Multiplexed fluorescerende immunohistochemische kleuring, Imaging en analyse in histologische monsters van lymfoom

Lymfoom zijn histologisch complexe tumoren. Daarom biedt multiplexed fluorescerende immunohistochemie voordelen ten opzichte van conventionele chromogene immunohistochemie om markers van belang in de tumorcellen en de micro-omgeving te bestuderen. Deze techniek heeft het potentieel voor het standaardiseren van het scoren van antilichaam gebaseerde kleuring in histologische lymfoommonsters, een proces dat historisch gezien uitdagend is geweest vanwege de complexiteit van de tumormicro-omgeving.

Met name multiplexed fluorescerende immunohistochemie en spectrale beeldvorming maken het mogelijk om meerdere vlekken binnen één dia kwantitatief te meten, waardoor de beoordeling van antigeenco expressie en ruimtelijke relatie binnen klinisch materiaal mogelijk is. Begin met het onderdompelen van de ontwaxte en gehydrateerde glijbanen in een standaard antigeen retrieval buffer in een magnetron op te slaan glazen pot en het uitvoeren van warmte-geïnduceerde epitoop ophalen in een geschikte magnetron. Voer extra rondes van microgolf strippen op basis van de positie van het antilichaam in de laatste multiplex sequentie.

Bijvoorbeeld, het vierde antilichaam vereist drie extra rondes van de magnetron strippen voorafgaand aan vlekken. Gebruik na voltooiing van het stripproces tangen en hittebestendige handschoenen om de glijbanen bij kamertemperatuur gedurende een afkoeling van ten minste 10 minuten over te brengen op gedestilleerd water. Wanneer de antigeen retrieval oplossing is afgekoeld, blok de weefselperoxidase activiteit met een commerciële peroxidase blok gedurende 10 minuten, gevolgd door een vijf minuten wassen in tris-gebufferde zoutoplossing, of TBS, en een niet-ionisch wasmiddel.

Blokkeer elke niet-specifieke kleuring met een incubatie van 10 minuten bij het blokkeren van buffer, gevolgd door incubatie met het primaire antilichaam van belang bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en drie vijf minuten wasbeurten met TBS-D buffer. Vervolgens, incubeer de monsters met een geschikte mierikswortel peroxidase geconjugeerde secundaire antilichaam gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten in tbs-D buffer zoals aangetoond. Breng na de laatste wasbeurt een passend fluorescerend reagens op basis van tyramide aan op de dia's voor een incubatie van vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie tbs-d-d-wasbeurten van vijf minuten.

Voer een extra microgolf gebaseerd strippen om de primaire en secundaire antilichamen te verwijderen in verse antigeen retrieval oplossing zoals aangetoond. Aan het einde van het ophalen, koel de glijbanen in gedestilleerd water en droog de gebieden op de dia's zonder weefsel met lab doekjes. Incubeer glijbaan met dappy voor 10 minuten op kamertemperatuur, gevolgd door drie TBS-D wasbeurten.

Droog vervolgens de dia's zorgvuldig met labdoekjes zonder contact op te nemen met de weefsels en monteer de monsters met een geschikt montagemedium voor beeldvorming. Voor monoplexdiascanning selecteert u de juiste filters uit de fluorofoforen die worden gebruikt voor het labelen van de monsters en onderzoekt u elke markering en het bijbehorende fluorescentiekanaal om een geschikte belichtingstijd te identificeren voor het verkrijgen van een schoon signaal, waarbij de nadruk ligt op de weefselcomponent die het sterkste signaal voor de markering zou moeten hebben. Als u een vergelijking van de pixelintensiteit wilt toestaan, gebruikt u de live camera-instelling om de belichtingstijd in elk afzonderlijk kanaal aan te passen totdat er geen overbelichte gebieden in het live camerabeeld zijn.

Wanneer alle dia's zijn gescand, verwerven gesimuleerde heldere veldbeelden visueel te vergelijken met de normale immunohistochemische patroon en om te bepalen of de kleuring patroon juist is. Om weefselmicroarraydia's te scannen, gebruikt u de tissuemicroarray-scanmodus in het beeldvormingssysteem en een geschikt autofocusalgoritme. Voor hele weefsel sectie dia's, hebben de dia's beoordeeld door een gekwalificeerde patholoog om optimale beelden te selecteren uit de meest representatieve tumor gebieden.

Voordat u met de analyse begint, selecteert u een tumormarker om de cellen van belang voor de analyse te identificeren. Laat een patholoog de beelden bekijken en beslissen of weefselsegmentatie nodig is. Selecteer indien nodig de juiste controlegebieden voor segmentatie en controleer of de software voor beeldanalyse dergelijke regio's correct kan identificeren.

Laat de patholoog na de celsegmentatie de segmentatiekaart bekijken om de getrouwheid van de beoogde segmentatiebenadering te garanderen en afzonderlijke afbeeldingen te bekijken om te bepalen of de celsegmentatie toereikend is of dat extra weefselsegmentatie nodig is om gebieden te selecteren die zijn verrijkt voor tumorcellen, stroma en of necrose. Bepaal vervolgens de optische intensiteit positieve cutoff waarde voor elke marker in combinatie met de patholoog en het genereren van histogrammen in een geschikte statistische software programma om de frequentie verdeling van de marker intensiteit per cel te analyseren. Als u percentagegegevens wilt genereren voor specifieke markeringen van belang binnen gedefinieerde cellen, voegt u een draaitabel in het gegevensblad in en selecteert u Som om het positiviteitspercentage van één markering van belang te berekenen.

Het totale aantal positieve markercellen gedeeld door het totale aantal wordt berekend. Het resultaat is het markerpositief celpercentage met één kern of één studienummer. Als u numerieke gegevens wilt genereren, krijgt u de gemiddelde intensiteit van elke markering van belang in alle cellenstudie binnen een monster om de genormaliseerde telling van de mediaan voor elke markering van elke kern of studienummer te extraheren.

Hier worden representatieve multiplex fluorescerende immunohistochemische beelden getoond voor een diffuus groot B-cel lymfoommonster met c-MYC en BCL2-gen herschikt. Gesimuleerde heldere veld immunohistochemische beelden tonen een soortgelijke tumor marker kleuring patroon. De toepassing van multiplex fluorescerende immunohistochemische beelden op een T-cel paneel in angio-immunooblastische T-cel lymfoom onthult de cel heterogeniteit van het tumormonster.

Hier worden de optimalisatie van een tonsillencontrolemonster en de resulterende data-analyse getoond. Een verscheidenheid van beeldanalyse software programma's kunnen worden gebruikt na de unmixing stap naar marker expressie en lokalisatie in tumorcellen en de tumor micro-omgeving quantitate. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om de co-expressie van meerdere markers binnen specifieke celtypen in afzonderlijke weefselssecties van lymfoom te bestuderen.

Zorg ervoor dat u tijdens de microwaving-stappen door hitte wordt veroorzaakt en wees u bewust van de valrisico's tijdens de scanstappen die in het dek worden uitgevoerd.