Voorbereiding van Poly(pentafluorophenyl acrylate) matiemaatschappij SiO₂ parels eiwitreiniging

Deze methode kan worden gebruikt om biomolecuul-geactiveerde oppervlakken voor te bereiden, die toepassingen hebben op gebieden zoals de levering van geneesmiddelen, biologische doeldetectie en bioscheiding. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de poly PFPA borstels zeer reactief zijn met amines, en de immobilisatie van antilichamen wordt bereikt door incubatie in bufferoplossing voor een paar uur. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de eiwitzuivering door middel van immunozuivering, omdat het geïmmobiliseerde antilichaam met succes kan binden met doelantigenen.

Hoewel deze methode is aangetoond voor antilichaam mobilisatie en eiwitzuivering, het kan ook worden toegepast op andere systemen die biomoleculaire mobilisatie. Voor de behandeling van siliciumdioxidekralen met APTES, moet u eerst siliciumdioxidedeeltjes verkrijgen in de vorm van een waterige suspensie van 5%. Combineer 0,8 milliliter siliciumdioxide suspensie met 40 milligram APTES en acht milliliter methanol in een 20 milliliter scintillatie flacon uitgerust met een roerstaaf.

Laat de reactie vijf uur lang op kamertemperatuur met krachtig roeren doorgaan. Breng de oplossing na vijf uur over op een conische buis. Om de aptes gefunctionaliseerde siliconendioxidekralen te isoleren, centrifugeert de oplossing gedurende vijf minuten op 10.000 G.

Verwijder vervolgens de supernatant. Was nu de kralen door ze te verdringen in drie milliliter verse methanol. Schud de buis met de hand voor het mengen, maar indien nodig, het verbeteren van de dispersie door sonicatie in een waterbad voor een paar seconden.

Centrifugeren als voorheen, en herhaal de wasstap nog een keer. Combineer de methanol wassen siliconen dioxide kralen met drie milliliter dimethylsulfoxide, of DMSO. Schud het mengsel met de hand, of indien nodig, sonicaat gedurende een paar seconden totdat de kralen volledig zijn verspreid in de DMSO.

Na centrifugatie op voor, verwijder de supernatant. Herhaal de centrifugatie stap een laatste keer om volledige oplosmiddel uitwisseling van methanol naar DMSO te garanderen. Los 20 milligram poly PFPA op in twee milliliter DMSO in een 20 milliliter scintillatiefolie.

Los amine gefunctionaliseerde PEG op in één milliliter DMSO om peg-oplossing voor te bereiden. Breng de PEG-oplossing nu over op de poly PFPA-oplossing. Reageer een uur lang bij kamertemperatuur met krachtig roeren.

Breng een milliliter van de APTES gefunctionaliseerde siliciumdioxide kralen opgehangen in DMSO in de PEG vervangen poly PFPA oplossing. Laat de enting tussen poly PFPA en APTES gefunctionaliseerde siliciumdioxidekralen een uur lang op kamertemperatuur gaan met krachtig roeren. Isoleer de kralen vervolgens door centrifugatie op 10.000 G gedurende vijf minuten, gevolgd door het verwijderen van de supernatant.

Was de kralen door het toevoegen van drie milliliter DMSO, en meng met de hand of met een paar seconden van sonicatie. Centrifugeren de kralen als voorheen. En verwijder de supernatant voordat u de DMSO-was twee keer herhaalt.

Was de kralen nog twee keer met drie milliliter drievoudig gedestilleerd water. Meng vervolgens met de hand of met een paar seconden van sonicatie. Centrifuge de kralen als voorheen en verwijder de supernatant.

Ten slotte droog de kralen op 40 graden celsius in een vacuüm oven 's nachts. Voeg vijf milligram poly PFPA geënte siliciumdioxide kralen toe aan een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Was de kralen door het toevoegen van 800 microliter pbs, en meng goed door vortexing.

Centrifugeren de kralen op 10.000 G bij kamertemperatuur gedurende een minuut. Verwijder de supernatant en herhaal de wasstap drie keer. Voeg nu 350 microliter verse PBS, 50 microliter van 0,1%PBST en 6,67 microgram van het antilichaam toe.

Incubeer ongeveer 20 uur op een rotator bij vier graden Celsius. De volgende dag, was de kralen en centrifuge op 400 G en vier graden celsius voor een minuut. Verwijder vervolgens de supernatant en voeg voorzichtig 400 microliters lyse buffer toe.

Voorzichtig resuspend de kralen door pipetting op en neer vijf keer. Herhaal deze wasstap drie keer. Verwijder na de laatste wasbeurt zoveel mogelijk van de supernatant.

Cellen en lysisbuffer voorbereiden zoals beschreven in het tekstprotocol. Dan resuspend de cel pellet met 400 microliters van de lyse buffer. Sonicate de cellen met behulp van een ultra sonicator.

Na sonicatie, vortex kort. Dan centrifugeren het lysaat op 20,000 G op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng de supernatant over op een nieuwe, 1,5 milliliter centrifugebuis.

Om immunoprecipitatie uit te voeren, moet u 300 microliter cellysaat overbrengen naar eerder voorbereide antilichaam geïmmobiliseerd poly PFPA geënte siliciumdioxidekralen. Bewaar 30 microliter van de cellysaat als inputmonster in een nieuwe microcentrifugebuis. Incubeer de lysate kralen mengsel gedurende drie uur op een rotator op vier graden celsius.

Na incubatie, centrifugeren het mengsel op 400 G op vier graden Celsius gedurende een minuut. Verwijder de supernatant, en voeg voorzichtig 400 microliter wasbuffer. Voorzichtig resuspend de kralen door pipetting op en neer ongeveer vijf keer.

Na drie wasbeurten, verwijder zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk. Voeg 30 microliter van 2x SDS ladingkleurstof toe aan de kralen en aan het invoermonster. Verwarm ze dan 10 minuten bij 95 graden Celsius.

Na het verwarmen, analyseren van het monster met behulp van westerse blotting, of bewaar het monster op min 20 graden Celsius. De gefunctionaliseerde silica kralen worden onderzocht door x-ray foto-elektronecosspectroscopie, of XPS, om de samenstelling van het oppervlak te bepalen. Representatieve XPS-gegevens worden hier weergegeven.

Na de behandeling met APTES wordt de stikstof1s-piek in verband met de aminegroepszone APTES gedetecteerd. Na de poly PFPA-behandeling wordt de fluor 1s-piek die geassocieerd is met de PFP-eenheden op het polymeer gedetecteerd. Eiwit kinase RNA geactiveerd, of PKR verrijking door middel van immunoprecipitatie wordt uitgevoerd, en de gezinspeelde eiwit monster worden geanalyseerd met behulp van westerse blotting.

Zoals verwacht, kralen geïmmobiliseerd zonder antilichaam, of een niet-specifieke antilichaam mixuture tonen geen PKR herstel. De kralen geïncubeerd met anti-PKR kan met succes verrijken PKR zoals aangegeven door de aanwezigheid van een PKR-band en de afwezigheid van GAPDH band. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat bij het vergelijken van systemen, de IP-experimenten evenals de daaropvolgende westerse blotting analyse moet gelijktijdig worden gedaan.

Na de ontwikkeling kan deze techniek worden gebruikt voor de immobilisatie van verschillende biomoleculaire of materiële substraat. Bovendien heeft deze methode het extra voordeel van het afstemmen van alleen oppervlakte-eigenschappen die moeten worden afgestemd op de behoefte van elke toepassing.