Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Dit protocol beschrijft de nieuwe techniek voor gelijktijdige verrijking van meerdere PTM's met antilichamen, gevolgd door gegevensonafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologisch inzicht te krijgen in site lokalisatie en cross-talk. Dit is een tijd- en kosteneffectieve techniek die gelijktijdige identificatie en kwantificering van peptiden mogelijk maakt met snijwerk dat acetylatie en succinylation-PTMs bevat met slechts kleine hoeveelheden monsterinvoer. Het volgen van post-translationele wijzigingen is een belangrijke stap in het karakteriseren en bestrijden van verschillende ziektetoestanden.

We zijn ons er al van bewust dat bepaalde vormen van kanker en diabetes sterk gereguleerd zijn door deze eiwitmodificaties. Deze methode kan theoretisch van toepassing zijn op alle PTM's met antilichamen voor verrijking, zoals alomtegenwoordigheid, fosforylatie en anderen. Het kan ook van toepassing zijn op andere weefselsoorten of celkweekmodellen.

De sleutel tot het verkrijgen van waardevolle gegevens met behulp van deze techniek is reproduceerbaarheid. Dit kan worden bereikt door ervoor te zorgen dat alle stappen zeer zorgvuldig worden uitgevoerd, met name de stappen waarbij de antilichaamkralen betrokken zijn. Om te beginnen, verkrijgen cartridges met C18 hars die gecombineerd tot 10 milligram eiwit.

Plaats deze cartridges in een vacuümapparaat. Voeg 800 microliter van 80% acetonitril en 0,2% mierenzuur toe aan de cartridges met 19,8% water en start vacuümzuiging om de vloeistof erdoorheen te trekken. Herhaal deze stap een keer het vermijden van het drogen van de cartridges volledig.

Equilibrate de cartridges door het toevoegen van 800 microliters van 0,2%mierenzuur in water met vacuüm zuigkracht. Herhaal dit twee keer. Laad een milligram peptiden in ongeveer 1.000 microliter oplossing op de cartridges met vacuümzuiging.

Was de peptiden twee maal met 800 microliters van 0,2%mierenzuur in water onder vacuümzuiging. Schik vervolgens 1,5 milliliter microcentrifugebuizen onder elke cartridge om het peptide te verzamelen. Onder vacuüm zuiging, elute peptiden uit cartridges eerst met 800 microliters van 80%acetonitril en 0,2% mierenzuur in 19,8%water dan met 400 microliter van dezelfde oplossing.

Droog de gedesalted peptide monsters volledig in een vacuüm concentrator voor twee tot drie uur. Nu, resuspend de gedroogde peptiden in 1,4 milliliter koude 1X immunoaffiniteit zuivering buffer. Vortex te mengen en zorgen voor een pH van ongeveer 7.

Centrifugeren de monsters op 10,000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Er verschijnt een kleine korrel. Zet de peptiden opzij op ijs tijdens de voorbereiding van antilichaam kralen.

Voeg een milliliter koude 1X PBS toe aan een buis met 100 microliter K-acetyl antilichaamsdrijfmest en een buis met 100 microliter K-succinyl antilichaam kraal drijfmest en mix door pipetteren. Breng de hele oplossing over op nieuwe buizen van 1,5 milliliter en draai 30 seconden in een miniatuurcentrifuge bij kamertemperatuur. Aspirate de PBS het verzorgen om te voorkomen dat aspirating uit eventuele kralen.

Herhaal de was drie keer extra. Vervolgens, resuspend de kralen in ongeveer 440 microliter van PBS. Pipette de kralen meerdere malen goed te mengen.

Met 200 microliter precut tips, breng 100 microliter van elke acetyllysine antilichaam kralen en succinyllysine antilichaam kralen in een nieuwe buis. Spin 30 seconden in een miniatuurcentrifuge en haal de media aan met een gelladertip. De kralen worden nu wit.

Pipette het geresuspended peptide direct op de gewassen kralen en de peptiden met kralen bij vier graden Celsius 's nachts met agitatie incubeertrekken. In de ochtend, draai de peptide monsters op 2,000 keer g gedurende 30 seconden op vier graden Celsius. Verwijder de supernatant met niet-gebonden peptiden en behalve voor toekomstige experimenten indien gewenst.

Voeg een milliliter koude 1X immunoaffiniteit zuivering buffer aan de kralen te wassen en mengen door het omkeren van vijf keer. Draai op 2.000 keer g gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius. Aspirate uit de immunoaffiniteit zuiveringsoplossing en herhaal de immunoaffiniteit zuiveringswasstap nog een keer.

Voeg vervolgens een milliliter koud HPLC-water toe aan de kralen en meng door vijf keer om te keren. Draai op 2.000 keer g gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius. Aspirate uit het water en herhaal het water wassen stap twee extra keren.

Draai een extra tijd op 2.000 keer g gedurende 30 seconden bij vier graden Celsius om het resterende water in de bodem van de buis te verzamelen. Met platte getipte gel laadtips, aspirate uit eventuele extra water dat hebben verzameld. Wees voorzichtig om te voorkomen dat aspirating de kralen.

Voeg 55 microliter van 0,15% trifluoroacetisch zuur in water toe aan de kralen. Incubeer de kralen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur terwijl af en toe op de onderkant van de buis tikt om te mengen. Draai de kralen op kamertemperatuur gedurende 30 seconden in een miniatuurcentrifuge.

Gebruik een platte gekantelde gel laadtip om de eluted peptiden over te zetten in een nieuwe buis. Voeg 45 microliter van 0,15% trifluoroacetisch zuur in water toe aan de kralen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, terwijl het tikken op de onderkant van de buis af en toe te mengen.

Draai de kralen op kamertemperatuur gedurende 30 seconden in de miniatuurcentrifuge. Verwijder de tweede elutie met behulp van een platte gekantelde gel laadpunt en combineer deze met de eerste elutie. Draai de gecombineerde eluted peptiden op 12.000 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om eventuele kralen die over te dragen pellet.

Breng de peptide monsteroplossing over in een nieuwe 500 microliter buis. Bouw de laadmethode om de verrijkte peptidemengsels te laden op een C18 pre-kolom chip en desalt de peptiden opnieuw door te wassen met mobiele fase A op twee microliters per minuut gedurende 10 minuten. Bouw de chromatografiemethode zodanig dat peptiden worden overgebracht naar een analytische kolom en elute met een stroomsnelheid van 300 nanoliters per minuut met een twee tot drie uur durende gradiënt met behulp van mobiele fasen A en B.Specifiek, gebruik maken van een lineaire gradiënt van 5% mobiele fase B tot 35% mobiele fase B over 80 minuten.

Vervolgens, ramp de mobiele fase B tot 80% over vijf minuten dan houden op 80% B gedurende acht minuten alvorens terug te keren naar 5%B voor een 25-minuten re-equilibration. Bouw vervolgens een MS-instrumentmethode voor gegevensafhankelijke acquisitie. Voor experiment één, instellen MS1 precursor ion scan van M / Z 400 tot 1, 500.

Stel de duur in op 120 minuten. Maak een IDA-experiment en klik op OK. Stel onder het tabblad switchcriteria de intensiteitsdrempel in om MS/MS-scans voor ionen van geladen toestanden te activeren tussen twee tot vijf tot 200 tellingen per seconde. Stel de dynamische uitsluiting van precursorionen in op 60 seconden.

Voor experiment twee stelt u MS/MS productionscan in met een MS2-scanbereik van M/Z 100 tot 1,500. Klik op parameters bewerken en stel de botsingsenergiespread in op vijf en selecteer de ionenscanmodus met hoge gevoeligheidsproducten. Tot slot, plaats het monster in de autosampler.

Dien de voorbeeldwachtrij in en start LC-MS/MS-acquisitiemethoden bij het bouwen van een MS-instrumentmethode voor gegevensonafhankelijke acquisitie en het definiëren van twee instrumentscanexperimenten. Voer MS1 precursor ion scans uit van 400 tot 1, 250 massa om op te laden en de duur in te stellen op 120 minuten. Stel de botsingsenergie die wordt uitgespreid op 10 en accumulatietijd in op 45 milliseconden en selecteer vervolgens de ionenscanmodus met een hoge gevoeligheid.

Importeer vervolgens een tekstbestand met de 64 variabele dia swath-acquisitieregeling voor het venster om SWATH-acquisitievensters in de methode te vullen. In deze overnameregeling worden variabele vensters variërend van vijf tot 90 massa op te laden en breedte doorgegeven in incrementele stappen over de volledige massa bereik van 400 tot 1, 250 massa op te laden met een totaal van 64 SWATH segmenten elk met een 45 milliseconde accumulatie tijd. Pas de ms1-accumulatietijd aan op 0,25 seconden.

Samen moeten de MS1-scan en 64 MS2-scans nu een totale cyclustijd van 3,2 seconden opleveren. In deze studie, experimentele resultaten gedocumenteerd de mogelijkheid van het opsporen en beoordelen van PTM cross-talk. In deze tabel ziet u hoe de tijdlijn van de werkstroom en de benodigde hoeveelheden monster en eiwit.

De one-pot methode kan worden uitgevoerd in de helft van zoveel tijd en met de helft van het aantal monsters als deze alternatieve methoden. De mediane variatiecoëfficiënt voor de gemodificeerde peptidegebieden was in de éénpotmethode lager dan in de enkele PTM- en seriële PTM-verrijking. Hoewel de ptm met één pot en de afzonderlijke PTM-verrijkingsmethoden werden vergeleken, waren er geen noemenswaardige verschillen zichtbaar tussen de correlaties van de kwantificering op locatieniveau voor de twee wijzigingen.

Dit cijfer toont gegevens van een succesvolle verrijking en illustreert een voorbeeld voor een peptide dat veelvoudige en verschillende acylwijzigingen bevat die PTM cross-talk visualiseren. Een peptide werd geacetyleerd op een lysine residu en bondig op de andere, terwijl hier hetzelfde peptide werd beknopt op beide lysines. Dit toont aan dat hetzelfde lysineresidu met beide acyleratiegroepen kan worden gewijzigd en dat er een mogelijkheid bestaat dat er op die locatie sprake is van cross-talk.

Het is essentieel om ervoor te zorgen dat elk monster dezelfde hoeveelheid kralen bevat en ervoor te zorgen dat geen van de kralen per ongeluk worden aangezogen bij het wassen van peptide obligatie kralen. Massaspectrometrie gebaseerde profilering en data-analyse in software tools zoals Spectronaut worden uitgevoerd volgens deze procedure te identificeren, kwantificeren en uit te voeren site lokalisatie van PTM's. Deze dataonafhankelijke acquisitieworkflow in combinatie met gelijktijdige PTM-verrijking opent mogelijkheden om PTM cross-talk efficiënter te beoordelen en betere inzichten te bieden in de relevantie van PTM-signalering.