Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen op het gebied van immunometabolisme te beantwoorden. Het voordeel van deze techniek is dat het de kwantificering van mitochondriën of lysosomen in individuele levende cellen mogelijk maakt, in een complex mengsel van verschillende celtypen. Deze methode voor het bestuderen van T- en B-cellen kan ook worden toegepast op vele andere celtypen, zoals macrofagen, dendritische cellen of primaire cellen die uit een weefselmonster zijn geoogst.

De procedure zal worden aangetoond door Chin-Wen Wei, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om de organellen te labelen voor kwantificering, voeg eerst één keer tien aan de zesde muis T-cellen toe aan één ronde faxbuis onder de bodem per marker. En pellet de cellen door centrifugatie.

voorverwarmd tot 37 graden Celsius serumvrij kweekmedium om de organellespecifieke sondevoorraadoplossingen te verdunnen voor de uiteindelijke werkconcentraties in het medium. En schort de cellen opnieuw op in 100 microliter sondekleurstof per buis. Vervolgens, incubeer de cellen in een cel cultuur incubator voor de juiste kleuring periode, het stoppen van de reactie aan het einde van de incubatie met een milliliter van ijskoude fax buffer per buis.

Verzamel vervolgens de cellen met een andere centrifugatie en schort de pellets opnieuw op in 100 microliters van het vooraf getitreerde 24G2 hybridoma supernatant op ijs. Voeg na tien minuten één milliliter faxbuffer per buis toe. Verzamel de cellen door centrifugatie en label de cellen met 50 microliters van de pre-titrated fluorescentie geconjugeerde antilichaam cocktail van belang.

Voeg de juiste concentratie toe volgens de tabel. En faxbuffer gedurende 20 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Voeg aan het einde van de incubatie één milliliter faxbuffer per buis toe.

Verzamel de cellen door centrifugatie. En schort de cellen opnieuw op in 300 microliter faxbuffer aangevuld met een microgram per milliliter propidiumjodide. Onmiddellijk na het toevoegen van de nucleaire en chromosoom contrastain, zet de stroom cytometer analyse computer, flow cytometer, fax acquisitie software, en andere accessoire-apparaten, afhankelijk van het machineplatform.

Voer PBS ongeveer een minuut door het systeem om ervoor te zorgen dat de stroomlijn is gevuld met PBS en de buffer. Open een nieuw experiment en stel de cytometerparameters in volgens de instructies van de fabrikant. Filter de cellen door een celzeef van 70 micrometer.

En vortex voorafgaand aan de verwerving van elk monster om klonten en doublet formatie te voorkomen. Open de instelling Automatische compensatie en maak puntplots voor elke fluorescerende parameter. Nadat alle spanningen zijn ingesteld, past u de compensatie aan en past u de compensatie toe op de monsters.

Maak een voorwaartse spreiding versus zijverstrooiingsplot en optimaliseer de spanningen zodat de cellen van belang binnen de plot verschijnen. Maak een voorwaartse spreiding versus voorwaartse spreidingshoogte plot en poort de enkele cellen. Maak een voorwaartse spreiding gebied versus kant verstrooiing gebied plot en poort de lymfocyten.

Maak een voorwaartse spreidingsgebied versus propidium jodide plot en poort de levende cellen. Nadat alle spanningen zijn ingesteld, past u de compensatie aan en past u de compensatie toe op de monsters. Laad vervolgens de eerste monsterbuis, maak de juiste celoppervlakmarkeringspercelen en verzamel ten minste 1.000 gebeurtenissen van de populatie van belang.

Wanneer alle monsters zijn uitgevoerd, exporteert u de stroomgegevens voor verdere analyse. En sla het experiment op als een sjabloon om de cytometer-instellingen en parameters voor vergelijkbare experimenten in de toekomst te behouden. De uiteindelijke inhoud van de locatie mitochondriale zijn de laagste in dubbele negatieve T-cellen, piek in dubbele negatieve fase twee en drie, en een lichte afname in dubbele negatieve fase vier.

Met dubbele positieve thymocyten die hogere aantallen mitochondriën aantonen dan CD4 en CD8 enkele positieve thymocyten, wat suggereert dat de mitochondriale inhoud fluctueert tijdens de ontwikkeling. CD4 en CD8 enkele positieve thymocyten vertonen een hogere mitochondriale gemiddelde fluorescentie intensiteit dan miltachtige CD4 of CD8 T cellen, wat suggereert dat naïeve T-cellen die recirculeren in de zuurstofrijke bloedomgeving hebben een nog lagere mitochondriale massa dan thymocyten. Interessant is dat deze vermindering van mitochondriale inhoud is meer prominent in de CD8 dan de CD4 T cellijn, en de T-cel activering verder vermindert de aanwezigheid van deze organellen.

Relatief laag, maar detecteerbaar, lysosomale inhoud worden waargenomen in alle thymocytenpopulaties, met een meer prominente aanwezigheid in dubbele negatieve thymocyten. In de periferie wordt een relatief hoog aantal lysosomen gedetecteerd in het geheugen en effector CD8-positieve T-cellen. Het combineren van organelle specifieke kleurstoffen en oppervlakte marker met flow cytometrie is een krachtige manier om de metabolische status van cellen in een complex mengsel te karakteriseren.

Aanvullende organelle specifieke kleurstof kan worden gebruikt om endoplasmische reticulum, autophagische vacuole, of andere intracellulaire compartiment van belang te detecteren.