Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van gastheer-pathogen interacties door het mogelijk te maken onderzoek van de codering, niet-codering, en virale RNA expressie die betrokken zijn bij de gastheer amino respons, alsmede hoe een ziekteverwekker kan invloed hebben op de biologische functies van de gastheer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het presenteert een protocol geoptimaliseerd voor de verwerking van mRNA en niet-codering RNA uit globine-verminderde RNAseq bibliotheken uit een enkel volledig bloedmonster. Het aantonen van de techniek zal Sarah Anderson zijn, een technicus van mijn laboratorium.

Begin met het centrifugeren van de bloedbuizen op 50 20 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Werken in een biologische veiligheidskast, na het verwijderen van de supernatant, voeg acht milliliter RNase-vrij water aan de pellet. Sluit de buizen en vortex de pellet totdat deze zichtbaar is opgelost, dan centrifugeren de buizen op 50 20 keer G gedurende 10 minuten op kamertemperatuur om de pellet te herstellen.

Werken in een biologische veiligheidskast, gooi de supernatant weg en red de pellet. Om het totale RNA te isoleren, begin met het pipetteren van 300 microliters lysisbindingsbuffer aan de pellet. Breng na het vortexen het mengsel van elke buis over naar een nieuwe gelabelde 1,5 milliliter centrifugebuis.

Voeg 30 microliter homogenaat van de miRNA isolatie kit. Vortex de buizen en plaats op het ijs voor 10 minuten. Werken in een rookkap, verwijder de buizen uit ijs en voeg 300 microliter van het zure fenol chloroform reagens uit de kit en vortex weer te mengen.

Na het centrifugeren op 10.000 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, voorzichtig verwijderen waterige fase van een nieuwe buis. Op basis van de hoeveelheid waterig herstel van de vorige stap, voeg 1,25 keer het volume van 100% ethanol toe aan de waterige faag in elke buis en pipet om te mengen. Bereid voor elk monster verse opvangbuizen met een filtercartridge.

Pipette ongeveer 675 microliter van het mengsel van lysaat-ethanol op de filtercartridge. Centrifuge kort bij 10.000 keer G om vloeistof door het filter te laten gaan. Gooi de doorstroom weg.

Herhaal het mengsel van lysaat-ethanol dat het filter en de centrifugatie toevoegt totdat het volledig is gebruikt. Voeg 700 microliter wasoplossing toe, één van de kit aan de filtercartridge. Centrifuge kort om de oplossing door de filters te trekken.

Gooi de doorstroom weg en bewaar dezelfde filtercartridges en opvangbuizen. Voeg 500 microliter wasoplossing twee-drie toe aan elke filtercartridge. Nadat u opnieuw hebt gecentrifugeren, moet u de doorstroom verwijderen en de wasstap herhalen.

Als u de resterende vloeistof uit de filtercartridges wilt verwijderen, draait u ze nog eens 60 seconden. Breng de cartridges over op verse inzamelbuizen. Voeg 100 microliter van 95 graden Celsius voorverwarmd nuclease-vrij water toe aan het midden van elke filtercartridge.

Centrifugeren de cartridges gedurende ongeveer 20 tot 30 seconden op het tafelblad centrifuge op maximale snelheid. Om hybridisatie voor te vormen met globinereductie oligo's, eerst denatureren het RNA door het toevoegen van elk geëxtraheerd monster in een 0,2 milliliter dunwandige nuclease-vrije reactiebuis. Plaats de buizen in een thermische cycler op 70 graden Celsius gedurende twee minuten.

Plaats daarna onmiddellijk de buizen op ijs om een optimale RNA-kwaliteit te verkrijgen. Terwijl de buizen koelen, bereid 400 microliter van 10X globin reductie oligo mix en 10X oligo hybridisatie buffer in een twee milliliter buis. Om de hybridisatie mix te maken, voeg zes microgram RNA monster, twee microliters van de 10X globin reductie oligo mix, een microliter van 10X oligo hybridisatie buffer, en nuclease gratis water aan een laatste volume van 10 microliters aan elke 0,2 milliliter dunwandige, nuclease-vrije reactiebuis.

Plaats de buizen in de thermische cycler op 70 graden Celsius gedurende twee minuten. Daarna, onmiddellijk zet de buizen op ijs. Om RNase H-vertering uit te voeren, verdun je eerst 10X RNase H tot één X RNase H met één X RNase H-buffer.

Bereid RNase H-reactiemix voor door twee microliter van 10X RNase-buffer, een microliter RNase-remmer en twee microliters van één X RNase H en vijf microliter nuclease-vrij water te combineren tot een totaal volume van 10 microliter. Voeg 10 microliter van de RNase H-reactiemix toe aan de globinreductiehybrideisatiemonsters en meng grondig. Verteren deze reactie op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten en vervolgens afkoelen tot vier graden Celsius.

Stop de spijsvertering door een microliter van 0,5 molaire EDTA aan de buis toe te voegen en breng het volledige gehalte aan de buis over naar een verse buis van 1,5 milliliter. Voeg onmiddellijk daarna 80 microliter RNase-vrij water, 350 microliter lysebuffer, dan 250 microliter van 100% ethanol toe aan elke buis en meng goed door pipetting. Breng elk monster van 700 microliter over naar een aparte elutiefiltercartridge die in twee milliliter-inzamelbuis wordt geplaatst om de doorstroom te verzamelen.

Centrifugeren gedurende 15 seconden op 8,000 keer G of groter en gooi de flow-through weg. Plaats dezelfde elutiefiltercartridges in nieuwe twee milliliter opvangbuizen. Om de filtercartridgemembranen te wassen, voegt u 500 microliter van de milde wasbuffer toe aan de filtercartridges en centrifuge gedurende 15 seconden bij 8, 000 keer G of meer.

Gooi de doorstroom weg. Voeg vervolgens met dezelfde opvangbuizen 500 microliter van 80% ethanol toe aan de filtercartridges. Centrifuge twee minuten op 8.000 keer G en groter.

Gooi zowel de flow-through en collectie buizen, en sla de elutie spin kolommen. Plaats elke elution spin kolom in een nieuwe twee milliliter collectie buis. Vijf minuten op volle snelheid centrifugeren met het open deksel op filterpatronen om de spinkolommembranen te drogen en ethanoloverdracht te voorkomen.

Na het weggooien van de opvangbuizen plaatst u elke gedroogde filtercartridge in een verse opvangbuis van 1,5 milliliter. Voeg 14 microliter RNase-vrij water direct toe aan het midden van het filtercartridgemembraan. Om het RNA te ontwijken, centrifugeren de buizen gedurende 60 seconden op volle snelheid en ga dan verder met verdere RNA-beoordeling en voorbereiding.

Het globine-uitgeputte monster kan nu worden gesplitst en gebruikt om de kleine, niet-codering RNA-bibliotheken voor te bereiden, evenals de ribo-uitgeputte mRNA en lange, niet-coderende RNA-bibliotheken. Na het voorbereiden van expressiebibliotheken van de globine-uitgeputte en ribo-uitgeputte volbloedmonsters met behulp van dit protocol, toonde de samenvatting van de elektroforese bestandsloop een globine-uitgeput bibliotheekmonster met RNA-integriteitsnummers die varieerden van 6,3 tot 9,2. Dit bleek een verbetering ten opzichte van andere studies die globine uitputtingsmethoden gebruikt en waren alleen in staat om RIN nummers te bereiken op of in de buurt van zes.

Uit de preglobinereductie en postglobinereductie van één enkel enkel bloedmonster van varkens bleek dat de concentratieverhoudingen van 260 tot 280 nanometer op of boven de twee liggen. Met behulp van dit protocol werden op chips gebaseerde elektroferogrammen van globine- en ribo-uitgeputte mRNA-bibliotheekmonsters verkregen voorafgaand aan het bundelen en sequencing. Voor de mRNA-bibliotheken heeft het representatieve elektropherogram een piek van ongeveer 280 basisparen.

Voor de kleine ncRNAs bevatten representatieve chipgebaseerde elektroferogrammen een bereik van pieken van ongeveer 100 tot 400 basisparen. Pieken bij ongeveer 143 basisparen komen overeen met miRNAs, en pieken bij ongeveer 153 basisparen komen overeen met piRNAs. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om ijs buizen onmiddellijk waar opgemerkt.

Na deze procedure moeten andere methoden worden uitgevoerd, zoals de volgende generatie sequencing om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals differentiële expressie, epigenetische veranderingen en hun effect op biologische trajecten en processen. Vergeet niet dat het werken met fenol-chloroform reagens uiterst gevaarlijk is en voorzorgsmaatregelen zoals werken in een rookkap moet worden genomen. Ook moet bij de behandeling van volbloed of infectieuze organismen het werk worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast voorafgaand aan een activering van het besmettelijke organisme.