAs). De meest gebruikte procedures voor prepping bibliotheken voor RNA-seq zijn geoptimaliseerd voor het herstel van mRNA moleculen door middel van een reeks van zuivering, breukpatroon en ligations5,6. Echter afhankelijk het besluit over de wijze waarop een protocol worden uitgevoerd sterk van het type van de steekproef en de vragen over het genoemde monster. In de meeste gevallen wordt de totale RNA geëxtraheerd; echter niet alle RNA-moleculen zijn van belang en in gevallen zoals mRNA expressie studies al te overvloedige RNA-soorten, zoals ribosomaal RNAs (rRNA) moet worden verwijderd om het aantal detecteerbare afschriften die is gekoppeld aan de mRNAs verhogen. De meest populaire en meest gebruikte methode voor het verwijderen van de overvloedige rRNA moleculen is de vermindering van de polyadenylated RNA afschriften polyA uitputting7hierna. Deze aanpak werkt goed voor de analyse van mRNA uitdrukking zoals doet geen afbreuk aan de transcripten van mRNA. Echter in studies die geïnteresseerd zijn in niet-coderende of virale RNAs polyA uitputting verwijdert u ook deze moleculen.
Veel studies verkiezen te concentreren op de RNA reeks bibliotheek voorbereiding om te onderzoeken of mRNA uitdrukking (coderen) of een bepaalde categorie van kleine of grote niet-coderende RNA. Hoewel er andere procedures8 als de onze die het mogelijk voor de bereiding van de monsters van de dual maken, bereiden veel studies bibliotheken van afzonderlijke monsters voor afzonderlijke studies beschikbaar. Voor een studie als de onze, zou dit normaal gesproken meerdere bloedmonsters stijgende tijd, verbruiksartikelen, en dieren stress vereisen. Het doel van deze studie was om het gebruik van bloed van dieren te identificeren en kwantificeren van de verschillende klassen van beide mRNA te kunnen en niet-coderende RNA uitgesproken tussen gezonde en hoogpathogene varkens reproductieve en respiratoir syndroom virus (HP-PRRSV) uitgedaagd varkens9,10 ondanks het feit dat slechts een enkele volbloed steekproef (2,5 mL) van elk varken. Om dit te doen, die we nodig hadden om de typische extractie en bibliotheek creatie protocollen voor het genereren van de juiste gegevens te voorzien van analyse van mRNA zowel niet-coderende RNA (ncRNA) expressie11 van één sample te optimaliseren.
Dit leidde tot een behoefte aan een protocol dat is toegestaan voor mRNA en analyse van niet-coderende RNA omdat de beschikbare standaard kits en de methoden voor RNA-extractie en bibliotheek creëren bestemd waren voornamelijk voor mRNA en gebruik een poly-A uitputting stap12. Deze stap zou hebben gemaakt het onmogelijk om te herstellen van niet-coderende RNA of virale afschriften uit het monster. Dus, een geoptimaliseerde methode nodig was dat toegestaan voor totale RNA extractie zonder monster polyA uitputting. De methode voorgesteld in dit manuscript is geoptimaliseerd voor het gebruik van volbloed als een monster type toestaan en sequencing bibliotheken te bouwen voor zowel mRNA en ncRNAs voor kleine en grote maten. De methode is geoptimaliseerd om te voorzien in de analyse van alle aantoonbaar niet-coderende RNAs evenals virale RNAs voor later onderzoek13behouden. In alle zorgt ons geoptimaliseerde bibliotheek voorbereiding protocol voor het onderzoek van meerdere RNA-moleculen uit een monster van één volbloed.
Het algehele doel achter het gebruik van deze methode was een proces dat is toegestaan voor de collectie van zowel niet-coderende RNA en mRNA uit één monster van volbloed te ontwikkelen. Daardoor kunnen we in onze studie afkomstig uit een monster9mRNA, ncRNA, en virale RNA voor elk dier hebben. Dit, uiteindelijk zorgt voor meer wetenschappelijke ontdekking zonder dierlijke meerkosten en geeft een completer beeld van de expressie van elk individuele monster. De beschreven methode geschikt is voor het onderzoek van de regelgevers van genexpressie, alsook het zodat voor voltooiing van oereenstemming studies vergelijken beide mRNA en niet-coderende RNA expressie met behulp van een enkel geheel bloedmonster. Onze studie gebruikt dit protocol te onderzoeken van de wijzigingen in genexpressie en mogelijk epigenetische regelgevers in viraal geïnfecteerde 9 - weken oude mannelijke commerciële varkens.

<table><tbody><tr><td>PAXgene Tubes</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Water</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Clean Up Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL thin-walled tubes</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-well Thermocycler</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&alpha; 1)</td><td>Any supplier</td><td></td><td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&alpha; 2)</td><td>Any supplier</td><td></td><td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&beta; 1)</td><td>Any supplier</td><td></td><td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&beta; 2)</td><td>Any supplier</td><td></td><td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td></tr><tr><td>10X Oligo Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-Tris-HCl, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>-KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNase H Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Tris-HCl, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Molecular Biology Grade Water</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>Rnase inhibitor</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA&nbsp; Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&nbsp; (48 samples, 12 indexes)</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td><td>Illumina</td><td></td><td>Available on-line</td></tr><tr><td>RNAClean XP Beads</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-tube Strip</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>0.2 ml thin-walled tubes</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase - free reagent reservoirs</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96 well plates</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>These were used in place of .3mL plates as needed</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical adhesive film</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&reg; (Set 1)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E73005</td><td>small RNA kit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&reg; (Set 2)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E75805</td><td>small RNA kit</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S Super Magnet Plate</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van de codering en niet-coderende rna klassen uitgedrukt in varkens volbloed

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

De komst van innovatieve en steeds meer krachtige volgende generatie sequencing technieken heeft nieuwe wegen geopend in de mogelijkheid te onderzoeken van de onderliggende genexpressie gerelateerde biologische processen van belang. Deze innovaties kunnen niet alleen onderzoekers te observeren-expressie aan vanaf het mRNA-sequenties die voor de genen die cellulaire functie effect code, maar ook de niet-coderende (ncRNA) molecules van RNA die onvertaald, maar toch blijven hebben regelgevende taken. Hoewel onderzoekers de mogelijkheid hebben om zowel ncRNA als mRNA uitdrukking te observeren, is het gebruikelijk dat een studie te richten op de ene of de andere geweest. Als echter studies zijn zowel ncRNA als mRNA uitdrukking kochten, vele malen ze gebruiken afzonderlijke monsters te onderzoeken niet-coderende RNAs vanwege het verschil in bibliotheek preparaten of codering. Dit kan leiden tot de noodzaak van meer monsters die tijd, verbruiksartikelen en dieren stress kan verhogen. Bovendien kan het onderzoekers om te beslissen voor te bereiden op monsters slechts één analyse, meestal de mRNA, beperking van het aantal biologische vragen die kunnen worden onderzocht. Echter omspannen ncRNAs meerdere klassen met regelgevende functies die effect mRNA uitdrukking. Omdat ncRNA zijn belangrijk voor fundamentele biologische processen en wanorde van deze processen in tijdens de infectie, kunnen ze daarom aantrekkelijk dedoelenvoorde therapeutics doen. Dit manuscript toont een gewijzigd protocol voor de generatie mRNA en niet-coderende RNA expressie bibliotheken, met inbegrip van de virale RNA, van een enkel bloedmonster geheel. Optimalisatie van dit protocol, verbeterd RNA zuiverheid, verhoogd afbinding voor herstel van gemethyleerd RNAs en maat keuze, zodat de vangst van de meer RNA soorten weggelaten.

De representatieve monsters als in onze studie zijn de globine en geheel bloedmonsters ribo-uitgeput. De representatieve resultaten van het protocol bestaat uit een globine verarmd bibliotheek monster met een RNA integriteit nummer (RIN) boven 7 (Figuur 1een) en 260/280 nm concentratie ratio's op of boven 2 (Figuur 1b en 1 c). Validatie van de resultaten van de steekproef is uitgevoerd met behulp...

Hier presenteren we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de verwerking van codering (mRNA) en niet-coderende (ncRNA) globine verminderd RNA-seq bibliotheken uit een monster van één volbloed.

Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van gastheer-pathogen interacties door het mogelijk te maken onderzoek van de codering, niet-codering, en virale RNA expressie die betrokken zijn bij de gastheer amino respons, alsmede hoe een ziekteverwekker kan invloed hebben op de biologische functies van de gastheer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het presenteert een protocol geoptimaliseerd voor de verwerking van mRNA en niet-codering RNA uit globine-verminderde RNAseq bibliotheken uit een enkel volledig bloedmonster. Het aantonen van de techniek zal Sarah Anderson zijn, een technicus van mijn laboratorium.Begin met het centrifugeren van de bloedbuizen op 50 20 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Werken in een biologische veiligheidskast, na het verwijderen van de supernatant, voeg acht milliliter RNase-vrij water aan de pellet. Sluit de buizen en vortex de pellet totdat deze zichtbaar is opgelost, dan centrifugeren de buizen op 50 20 keer G gedurende 10 minuten op kamertemperatuur om de pellet te herstellen.Werken in een biologische veiligheidskast, gooi de supernatant weg en red de pellet. Om het totale RNA te isoleren, begin met het pipetteren van 300 microliters lysisbindingsbuffer aan de pellet. Breng na het vortexen het mengsel van elke buis over naar een nieuwe gelabelde 1,5 milliliter centrifugebuis.Voeg 30 microliter homogenaat van de miRNA isolatie kit. Vortex de buizen en plaats op het ijs voor 10 minuten. Werken in een rookkap, verwijder de buizen uit ijs en voeg 300 microliter van het zure fenol chloroform reagens uit de kit en vortex weer te mengen.Na het centrifugeren op 10.000 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, voorzichtig verwijderen waterige fase van een nieuwe buis. Op basis van de hoeveelheid waterig herstel van de vorige stap, voeg 1,25 keer het volume van 100% ethanol toe aan de waterige faag in elke buis en pipet om te mengen. Bereid voor elk monster verse opvangbuizen met een filtercartridge.Pipette ongeveer 675 microliter van het mengsel van lysaat-ethanol op de filtercartridge. Centrifuge kort bij 10.000 keer G om vloeistof door het filter te laten gaan. Gooi de doorstroom weg.Herhaal het mengsel van lysaat-ethanol dat het filter en de centrifugatie toevoegt totdat het volledig is gebruikt. Voeg 700 microliter wasoplossing toe, één van de kit aan de filtercartridge. Centrifuge kort om de oplossing door de filters te trekken.Gooi de doorstroom weg en bewaar dezelfde filtercartridges en opvangbuizen. Voeg 500 microliter wasoplossing twee-drie toe aan elke filtercartridge. Nadat u opnieuw hebt gecentrifugeren, moet u de doorstroom verwijderen en de wasstap herhalen.Als u de resterende vloeistof uit de filtercartridges wilt verwijderen, draait u ze nog eens 60 seconden. Breng de cartridges over op verse inzamelbuizen. Voeg 100 microliter van 95 graden Celsius voorverwarmd nuclease-vrij water toe aan het midden van elke filtercartridge.Centrifugeren de cartridges gedurende ongeveer 20 tot 30 seconden op het tafelblad centrifuge op maximale snelheid. Om hybridisatie voor te vormen met globinereductie oligo's, eerst denatureren het RNA door het toevoegen van elk geëxtraheerd monster in een 0,2 milliliter dunwandige nuclease-vrije reactiebuis. Plaats de buizen in een thermische cycler op 70 graden Celsius gedurende twee minuten.Plaats daarna onmiddellijk de buizen op ijs om een optimale RNA-kwaliteit te verkrijgen. Terwijl de buizen koelen, bereid 400 microliter van 10X globin reductie oligo mix en 10X oligo hybridisatie buffer in een twee milliliter buis. Om de hybridisatie mix te maken, voeg zes microgram RNA monster, twee microliters van de 10X globin reductie oligo mix, een microliter van 10X oligo hybridisatie buffer, en nuclease gratis water aan een laatste volume van 10 microliters aan elke 0,2 milliliter dunwandige, nuclease-vrije reactiebuis.Plaats de buizen in de thermische cycler op 70 graden Celsius gedurende twee minuten. Daarna, onmiddellijk zet de buizen op ijs. Om RNase H-vertering uit te voeren, verdun je eerst 10X RNase H tot één X RNase H met één X RNase H-buffer.Bereid RNase H-reactiemix voor door twee microliter van 10X RNase-buffer, een microliter RNase-remmer en twee microliters van één X RNase H en vijf microliter nuclease-vrij water te combineren tot een totaal volume van 10 microliter. Voeg 10 microliter van de RNase H-reactiemix toe aan de globinreductiehybrideisatiemonsters en meng grondig. Verteren deze reactie op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten en vervolgens afkoelen tot vier graden Celsius.Stop de spijsvertering door een microliter van 0,5 molaire EDTA aan de buis toe te voegen en breng het volledige gehalte aan de buis over naar een verse buis van 1,5 milliliter. Voeg onmiddellijk daarna 80 microliter RNase-vrij water, 350 microliter lysebuffer, dan 250 microliter van 100% ethanol toe aan elke buis en meng goed door pipetting. Breng elk monster van 700 microliter over naar een aparte elutiefiltercartridge die in twee milliliter-inzamelbuis wordt geplaatst om de doorstroom te verzamelen.Centrifugeren gedurende 15 seconden op 8,000 keer G of groter en gooi de flow-through weg. Plaats dezelfde elutiefiltercartridges in nieuwe twee milliliter opvangbuizen. Om de filtercartridgemembranen te wassen, voegt u 500 microliter van de milde wasbuffer toe aan de filtercartridges en centrifuge gedurende 15 seconden bij 8, 000 keer G of meer.Gooi de doorstroom weg. Voeg vervolgens met dezelfde opvangbuizen 500 microliter van 80% ethanol toe aan de filtercartridges. Centrifuge twee minuten op 8.000 keer G en groter.Gooi zowel de flow-through en collectie buizen, en sla de elutie spin kolommen. Plaats elke elution spin kolom in een nieuwe twee milliliter collectie buis. Vijf minuten op volle snelheid centrifugeren met het open deksel op filterpatronen om de spinkolommembranen te drogen en ethanoloverdracht te voorkomen.Na het weggooien van de opvangbuizen plaatst u elke gedroogde filtercartridge in een verse opvangbuis van 1,5 milliliter. Voeg 14 microliter RNase-vrij water direct toe aan het midden van het filtercartridgemembraan. Om het RNA te ontwijken, centrifugeren de buizen gedurende 60 seconden op volle snelheid en ga dan verder met verdere RNA-beoordeling en voorbereiding.Het globine-uitgeputte monster kan nu worden gesplitst en gebruikt om de kleine, niet-codering RNA-bibliotheken voor te bereiden, evenals de ribo-uitgeputte mRNA en lange, niet-coderende RNA-bibliotheken. Na het voorbereiden van expressiebibliotheken van de globine-uitgeputte en ribo-uitgeputte volbloedmonsters met behulp van dit protocol, toonde de samenvatting van de elektroforese bestandsloop een globine-uitgeput bibliotheekmonster met RNA-integriteitsnummers die varieerden van 6,3 tot 9,2. Dit bleek een verbetering ten opzichte van andere studies die globine uitputtingsmethoden gebruikt en waren alleen in staat om RIN nummers te bereiken op of in de buurt van zes.Uit de preglobinereductie en postglobinereductie van één enkel enkel bloedmonster van varkens bleek dat de concentratieverhoudingen van 260 tot 280 nanometer op of boven de twee liggen. Met behulp van dit protocol werden op chips gebaseerde elektroferogrammen van globine- en ribo-uitgeputte mRNA-bibliotheekmonsters verkregen voorafgaand aan het bundelen en sequencing. Voor de mRNA-bibliotheken heeft het representatieve elektropherogram een piek van ongeveer 280 basisparen.Voor de kleine ncRNAs bevatten representatieve chipgebaseerde elektroferogrammen een bereik van pieken van ongeveer 100 tot 400 basisparen. Pieken bij ongeveer 143 basisparen komen overeen met miRNAs, en pieken bij ongeveer 153 basisparen komen overeen met piRNAs. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om ijs buizen onmiddellijk waar opgemerkt.Na deze procedure moeten andere methoden worden uitgevoerd, zoals de volgende generatie sequencing om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals differentiële expressie, epigenetische veranderingen en hun effect op biologische trajecten en processen. Vergeet niet dat het werken met fenol-chloroform reagens uiterst gevaarlijk is en voorzorgsmaatregelen zoals werken in een rookkap moet worden genomen. Ook moet bij de behandeling van volbloed of infectieuze organismen het werk worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast voorafgaand aan een activering van het besmettelijke organisme.

identification-coding-non-coding-rna-classes-expressed-swine-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

RNA-sequencing en bioinformatica analyses werden significant verschillend tot expressie en transcriptiefactoren in Lin-CD34 + en CD34-Lin subpopulaties van muis EMLcells identificeren. Deze transcriptiefactoren kunnen een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de switch tussen zelfvernieuwende Lin-CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerd Lin-CD34-cellen.

Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Epigenetische factoren kunnen communiceren met genetische programma's voor het moduleren van genexpressie en de regulering van de B-cel functie. Door stimulatie van de in vitro B-cel, qRT-PCR, en high-throughput microRNA-sequence en mRNA-sequence benaderingen te combineren, kunnen we analyseren de epigenetische modulatie van miRNA en gen-expressie in B-cellen.

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Nanogaatje sequencing is een nieuwe technologie die het mogelijk maakt kosteneffectieve sequencing in afgelegen locaties en resource-arme instellingen. Hier, presenteren wij een protocol voor het rangschikken van mRNAs van geheel bloed dat met dergelijke voorwaarden compatibel is.

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Hier beschrijven we de immunopreciatie van riosomen en bijbehorend RNA uit geselecteerde populaties volwassen mannelijke muizenkiemcellen met behulp van het RiboTag-systeem. Strategische veredeling en zorgvuldige immunoneerslag resulteren in schone, reproduceerbare resultaten die informeren over het vertalen van de kiemcel en inzicht geven in de mechanismen van gemuteerde fenotypes.

RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Het vertalen van ribosomen decodeert drie nucleotiden per codon in peptiden. Hun beweging langs mRNA, vastgelegd door ribosoomprofilering, produceert de voetafdrukken die karakteristieke triplet periodiciteit vertonen. Dit protocol beschrijft hoe RiboCode te gebruiken om deze prominente functie te ontcijferen uit ribosoomprofileringsgegevens om actief vertaalde open leesframes op het niveau van het hele transcriptoom te identificeren.

De novo Identificatie van actief vertaalde open leesframes met ribosoomprofileringsgegevens

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Leer een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren van coderend en niet-coderend RNA uit varkensvolbloed met globine-reductie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar gastheer-pathogeen interacties en genomica.

Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed

Meer video's verkennen