De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Dit protocol maakt gebruik van alle belangrijke kenmerken van de AFM, niet vatbaar voor andere single molecule technieken. Als gevolg hiervan zijn we in staat om de structuur van het nucleosoom op nanoschaal op te lossen. Belangrijk is dat directe visualisatie van nucleosomen werd gedaan onder fysiologische omstandigheden.

Met behulp van onze AFM-techniek hebben we onlangs unieke eigenschappen van het centromere nucleosome onthuld die een rol kunnen spelen in de functie van de hele centromere. De getoonde methode wordt momenteel toegepast in ons lab om zelfassemblage van eiwitten in verband met de vorming van amyloïde aggregaten te onderzoeken. Deze eiwitaggregaten leiden tot de ontwikkeling van verwoestende ziekten zoals Alzheimer en Parkinson om er een paar te noemen.

De eenvoudige bereidingsmethoden zijn ook van toepassing op andere eiwit-DNA complexen, waaronder grote systemen zoals DNA-replicatiemachines. Hoewel sommige wijzigingen nodig zijn. Om nucleosoomdeeltjes op het niveau van één molecuul te karakteriseren met behulp van statische en time-lapse atoomkrachtmicroscopie, begint u met het zuiveren, assembleren en valideren van de nucleosomen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Bereid vervolgens het mica-oppervlak voor op statische AFM-beeldvorming. Om dit te doen, eerst een vijftig millimolar APS voorraad oplossing in gedeïmiseerd water. Bewaar een milliliter aliquots van deze oplossing op vier graden Celsius, totdat het nodig is.

Bereid uit de voorraadoplossing een werkende APS-oplossing voor mica-modificatie door 50 microliter van de 50 micromolar APS-voorraad op te lossen in 15 milliliter gedestilleerd water. Meng de oplossing en vul vervolgens een cuvette met de oplossing. Snijd vervolgens een bij drie centimeter stroken mica van hoogwaardige mica-platen.

Controleer of het stuk past wanneer diagonaal geplaatst in een cuvette. Dan, kloven lagen van de mica totdat beide zijden zijn vers gespleten, en het stuk is zo dun als 0,1 millimeter. Plaats onmiddellijk het micastuk in de APS gevulde cuvette en broed de mica gedurende 30 minuten uit.

Breng het mica-stuk over op een cuvette gevuld met gedestilleerd gedeïsized water en geniet het gedurende 30 seconden. Gebruik vervolgens argon om beide zijden van de APS mica strip volledig te drogen. Breng dubbel geconfronteerd plakband op verschillende magnetische pucks en plaats ze aan de zijkant.

Snijd vervolgens het APS mica-substraat tot een centimeter bij één centimeter en bedek ze in een schone petrischaal. Bereid vervolgens drie verdunningen van de geassembleerde nucleosomen met behulp van een 0,22 micron gefilterde buffer met 10 millimolar hepes en vier millimolar magnesiumchloride bij een PH van 7,5. Om het verlies van nucleosomen te beperken, moet bij de lage eindconcentratie de verdunning één voor één worden uitgevoerd, onmiddellijk voorafgaand aan de afzetting op het APS-mica.

Deponeren vijf tot 10 microliter van elk nucleosoom monster in het midden van een APS mica stuk en laat ze incubeer voor twee minuten. Spoel vervolgens het monster voorzichtig af met twee tot drie milliliter gedestilleerd water om de buffercomponenten te verwijderen. En droog het gedeponeerde monster onder een lichte stroom argon.

Om te beginnen, monteer een tip op de tip houder van de AFM setup. Monteer vervolgens het eerste monster op het AFM-podium, waarbij u voorzichtig bent om geen contact op te nemen met het monsteroppervlak. Plaats de laser over de cantilever totdat de som op het maximum is en pas de verticale en laterale afbuigingswaarden aan op bijna nul.

Stem vervolgens de AFM-sonde af om de resonerende frequentie te vinden, pas de aandrijfamplitude aan en stel de beeldgrootte in op 100 bij 100 nanometer. Klik op de knop Engage om de aanpak te starten. Wanneer de aanpak is voltooid, optimaliseert u geleidelijk het ingestelde amplitudepunt totdat het oppervlak van het monster duidelijk zichtbaar is.

Verhoog vervolgens de scangrootte tot één micron bij één micron en de resolutie naar 512 bij 512 pixels. Klik tot slot op de opnameknop om te beginnen met het verwerven van afbeeldingen. Gebruik lijm van de glazen staafscanner om een glazen staaf aan de AFM-scannerfase te bevestigen.

Laat dit minimaal 10 minuten drogen. Maak ondertussen 0,1 millimeter dikke ronde stukjes mica met een diameter van 1,5 millimeter door ze uit een grotere micaplaat te ponsen. Gebruik de hoge snelheid AFM mica glazen staaf lijm om dit mica stuk te bevestigen aan de glazen staaf op de hoge snelheid AFM, en laat het onaangeroerd blijven voor een minimum van 10 minuten, terwijl het droogt.

Dan, kloven lagen van de mica met behulp van een drukgevoelige tape tot een goed gespleten laag is te zien op de tape. Verdun vervolgens een microliter van 50 millimolar APS-voorraad in 99 microliter gedestilleerd water om een 500 micromolar APS-oplossing te maken. Deponeer 2,5 microliter van de oplossing op het vers gespleten mica-oppervlak en laat het oppervlak 30 minuten functionaliseren.

Na de incubatie spoelt u de mica meerdere malen af met gedestilleerd gedeïsiseerd water door drie microliter spoelingen aan te brengen. Verwijder het water volledig na elke spoeling door het plaatsen van een niet-geweven doekje aan de rand van de mica. Na de laatste spoeling, plaats drie microliters van gedestilleerd gedeïmiseerd water op het oppervlak, en laat het zitten voor een minimum van vijf minuten om niet-specifiek gebonden APS te verwijderen.

Plaats vervolgens de sonde in de hoge snelheid AFM-houder en plaats de houder op het AFM-podium met de punt naar boven gericht. Spoel de houder af met 100 microliters gedestilleerd gedeïmiseerd water, gevolgd door twee 100 microliter spoelingen van 0,22 micron gefilterd nucleosoom beeldvorming buffer. Vul met de spoelingen de kamer met 100 microliters van nucleosoom beeldvormingsbuffer, onderdompel de punt.

Pas de cantilever positie aan totdat deze met de laser wordt geraakt. Spoel vervolgens de APS mica vijf keer met gefilterde nucleosoom imaging buffer, met behulp van vier microliters per spoeling. Verdun een microliter van de nucleosoom assemblagevoorraad in 250 microliter van gefilterde nucleosoom beeldvormingsbuffer voor een definitieve nucleosoomconcentratie van één nanomolar.

Deponeren 2,5 microliter van deze verdunning op het oppervlak en laat het zitten voor twee minuten. Spoel het oppervlak twee keer met vier microliters van nucleosoom imaging buffer om te voorkomen dat over verdringing. Laat na de laatste spoeling het oppervlak bedekt met beeldbuffer.

Stel de scanner en het monster op de top van de tiphouder in, zodat het monster naar beneden wordt geselt. Gebruik de automatische benaderingsfunctie met de ingestelde puntamplitude dicht bij de vrije oscillatieamplitude om te beginnen. Pas het ingestelde punt aan totdat het oppervlak goed wordt bijgehouden.

Stel vervolgens het beeldgebied in van ongeveer 150 bij 150 nanometer op 200 bij 200 nanometer met de gegevensverwervingssnelheid van ongeveer 300 milliseconden per beeldvormend frame. Als controle voor de assemblage en depositie werden H3 mononucleosomen voorbereid en afgebeeld met behulp van statische AFM. Deze afbeelding biedt een momentopname van de nucleosoom populatie zoals deze bestond vlak voor de afzetting bevestigt dat nucelosomen met succes werden geassembleerd.

Met de H3 controle assemblage een succes, werden de gepresenteerde methoden vervolgens toegepast op de studie van CENP-A nucleosomen. Statische AFM beeldvorming van dit monster bleek de montage was een succes. Uit de statische AFM-beelden kon het hoogte- en draaiaantal mononucleosomen worden gekarakteriseerd.

Zowel de hoek tussen de vrije DNA-armen als de lengte van de vrije DNA-armen worden gebruikt om het aantal DNA-bochten in het individuele nucleosoom te bepalen. Daarentegen kan time lapse AFM-beeldvorming van de nucleosomen worden gebruikt om het algehele spontane uitpakgedrag van de nucleosomen te visualiseren. Naarmate het draaiaantal van het nucleosoom afneemt, wordt ook een overeenkomstige afname van het nucleosoom kernvolume waargenomen.

Naast de reguliere time lapse imaging, hoge snelheid time lapse AFM kan worden gebruikt om de meer ingewikkelde nucleossome dynamiek die wordt gemist met behulp van standaard time lapse imaging sonde. Het vermogen van deze techniek om de dynamiek vast te leggen over een lange periode van tijd was essentieel voor de visualisatie van een lange afstand translocatie van een CENP-A nucleosoom kern, die werd vastgelegd in de loop van 1200 frames. Deze techniek was ook van cruciaal belang bij het vastleggen van de zeldzame overdracht van een CENP-A nucleosoom kern van het ene DNA-substraat naar het andere.

De snelle beeldopnamesnelheid maakte visualisatie van deze dynamische gebeurtenis mogelijk omdat er slechts meerdere frames nodig waren om te voltooien. In het brede chromatineveld zijn er een reeks belangrijke vragen met betrekking tot de rol van liger histonen en histonvergroting van de chromatinedynamica. Al deze vragen kunnen worden beantwoord met behulp van onze techniek.