Name: Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Leer polysomeprofilering zonder geautomatiseerde systemen voor analyse van ribosoomactiviteit in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode maakt gedetailleerd translationeel onderzoek toegankelijk voor elke laboratoriumomgeving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr. Percy Tumbale en Dr. Melissa Wells voor hun kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse National Institute of Health Intramural Research Program; Amerikaans Nationaal Instituut voor Milieugezondheidswetenschappen (NIEHS; ZIA ES103247 naar R.E.S).

1. Bereiding van 7% - 47% sucrosegradiënten
OPMERKING: Het lineaire bereik van de sucrosegradiënt kan worden gewijzigd om een betere scheiding te bereiken, afhankelijk van het gebruikte celtype. Dit protocol is geoptimaliseerd voor polysoomprofielen voor S. cerevisiae.
<ol><li>Bereid stamoplossingen van 7% en 47% sucrose in sucrosegradiëntbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 en 1 mM DTT). Filter steriliseer de sucrose bouillonoplossingen door een filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 14 ml van 17%, 27% en 37% sucrose-oplossingen door de 7% en 47% sucrose-bouillonoplossingen te doseren en te mengen op de in tabel 1 beschreven wijze.</li>
	<li>Plaats zes polypropyleen centrifugebuizen (14 x 89 mm) in een volledig zichtbare reageerbuis. Zorg voor voldoende ruimte tussen de buizen zodat acties met de ene buis de andere niet storen.</li>
	<li>Bevestig een lange naald aan een spuit van 3 ml. Gebruik voor dit protocol een naald van 9 inch en 22 G met een stompe punt (figuur 1), maar elke naald die lang genoeg is om de bodem van de centrifugebuis te bereiken, is voldoende. OPMERKING: Voer een testvulling en dispensatie uit om ervoor te zorgen dat de spuit de sucrose-oplossing kan vasthouden zonder te druppelen voordat de gradiënten worden ingesteld.</li>
	<li>Voeg 2 ml van de 7% sucrose toe aan de bodem van elke centrifugebuis.</li>
	<li>Voeg 2 ml van de 17% sucrose toe onder de 7% oplossing door de naaldpunt in de onmiddellijke nabijheid van de bodem van de buis te plaatsen en de oplossing langzaam en voorzichtig te doseren.</li>
	<li>Herhaal met 2 ml elk van de 27%, 37% en 47% sucrose-oplossingen. Zorg ervoor dat elke laag van elkaar te onderscheiden is door een lijn die de scheiding van dichtheden markeert (figuur 2). OPMERKING: Als de gradiënten niet binnen 48 uur zullen worden gebruikt, bevriezen de buizen op dit punt, voordat ze in een continue gradiënt worden opgelost, de buizen met gelaagde sucroseoplossingen in vloeibare stikstof en bewaren ze in een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag.</li>
	<li>Bewaar gradiënten bij 4 °C 's nachts om gradiënten te laten bezinken tot een continu, toenemend percentage sucrose. Het duurt 8-12 uur voordat de gelaagde sucrose-oplossingen in een lineaire sucrosegradiënt zijn bezinkt. Lineaire gradiënten zijn stabiel tot 48 uur. Nachtelijke opslag bij 4 °C biedt voldoende tijd voor ontdooien en zetting in een lineaire gradiënt voor het gebruik van bevroren, gelaagde sucrose-oplossingen. Gebruik een densitometer om de gradiëntkwaliteit te beoordelen. OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de gradiënten op een stabiele plaats op te slaan waar ze niet worden verstoord, omdat bewegingen of trillingen de gradiënt zullen verstoren.</li>
</ol>2. Bereiding van gistcelextracten
<ol><li>Ent de giststam van belang in 50 ml gistextract pepton dextrose (YPD) media en groei 's nachts bij 30 °C in een schuddende incubator tot stationaire fase. OPMERKING: De temperatuur kan variëren afhankelijk van de vereisten voor giststammen.</li>
	<li>Breng 10 ml stationaire fasecultuur over in 1 l verse YPD-media. Incubeer de cellen met krachtig schudden bij 30 °C (of een andere geschikte temperatuur) totdat de cultuur de midden-exponentiële groeifase bereikt (OD600 = 0,4-0,6).</li>
	<li>Voeg in de midden-exponentiële groeifase cycloheximide toe aan de cultuur in een eindconcentratie van 0,1 mg / ml. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Oogst de cellen door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. OPMERKING: Op dit punt kunnen cellen worden ingevroren en opgeslagen bij -80 °C.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in gekoelde 700 μL polysoomextractiebuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/ml cycloheximide, 0,2 mg/ml heparine). Voeg 100 eenheden RNase Inhibitor toe en breng het over in een centrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg ~400 μL voorgekoelde glasparels met een groottebereik van 425-600 μm toe aan de centrifugebuis. Verstoor de gistcellen door krachtige agitatie in een kraalklopper gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verduidelijk het lysaat door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Bepaal de concentratie van het RNA in het geklaarde lysaat door de absorptie bij 260 nm te meten met een spectrofotometer of met behulp van een op fluorescentie gebaseerd RNA-detectiesysteem. OPMERKING: Voor zeer nauwkeurige RNA-concentratiemetingen gebruikt u op fluorescentie gebaseerde RNA-detectiekits.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de RNA-concentratie 0,5-1 μg/μL is. Als de RNA-concentratie te laag is, verminder dan het volume van polysoomextractiebuffer dat wordt gebruikt om de cellen in toekomstige experimenten te resuspenderen. OPMERKING: Laad het lysaat onmiddellijk na lyse- en RNA-kwantificering op de gradiënten. Indien nodig vriest flash de lysaten in vloeibare stikstof in en bewaar ze enkele dagen bij -80 °C.</li>
</ol>3. Centrifugatie van gradiënten
<ol><li>Laad het lysaat voorzichtig op de bovenkant van de verlopen. Plaats de pipetpunt tegen de binnenwand, aan de bovenkant van de polypropyleenbuis. Draai de buis voorzichtig in een hoek en doseer het lysaat langzaam op de bovenkant van het verloop door tegen de muur te dribbelen. Zorg ervoor dat u het verloop niet verstoort of verstoort bij het laden van het lysaat. OPMERKING: De hoeveelheid geladen lysaat verschilt per celtype. De inhoud van het RNA zal ook variëren. Het kan nodig zijn om een aantal experimenten uit te voeren om de hoeveelheid lysaat te bepalen die nodig is om een optimaal polysoomprofiel te genereren. Voor gist is 300 μg RNA een goed startpunt voor optimalisatie.</li>
	<li>Plaats de buizen voorzichtig in de voorgekoelde emmers van een zwenkbakrotor. OPMERKING: Elke polypropyleencentrifugebuis moet gelijke gradiëntvolumes hebben en de hoeveelheid van het geladen lysaat. Dit kan van buis tot buis verschillen. Zorg ervoor dat de variatie geen onbalansfout veroorzaakt tijdens ultracentrifugatie.</li>
	<li>Centrifugeer de hellingen bij 260.110 x g gedurende 150 min bij 4 °C.</li>
</ol>4. Breuk en gegevensverzameling
<ol><li>Verwijder de centrifugebuizen voorzichtig van de zwenkbakrotor en plaats ze in een buishouder.</li>
	<li>Label de 96-well platen om de fracties op te slaan en voorkoelen op ijs. OPMERKING: Gebruik een 96-well plaat geschikt voor een spectrofotometer met een optisch venster tot 230 nm voor nucleïnezuurbepalingen bij 260 nm / 280 nm.</li>
	<li>Verzamel 100 μL of 200 μL fracties vanaf de bovenkant van het verloop door voorzichtig een pipetpunt in de bovenkant van het verloop te steken. Verzamel fracties totdat de hele gradiënt is gealiquoteerd. Het aantal fracties is afhankelijk van het totale gradiëntvolume. OPMERKING: Verzamel de breuken op een manier die de rest van het verloop niet verstoort. Zorg ervoor dat alle fracties evenveel volume hebben. Naast handmatige fractionering is een andere goedkope methode voor fractionering het gebruik van een kleine peristaltische pomp.</li>
	<li>Breng elke fractie over naar de 96-well plaat om de bodem van de centrifugebuis te bereiken. Bewaar de verzamelde fracties te allen tijde op het ijs.</li>
	<li>Meet de absorptie van elke fractie bij 254 nm met een spectrofotometer. Gebruik de 7% en 47% sucrose-oplossingen als blanco's. OPMERKING: Houd er bij het meten van de absorptie van fracties rekening mee dat voor de meeste spectrometers en colorimeters het meest effectieve absorptiebereik 0,1-1 is. Als de absorptiemetingen buiten bereik zijn (≥1,0), hebben de fracties te veel materiaal. Verdun het monster, verzamel de gegevens en houd vervolgens rekening met de verdunningsfactor bij het uitzetten van het profiel.</li>
	<li>Maak het polysoomprofiel door het breukgetal versus de absorptie uit te zetten.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).</li>
<li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79(2019).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3(2018).</li>
<li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+in+leishmania%2C+human+cells+and+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600(2018).</li>
<li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).</li>
<li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate%2C+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573(2017).</li>
<li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295(2014).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164(2014).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126(2017).</li>
<li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li>
<li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li>
<li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+assembly+coming+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li>
<li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+puzzle+of+life%3A+Crafting+ribosomal+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li>
<li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+nascent+ribosome%3A+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymolog%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier is een methode beschreven om polysomische profielen te maken zonder het gebruik van dure geautomatiseerde fractioneringssystemen. Het voordeel van deze methode is dat het polysome profilering toegankelijk maakt voor laboratoria die geen geautomatiseerde fractioneringssystemen hebben. De belangrijkste nadelen van dit protocol zijn vervelende handfractionering en verminderde gevoeligheid in vergelijking met het speciale dichtheidsfractioneringssysteem.
Dit protocol omvat een zorgvuldige voo...

Ribosomen zijn mega-Dalton ribonucleoproteïnecomplexen die het fundamentele proces van het vertalen van mRNA in eiwitten uitvoeren. Ribosomen zijn verantwoordelijk voor het uitvoeren van de synthese van alle eiwitten in een cel. Eukaryote ribosomen bestaan uit twee subeenheden die worden aangeduid als de kleine ribosomale subeenheid (40S) en de grote ribosomale subeenheid (60S) op basis van hun sedimentatiecoëfficiënten. Het volledig geassembleerde ribosoom wordt aangeduid als het 80S monosoom. Polysomen zijn groepen ribosomen die zich bezighouden met het vertalen van een enkel mRNA-molecuul. Polysoomfractionering door sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie is een krachtige methode die wordt gebruikt om ribosoomprofielen te maken, specifieke mRNA's te identificeren die verband houden met het vertalen van ribosomen en polysoomassociatiefactorente analyseren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Deze techniek wordt vaak gebruikt om polysomen te scheiden van enkele ribosomen, ribosomale subeenheden en messenger ribonucleoproteïnedeeltjes. De profielen verkregen uit fractionering kunnen waardevolle informatie opleveren over de translatieactiviteit van polysomen14 en de assemblagestatus van de ribosomen 15,16,17.
Ribosoomassemblage is een zeer complex proces dat wordt vergemakkelijkt door een groep eiwitten die bekend staat als ribosoomassemblagefactoren 18,19,20,21. Deze factoren vervullen een breed scala aan functies tijdens ribosoombiogenese door interacties met vele andere eiwitten, waaronder ATPasen, endo- en exo-nucleasen, GTPases, RNA-helicases en RNA-bindende eiwitten22. Polysoomfractionering is een krachtig hulpmiddel dat wordt gebruikt om de rol van deze factoren in ribosoomassemblage te onderzoeken. Deze methode is bijvoorbeeld gebruikt om aan te tonen hoe mutaties in het polynucleotidekinase Grc3, een pre-rRNA-verwerkingsfactor, het ribosoomassemblageproces negatief kunnen beïnvloeden17,23. Polysoomprofilering heeft ook benadrukt en aangetoond hoe de geconserveerde motieven in de ATPase Rix7 essentieel zijn voor ribosoomproductie16.
De procedure voor polysoomfractionering begint met het maken van oplosbare cellysaten uit interessante cellen. Het lysaat bevat RNA, ribosomale subeenheden en polysomen, evenals andere oplosbare cellulaire componenten. Een continue, lineaire sucrosegradiënt wordt gemaakt in een ultracentrifugebuis. De oplosbare fractie van cellysaat wordt voorzichtig op de bovenkant van de sucrosegradiëntbuis geladen. De geladen gradiëntbuis wordt vervolgens onderworpen aan centrifugatie, die de cellulaire componenten scheidt op grootte binnen de sucrosegradiënt door de zwaartekracht. De grotere componenten reizen verder in de gradiënt dan de kleinere componenten. De bovenkant van de gradiënt herbergt de kleinere, langzamer reizende cellulaire componenten, terwijl de grotere, sneller reizende cellulaire componenten aan de onderkant te vinden zijn. Na centrifugatie wordt de inhoud van de buis verzameld als fracties. Deze methode scheidt effectief ribosomale subeenheden, monosomen en polysomen. De optische dichtheid van elke fractie wordt vervolgens bepaald door de spectrale absorptie te meten bij een golflengte van 254 nm. Het plotten van absorptie versus fractiegetal levert een polysoomprofiel op.
Lineaire sucrosedichtheidsgradiënten kunnen worden gegenereerd met behulp van een gradiëntmaker. Na centrifugatie worden gradiënten vaak gefractioneerd en absorptiewaarden gemeten met behulp van een geautomatiseerd dichtheidsfractioneringssysteem 3,7,13,24,25. Hoewel deze systemen heel goed werken om polysoomprofielen te produceren, zijn ze duur en kunnen ze voor sommige laboratoria onbetaalbaar zijn. Hier wordt een protocol gepresenteerd om polysomische profielen te genereren zonder het gebruik van deze instrumenten. In plaats daarvan maakt dit protocol gebruik van apparatuur die doorgaans beschikbaar is in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie.

<table><tbody><tr><td>Automatic Fractionator</td><td>Brandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clariostar Multimode Plate Reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads, acid washed</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td>425&ndash;600 &mu;m</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, 1 M</td><td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>Naald, 22 G, Metal Hub</td><td>Hamilton Company</td><td>7748-08</td><td>custom length 9 inches, point style 3</td></tr><tr><td>Optima XL-100K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Test Tube Peg Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-810-54A</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33228</td><td></td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Inhibitor</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Spuit, 3 mL</td><td>Coviden</td><td>888151394</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 M,&nbsp; pH 7.4</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UV-Star Microplate, 96 wells</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655801</td><td></td></tr></tbody></table>

polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysoomfractionering door sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om ribosoomprofielen te maken, specifieke mRNA's te identificeren die worden vertaald door ribosomen en polysoomgerelateerde factoren te analyseren. Hoewel geautomatiseerde gradiëntmakers en gradiëntfractioneringssystemen vaak worden gebruikt met deze techniek, zijn deze systemen over het algemeen duur en kunnen ze onbetaalbaar zijn voor laboratoria die beperkte middelen hebben of de kosten niet kunnen rechtvaardigen vanwege hun onregelmatige of incidentele noodzaak om deze methode uit te voeren voor hun onderzoek. Hier wordt een protocol gepresenteerd om reproduceerbaar polysoomprofielen te genereren met behulp van standaardapparatuur die beschikbaar is in de meeste moleculair biologische laboratoria zonder gespecialiseerde fractioneringsinstrumenten. Bovendien wordt een vergelijking van polysomische profielen gegenereerd met en zonder een gradiëntfractioneringssysteem verstrekt. Strategieën om reproduceerbare polysoomprofielen te optimaliseren en te produceren worden besproken. Saccharomyces cerevisiae wordt in dit protocol gebruikt als modelorganisme. Dit protocol kan echter eenvoudig worden aangepast en aangepast om ribosoomprofielen te genereren voor veel verschillende organismen en celtypen.

Drie representatieve polysoomprofielen zijn weergegeven in figuur 3. Alle profielen zijn van dezelfde giststam. Een typisch polysoomprofiel heeft goed opgeloste pieken voor de ribosomale subeenheden van de jaren 40, 60 en 80 en polysomen. De top van elke ribosomale subeenheid en polysoompiek zal zichtbaar zijn op elk profiel (figuur 3). Een representatief profiel van een geautomatiseerd dichtheidsfractioneringssysteem is weergegeven in figuu...

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Dit protocol beschrijft hoe een polysoomprofiel kan worden gegenereerd dat moleculaire details onthult over de activiteit van ribosomen in de cel. Met deze techniek kunnen gebruikers de waardevolle informatie verkrijgen die wordt geleverd door een polysoomprofiel, die geen toegang hebben tot geautomatiseerde gradiëntfractioneringssystemen. Neem de tijd om de gradiënten voor te bereiden en bewaar de gradiënten op een locatie waar ze niet worden verstoord door een compressor of andere mechanische bewerkingen terwijl ze zich in een lineaire gradiënt nestelen.Bereid om te beginnen stamoplossingen van 7 en 47% sucrose in sucrosegradiëntbuffer. Filter steriliseer de sucrose stock oplossingen door een 0,22 micron filter. Bereid 14 milliliter van 17, 27 en 37% sucrose-oplossingen door de 7- en 47% stockoplossingen te doseren en te mengen.Plaats zes polypropyleen centrifugebuizen in een volledig zichtbare reageerbuis. Zorg ervoor dat er voldoende ruimte tussen de buizen is, zodat de acties met de ene buis de andere niet storen. Bevestig een naald van negen inch, 22 gauge met een stompe punt aan een spuit van drie milliliter en voer een testvulling en -afgifte uit om ervoor te zorgen dat de spuit de sucrose-oplossing kan vasthouden zonder te druppelen voordat de verlopen worden ingesteld.Voeg twee milliliter van de 7% sucrose toe aan de bodem van elke centrifugebuis. Voeg vervolgens twee milliliter van de 17% sucrose toe onder de 7% -oplossing door de naaldpunt in de directe omgeving van de buisbodem te plaatsen. Geef voorzichtig en langzaam de oplossing.Herhaal de procedure met twee milliliter elk van de 27, 37 en 47% sucrose-oplossing, waarbij u ervoor zorgt dat elke laag van de andere kan worden onderscheiden door een lijn die de scheiding van dichtheden markeert. Bewaar de gradiënten 's nachts op vier graden Celsius om ze te laten bezinken in een continu, toenemend percentage sucrose. Na de groei en oogst van gist, Saccharomyces cerevisiae cellen, resuspenderen de cellen in gekoelde 700 microliter polysoom extractie buffer.Voeg 100 eenheden RNAse-remmer toe. Voeg vervolgens 400 microliter voorgekoelde glaskralen toe met een geschatte grootte van 425 tot 600 micron. Breng het mengsel over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter met de glasparels en verstoor de gistcellen door krachtig roeren in een kraalklopper gedurende vijf minuten.Na het verstoren van de cellen, verduidelijk het lysaat door centrifugatie. Bepaal de concentratie van het RNA in het geklaarde lysaat door de absorptie op 260 nanometer te meten, met behulp van een op fluorescentie gebaseerd RNA-detectiesysteem. Zorg ervoor dat de RNA-concentratie 0,5 tot één microgram per microliter is.Als de RNA-concentratie te laag is, verminder dan het volume van de extractiebuffer dat wordt gebruikt om de cellen te resuspenderen. Laad het lysaat voorzichtig op de bovenkant van de verlopen. Plaats de pipetpunt tegen de binnenwand aan de bovenkant van de polypropyleenbuis.Hoek de buis en doseer het lysaat langzaam op de bovenkant van het verloop en dribbel tegen de muur. Plaats de buizen voorzichtig in de voorgekoelde emmers van een zwenkbare emmerrotor en centrifugeer de gradiënten. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de centrifugebuizen van de zwenkbakrotor en plaats ze in een buishouder.Label de 96-well platen om de fracties op te slaan en voorkoelen op ijs. Verzamel 100 of 200 microliterfracties vanaf de bovenkant van het verloop, door voorzichtig een pipetpunt in de bovenkant van het verloop te steken en de fracties te verzamelen totdat het hele verloop is gealiquoteerd. Meet de absorptie van elke fractie op 254 nanometer met een spectrofotometer tegen de 7 en 47% sucrose-oplossingen als blanco's.Maak het polysoomprofiel door het breukgetal versus de absorptie uit te zetten. Drie representatieve polysoomprofielen van gist S.Cerevisiae, worden getoond. De top van elke ribosomale subeenheid en polysoompiek is zichtbaar op elk profiel.Een representatief profiel van een geautomatiseerd dichtheidsfractioneringssysteem wordt hier getoond. Dit profiel werd geproduceerd uit een continu absorptieprofiel omdat de sucrosegradiënt van onder naar boven werd verplaatst door een achtervolgingsoplossing, door een detectorstroomcel en verzameld in fracties. Het polysoomprofiel dat wordt gegenereerd door het met de hand fractioneren van monsters van 200 en 100 microliter wordt hier weergegeven.Het belangrijkste om te onthouden met deze procedure is om de gradiënten niet te verstoren. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen introduceert of de gradiënt verstoort door de oplossing te snel te doseren. Na deze procedure kan RNA uit de gradiënten worden geëxtraheerd voor verdere analyse om mRNA's te bepalen die verband houden met actieve ribosomen

polysome-profiling-without-gradient-makers-or-fractionation-systems

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Dit protocol illustreert wezenlijke modificaties van polyribosome fractionering om de translatome in vivo CZS monsters te bestuderen. Het maakt het mogelijk globale beoordeling van vertaling en transcriptie regulatie door de isolatie en vergelijking van de totale RNA gebonden RNA fracties ribosoom.

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om transcripten uit plantweefsels te extraheren en te fractoneren op basis van het aantal gebonden ribosomen. Het maakt een globale schatting van de translatieactiviteit mogelijk en de bepaling van de translationele status van specifieke mRNA's.

Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Het algemene doel van Polysoom profiling techniek is analyse van translationeel activiteiten van individuele mRNAs of transcriptome mRNAs tijdens de eiwitsynthese. De methode is belangrijk voor de studie van eiwit synthese verordening, vertaling activering en onderdrukking in gezondheid en meerdere ziekten bij de mens.

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Het hier gepresenteerde protocol omvat polysomale profilering om translatom, mRNA's geassocieerd met ribosomen, te isoleren in niet-polysomale en polysomale RNA's van Arabidopsis door middel van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode toont de translatie-efficiëntie van hitte-gestreste Arabidopsis.

Translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofielen onder hittestress

Leer polysomeprofilering zonder geautomatiseerde systemen voor analyse van ribosoomactiviteit in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode maakt gedetailleerd translationeel onderzoek toegankelijk voor elke laboratoriumomgeving.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Meer video's verkennen