Optimalisatie, ontwerp en Vermijd valkuilen in handmatige multiplex fluorescerende immunohistochemie

Multiplex fluorescerende immunohistochemie identificeert meerdere celtypen en hun locaties in intact formeel vast paraffine-ingebed weefsel, waardoor niet alleen celidentificatie, maar ook cel-tot cel-tot-celale analyse mogelijk is. Het belangrijkste voordeel van deze handmatige techniek is het gebruik van meerdere antilichamen van dezelfde soort zonder kruisreactiviteit. Deze techniek zorgt voor een diepgaande kijk op de interacties van immuun- en kankercellen in de tumormicro-omgeving.

Bij het proberen van deze techniek voor de eerste keer, zorgen voor ongeveer drie tot vier dagen van vlekken en bijhouden van elke stap volledig tijdens het proces. Een zwakkere methode van het kleuringsproces en multiplex ontwerp is van cruciaal belang om gemeenschappelijke en verwachte valkuilen te verminderen. Begin met het deparaffiniseren en hydrateren van de dia's.

Leg ze in de hybridisatieoven met weefsel kant omhoog en bak ze op 60 graden Celsius voor een uur. Haal de glijbanen uit de oven en laat ze vijf tot tien minuten afkoelen in een verticaal schuifrek. Gebruik vervolgens een dia kleuring set om de dia's drie keer te behandelen met xyleen en eenmaal met 100% ethanol, 95% ethanol, en 70% ethanol gedurende 10 minuten per stuk.

Was het rek van glijbanen met gedeïsized water en bevestig vervolgens de glijbanen door ze gedurende 30 minuten onder te dompelen in neutrale gebufferde formaline. Was de glijbanen twee minuten met water en ga verder met het ophalen van antigeen. Plaats het rek van glijbanen in een hittebestendige doos gevuld met pH 6.0 of pH 9.0 antigeen retrieval buffer.

Bedek de doos met plastic folie en zet hem vast met een elastiekje. Plaats de doos in een inverter uitgeruste magnetron op de rand van de roterende plaat en verwarm de glijbanen gedurende 45 seconden op 100%vermogen, gevolgd door 15 minuten op 20% vermogen. Laat de glijbanen na het microwaving 15 tot 20 minuten afkoelen.

Bereid ondertussen werkoplossingen voor antilichamen en fluoroforen. Bereid het primaire antilichaamverdunningsmezzo voor door 0,5 gram runderserumalbumen te lossen in 50 milliliter tbs of 1x PBS. Verdun elke primaire antilichaam werkoplossing tot een eerder bepaalde geoptimaliseerde concentratie.

Verdun elke fluorofoër in het fluorofofofinont verdunningsgeduen bij een concentratie van één tot 100. Op de laatste dag van kleuring, bereid de DAPI werkoplossing door het toevoegen van drie druppels DAPI tot een milliliter tbst. Zodra de dia's zijn gekoeld, verwijder ze uit de magnetron en neem de plastic folie.

Was ze met gedeïstioneerd water gedurende twee minuten, gevolgd door een twee minuten durende wasbeurt met TBST. Na de was, droog de glijbaan rond het weefsel met een delicate taak af te vegen en te traceren rond de buitenkant van het weefsel met een hydrofobe barrière pen, zorg ervoor dat het weefsel niet aanraken of laat het uitdrogen. Plaats elke dia in de bevochtigerkamer en voeg ongeveer vier druppels blokkeeroplossing toe aan het weefsel.

Vervolgens incubeer de dia's gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en ga verder met primaire antilichaam toepassing. Verwijder de blokkerende oplossing van elke dia door op de zijkant van de dia op een stapel papieren handdoeken te tikken en gebruik een delicate taakdoek om de resterende oplossing te verwijderen. Plaats de schuif terug in de bevochtigde kamer, voeg ongeveer 200 microliter van het werkende primaire antilichaam toe en broed gedurende een uur in.

Na de incubatie, was de dia's drie keer door ze onder te dompelen in TBST gedurende twee minuten per wasbeurt. Dep de resterende TBST van elke dia af en breng ongeveer drie tot vier druppels secundair antilichaam aan. De glijbanen in de bevochtigde kamer gedurende 10 minuten uitbroeden.

Was de dia's opnieuw met TBST en breng ongeveer 100 microliter van de fluorofoferenwerkoplossing aan. Breng de glijbanen terug naar de bevochtigde kamer en broed gedurende 10 minuten in. Herhaal de TBST wassen en vervolgens magnetron de dia's volgens het manuscript aanwijzingen om de antilichamen te verwijderen.

Een belangrijk ding om te onthouden tijdens dit meerdaagse kleuringsproces is het stoppen na de microwaving stap en het verlaten van de dia's in antigeen retrieval buffer 's nachts, zorgen voor weefsel en vlek integriteit. Verwijder de laatste antilichaamtoepassing met de antigeenophaaloplossing en was de glijbanen met gedeïstioneerd water, gevolgd door TBST gedurende twee minuten per wasbeurt. Herhaal de kleuring stappen voor de rest van het antilichaam flurophore paren en ga dan verder met DAPI toepassing.

Breng ongeveer 150 microliter werkende DAPI-oplossing aan op elke dia en broed ze gedurende 10 minuten in de bevochtigde kamer. Na incubatie, was de dia's met TBST voor ongeveer 30 seconden en monteer de deklipjes. Zodra de montage media is gedroogd, breng duidelijke vingernagel polish op de vier hoeken van de cover slip om het te beveiligen.

Om de monoplex te analyseren, beeld de dia's op de microscoop met een 250 milliseconde belichting met behulp van DAPI om zich te concentreren. Evalueer elke eenplexdia door te kijken naar de fluorescentieintensiteit van de gekleurde marker en vergelijk deze intensiteit met de achtergrond. Gebruik de schuifpositie in de laatste multiplex als de gekleurde markeringsintensiteit ten minste vijf keer hoger is dan de achtergrond.

Kies bij het beitsen van de multiplex de juiste volgorde voor elk antilichaam en wijs elke fluorofolaat toe aan een antilichaam. Ga verder met het bevlekken van de multiplex zoals eerder beschreven en bereid een lege dia voor die antilichaamverdunningsmezzo, fluorofofofontdunningsmlus en TBST ontvangt in plaats van primair antilichaam, fluorofofof of DAPI. Wanneer u klaar bent om de multiplex op de microscoop in te beelden, stelt u de belichting in op 250 milliseconden voor alle kanalen en legt u elk beeld vast met BEHULP van DAPI om zich te concentreren.

Gebruik vervolgens de analysesoftware om elk multiplex te evalueren door fluorescerende valse kleur en door pathologieweergave, die de specificiteit van elke marker zal bevestigen. Om het succes van de multiplextest te garanderen, moet een monoplex-test worden uitgevoerd om de volgorde van elk antilichaam te bepalen. Bijvoorbeeld, wanneer Foxp3 is in de derde positie van de array, specifieke en robuuste kleuring en colocalisatie met CD3 wordt aangetoond.

Wanneer Foxp3 daarentegen op de eerste positie staat, treedt niet-specifieke kleuring van Foxp3 op. Korrelige en effuse gebieden van rood zijn aanwezig op het grootste deel van de dia, en fluorescerende intensiteit van deze gebieden is laag. Een andere belangrijke stap in deze test is de DEPI tegenstaining, dat is de basis voor cel identificatie en verdere analyse.

Er is een duidelijk contrast te zien tussen afbeeldingen met werkende en niet-werkende DAPI. Voor de multiplex test, mooie samengestelde beelden niet altijd een nauwkeurige vlek weerspiegelen. Terwijl CD3 wordt gevisualiseerd en specifieke kleuring toont, bewijst de pathologie brightfield view van CD163 dat het antilichaam niet-specifiek is.

Een optimaal multiplexbeeld toont specifieke kleuring in een samengesteld beeld, en de CD3 en CD163 specificiteit wordt bevestigd met de pathologie brightfield view. Na deze procedure kunnen zelf-fenotypering en ruimtelijke analyseberekeningen worden uitgevoerd om cel- tot celinteracties verder te analyseren. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om ruimtelijke patronen van cellen en intact weefsel te verkennen, waardoor ons begrip van de tumor immuunmicro-omgeving wordt versterkt.