Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Dit protocol beschrijft hoe een polysoomprofiel kan worden gegenereerd dat moleculaire details onthult over de activiteit van ribosomen in de cel. Met deze techniek kunnen gebruikers de waardevolle informatie verkrijgen die wordt geleverd door een polysoomprofiel, die geen toegang hebben tot geautomatiseerde gradiëntfractioneringssystemen. Neem de tijd om de gradiënten voor te bereiden en bewaar de gradiënten op een locatie waar ze niet worden verstoord door een compressor of andere mechanische bewerkingen terwijl ze zich in een lineaire gradiënt nestelen.

Bereid om te beginnen stamoplossingen van 7 en 47% sucrose in sucrosegradiëntbuffer. Filter steriliseer de sucrose stock oplossingen door een 0,22 micron filter. Bereid 14 milliliter van 17, 27 en 37% sucrose-oplossingen door de 7- en 47% stockoplossingen te doseren en te mengen.

Plaats zes polypropyleen centrifugebuizen in een volledig zichtbare reageerbuis. Zorg ervoor dat er voldoende ruimte tussen de buizen is, zodat de acties met de ene buis de andere niet storen. Bevestig een naald van negen inch, 22 gauge met een stompe punt aan een spuit van drie milliliter en voer een testvulling en -afgifte uit om ervoor te zorgen dat de spuit de sucrose-oplossing kan vasthouden zonder te druppelen voordat de verlopen worden ingesteld.

Voeg twee milliliter van de 7% sucrose toe aan de bodem van elke centrifugebuis. Voeg vervolgens twee milliliter van de 17% sucrose toe onder de 7% -oplossing door de naaldpunt in de directe omgeving van de buisbodem te plaatsen. Geef voorzichtig en langzaam de oplossing.

Herhaal de procedure met twee milliliter elk van de 27, 37 en 47% sucrose-oplossing, waarbij u ervoor zorgt dat elke laag van de andere kan worden onderscheiden door een lijn die de scheiding van dichtheden markeert. Bewaar de gradiënten 's nachts op vier graden Celsius om ze te laten bezinken in een continu, toenemend percentage sucrose. Na de groei en oogst van gist, Saccharomyces cerevisiae cellen, resuspenderen de cellen in gekoelde 700 microliter polysoom extractie buffer.

Voeg 100 eenheden RNAse-remmer toe. Voeg vervolgens 400 microliter voorgekoelde glaskralen toe met een geschatte grootte van 425 tot 600 micron. Breng het mengsel over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter met de glasparels en verstoor de gistcellen door krachtig roeren in een kraalklopper gedurende vijf minuten.

Na het verstoren van de cellen, verduidelijk het lysaat door centrifugatie. Bepaal de concentratie van het RNA in het geklaarde lysaat door de absorptie op 260 nanometer te meten, met behulp van een op fluorescentie gebaseerd RNA-detectiesysteem. Zorg ervoor dat de RNA-concentratie 0,5 tot één microgram per microliter is.

Als de RNA-concentratie te laag is, verminder dan het volume van de extractiebuffer dat wordt gebruikt om de cellen te resuspenderen. Laad het lysaat voorzichtig op de bovenkant van de verlopen. Plaats de pipetpunt tegen de binnenwand aan de bovenkant van de polypropyleenbuis.

Hoek de buis en doseer het lysaat langzaam op de bovenkant van het verloop en dribbel tegen de muur. Plaats de buizen voorzichtig in de voorgekoelde emmers van een zwenkbare emmerrotor en centrifugeer de gradiënten. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de centrifugebuizen van de zwenkbakrotor en plaats ze in een buishouder.

Label de 96-well platen om de fracties op te slaan en voorkoelen op ijs. Verzamel 100 of 200 microliterfracties vanaf de bovenkant van het verloop, door voorzichtig een pipetpunt in de bovenkant van het verloop te steken en de fracties te verzamelen totdat het hele verloop is gealiquoteerd. Meet de absorptie van elke fractie op 254 nanometer met een spectrofotometer tegen de 7 en 47% sucrose-oplossingen als blanco's.

Maak het polysoomprofiel door het breukgetal versus de absorptie uit te zetten. Drie representatieve polysoomprofielen van gist S.Cerevisiae, worden getoond. De top van elke ribosomale subeenheid en polysoompiek is zichtbaar op elk profiel.

Een representatief profiel van een geautomatiseerd dichtheidsfractioneringssysteem wordt hier getoond. Dit profiel werd geproduceerd uit een continu absorptieprofiel omdat de sucrosegradiënt van onder naar boven werd verplaatst door een achtervolgingsoplossing, door een detectorstroomcel en verzameld in fracties. Het polysoomprofiel dat wordt gegenereerd door het met de hand fractioneren van monsters van 200 en 100 microliter wordt hier weergegeven.

Het belangrijkste om te onthouden met deze procedure is om de gradiënten niet te verstoren. Zorg ervoor dat u geen luchtbellen introduceert of de gradiënt verstoort door de oplossing te snel te doseren. Na deze procedure kan RNA uit de gradiënten worden geëxtraheerd voor verdere analyse om mRNA's te bepalen die verband houden met actieve ribosomen