Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

De grote hoeveelheid biologische informatie die wordt verkregen uit de multiplex barcoding beeldanalyse stelt wetenschappers in staat om de micro-omgeving van de tumor en de speciale verdeling binnen tumorcellen beter te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het ons veel meer gedetailleerde informatie geeft van hetzelfde weefselmonster met de mogelijkheid om diepere fenotypering van individuele cellen te doen. Deze methode stelde aanpasbare panelen in staat om de micro-omgeving van tumoren te bestuderen om mogelijk voorspellende biomarkers in kankerweefsel te ontdekken om te gebruiken als nieuwe doelbehandeling.

Om te beginnen met de oligonucleotide geconjugeerde antilichaamkleuring, week de deksel slips in 0,1% Poly-L-Lysine-oplossing gedurende 24 uur, bij kamertemperatuur om ze voor te bereiden op weefselplaatsing en hechting. Na het aftappen van de Poly-L-Lysine-oplossing, was u de afdekslips gedurende 30 seconden met ultrapuur water. Verwijder na het wassen de afdekstroken uit het ultrazuivere water en leg ze op een pluisvrije handdoek om 's nachts te drogen.

Plaats 5-micron-dikke delen van het weefsel van belang op het midden van een Poly-L-Lysine-geladen afdekslip en laat ze een nacht drogen. Verwarm een afdekplaathouder een nacht voor in een oven op 60 graden Celsius. Plaats de afdekbrief met weefselsecties in de voorverwarmde houder.

Nadat je het 30 minuten op 60 graden Celsius hebt gebakken, controleer je of de paraffine uit het weefsel is gesmolten. Plaats de afdekkerhouder met het monster snel achtereenvolgens, in een reeks oplossingen. Plaats ten slotte de afdekkerhouder gedurende twee rondes van elk vijf minuten in DEPC-behandeld ultrapuur water.

Bereid een vochtkamer voor door een met water doordrenkte papieren handdoek op de bodem van een lege pipetpuntdoos te plaatsen. Vul een snelkookpan met water, genoeg om de helft van de hoogte van een bekerglas van 50 milliliter te bedekken. Doe 5 milliliter methanol per monster in een bekerglas bij 4 graden Celsius.

Verdun het vereiste volume AR9-buffer tot 1X met diethylpyrocarbonaat of met DEPC behandeld ultrapuur water. Vul vervolgens een glazen bekerglas van 50 milliliter met ongeveer 40 milliliter van de verdunde AR9-buffer. Dompel het monster onder in de afdeksliphouder in het bekerglas en bedek het bekerglas volledig met aluminiumfolie.

Plaats het met aluminiumfolie bedekte bekerglas in de met water gevulde snelkookpan en kook gedurende 20 minuten op ongeveer 15 PSI. Verwijder vervolgens het bekerglas en pak de aluminiumfolie voorzichtig uit. Laat het bekerglas ongeveer 10 minuten afkoelen bij kamertemperatuur.

Verwijder de afdekkerhouder uit de 1X AR9-buffer. Incubeer het tweemaal in DEPC-behandeld ultrapuur water gedurende twee minuten. Haal ondertussen de hydratatiebuffer, het antilichaamverdunningsmiddel en de blokkerende oplossingen N, G, J en S uit de multiplexed imaging kleuringskit.

Plaats het afdekslipmonster tweemaal gedurende twee minuten in 5 milliliter van de hydratatiebuffer. Plaats vervolgens het afdekslipmonster in 5 milliliter van het multiplexed imaging antilichaamverdunningsblok en incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens de incubatie de antilichaamcocktail voor.

Plaats na incubatie de afdekplaat in de eerder voorbereide vochtigheidskamer. Pipetteer 190 microliter van de antilichaamcocktail op het afdekmonster en incubeer gedurende drie uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens het monster twee keer, elk met 5 milliliter van het multiplexed imaging antilichaam verdunningsblok gedurende twee minuten.

Om de gebonden antilichamen tegen het weefsel te fixeren, incubeer je de afdekstroken gedurende 10 minuten in 16% formaldehyde verdund tot 1,6% met opslagoplossing en was je ze drie keer met PBS. Na het incuberen glijdt de hoes vijf minuten in methanol, voorkoelen tot 4 graden Celsius. Incubeer na het wassen de afdekslip opnieuw gedurende 20 minuten, in 5 milliliter van het fixerende reagens verdund met PBS, en was ze drie keer met PBS voordat u ze bewaart.

Bereid de reporter master mix voor volgens de compositie die in de tekst wordt genoemd. Vul een put in een plaat met 96 putten met 245 microliter van een oplossing die de reporter-mastermix en de specifieke fluoroforen met streepjescode voor die experimentele cyclus bevat. De figuur toont een reporterplaatconfiguratie die hier wordt gebruikt voor een carcinoompaneel.

Om de fluoroforen met streepjescode te beschermen, plakt u een folieplaatdeksel over de 96-well reporterplaat en plaatst u de plaat in het gemultiplexte beeldvormingsinstrument. Kalibreer de focus van de beeldvorming met behulp van het DAPI-kanaal door een monsterafdekkingslip op het microscoopstadium te plaatsen en handmatig 700 microliter van een 1:1500-titratie van een nucleaire vlekoplossing op het weefsel te pipetteren. Om het multiplexed imaging-instrument voor te bereiden, verdunt u 10X multiplexed imaging buffer tot 1X met behulp van DEPC-behandeld ultrapuur water en vult u reagensflessen met geschikte oplossingen of oplosmiddelen.

Stel alle microscoopparameters in en selecteer de interessegebieden op de afdekkingsstrook van het monster die moet worden afgebeeld. Voer het experimentele ontwerp in de instrumentbeheersoftware in. Klik op de knop Experimenteren in de besturingssoftware en klik in het venster Experiment instellen en beheren op de knop Nieuwe sjabloon.

Typ de projectnaam in de ruimte naast de knop Project en voer het totale aantal cycli in. Klik op de knop Kanaaltoewijzing, typ de informatie voor elke cyclus in de kolommen, zoals de juiste cyclus, putnummers, Z-stackplaatsen, markeringsnaam, klasse en belichtingstijd voor elke cyclus. Start vervolgens het experiment door op Experiment starten te klikken en sla het experiment op.

Klik op het QuPath-pictogram op de computer en open de software. Sleep het qptiff-bestand naar het viewervenster. Klik op de knop Helderheid en contrast om het venster Helderheidscontrast te openen.

Schakel de markering in de geselecteerde kolom in of uit om het markeringssignaal weer te geven of te verbergen. Klik op de knop Zoom om te passen om in of uit te zoomen op het interessegebied. Bij weergave met behulp van beeldanalysesoftware toonden de samengestelde afbeeldingen alle markeringen of geselecteerde markeringen naar wens.

De signaalintensiteit, het dynamisch bereik en de ruimtelijke verdeling van alle markers werden onthuld. Deze techniek maakte de analyse van alle 26 markers op subcellulair niveau in een enkele weefselsectie mogelijk. Door het multiplex-beeldanalyseproces te volgen, kunnen door informaticabenaderingen de hoogdimensionale eencellige gegevens worden verwerkt en geanalyseerd om biologisch en klinisch inzicht af te leiden.

Multiplexing barcoding beeldanalyse is een krachtige methodologie die wetenschappers in staat stelt om tumorweefsel te profileren en hun onderzoeksvraag te beantwoorden op basis van de markers in de panels.