Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten
November 8th, 2021
Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.
Ons protocol biedt de wetenschapper een krachtig hulpmiddel voor het combineren van meerdere microparameters op het niveau van één cel van menselijke IPS en hun neuro- en heldere derivaten. Dit protocol maakt het mogelijk om mitochondriale parameters te verbeteren, zowel op het totale niveau als op het specifieke niveau per mitochondriaal volume, met behulp van flowcytometrie. Deze techniek kan worden toegepast op verschillende celtypen, waaronder die van andere neurodegeneratieve ziekten.
Het kan dus helpen inzicht te geven in de mechanismen achter deze ziektetypen en mogelijk ook helpen bij therapeutische screening. Om te beginnen, zaai de cellen afzonderlijk in vier putten in een zes putplaat en incubeer de cellen totdat 50 tot 60% confluentie is bereikt. Bereid aan het einde van de kweekperiode vijf individuele kleuringsoplossingen met verschillende combinaties van kweekmedium, FCCP, TMRE, MTG en mito sokkenspread.
Voeg ze toe aan de respectievelijke putten en incubeer de cellen zoals beschreven in het manuscript. Haal vervolgens het medium uit alle putjes en was met PBS. Voor celloslating incubeer je de cellen met één milliliter celdissociatiereagens bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Neutraliseer het celdissociatiereagens met één milliliter DMEM, aangevuld met 10%FBS. Verzamel vervolgens de putinhoud in een kroniekbuis van 15 milliliter. Pellet de cellen door middel van centrificatie en was de celpellet een of twee keer met PBS.
Adem al het supernatant aan, waardoor er ongeveer 100 microliter in de buis achterblijft. Suspensie de celpellets opnieuw in 300 microliter PBS. Nadat u de celsuspensie in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter hebt overgebracht, houdt u de buis bij kamertemperatuur in het donker.
Analyseer de cellen met behulp van de flowcytometer met de bandpasfilterinstellingen die in het tekstmanuscript worden beschreven. Maak ongeveer 1 miljoen cellen los met behulp van het celdissociatiereagens en pelleteer de cellen zoals eerder aangetoond. Neutraliseer de celsuspensie met DMEM plus 10% FBS en verzamel de suspensie in een buis van 15 milliliter.
Bevestig de cellen met één milliliter van 1,6% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Permeaboliseer de cellen met één milliliter ijskoude 90% methanol bij min 20 graden Celsius gedurende 20 minuten. Blokkeer vervolgens de monsters in één milliliter blokkerende buffer en was de cellen door centrifugatie met PBS, zoals aangetoond.
Om verschillende mitochondriale complexen en subeenheden te detecteren, incubeer de cellen gedurende 30 minuten met de respectieve primaire antilichamen die in het tekstmanuscript worden beschreven. Nadat u de cellen eenmaal met PBS hebt gewassen, incubeert u de cellen gedurende 30 minuten met secundaire antilichamen. Aan het einde van de incubatie, was en suspensie de cellen en PBS opnieuw zoals aangetoond.
Breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, in het donker op ijs. Analyseer vervolgens de cellen op de flowcytometer en detecteer signalen en filter er een met behulp van een 5 30/30-banddoorlaatfilter. Selecteer voor elke celsubpopulatie een histogramplot en analyseer de mediane fluorescentie-intensiteit of MFI van de verschillende filterkanalen.
Bereken de TMRE-niveaus, specifieke waarden voor MMP ROS complexe subeenheid en TFAM, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Flowcytometrie en levende cellen werden gebruikt om MMP mitochondriaal volume en ROS-niveaus te onderzoeken. In POLG DA-neuronen werd een lager specifiek MMP en een hoger specifiek ROS waargenomen, terwijl er geen veranderingen waren in mitochondriaal volume, totale MMP en ROS.
POLG-astrocyten hadden een verminderde MMP, maar geen verandering in mitochondriaal volume en ROS. Flowcytometrie en vaste cellen werden gebruikt om het niveau van MRC-complexe subeenheid en TFAM te onderzoeken. DA-neuronen vertoonden verhoogde complexe één en TFAM versus controle, maar geen verandering in complex twee niveau.
POLG astrocyten vertoonden een reductie van complex één vier en specifiek TFAM. Omdat de celdichtheid ook MMP en de relatie tussen MTG- en MMP-fluorescentie kan beïnvloeden, is dit celspecifiek. Aanpassing van dit protocol aan andere celtypen vereist waarschijnlijk optimalisatie Na deze procedure kan microscopische asis, bijvoorbeeld confocale microscopie, worden uitgevoerd, met aanvullende details over mitochondriale structuren.
Dus, terwijl deze strategie mitochondriale disfunctie detecteert in DA-neuronen en astrocyten van een bekende mitochondriale ziekte, kunnen deze technieken ook worden toegepast om de mitochondriale functie in elk type cel en ziekte te onderzoeken.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe flowcytometrie-gebaseerde methode voor het beoordelen van mitochondriale functionele parameters in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) en hun neuronale derivaten. Het maakt de detectie mogelijk van veranderingen in mitochondriale membraanpotentiaal, niveaus van reactieve zuurstofsoorten en de samenstelling van de mitochondriale ademhalingsketen, wat bijdraagt aan het begrip van mitochondriale disfunctie bij neurodegeneratieve ziekten.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Mitochondriale functie
Achtergrond
- Mitochondriale disfunctie is gekoppeld aan neurodegeneratieve ziekten.
- Deze studie onderzoekt mitochondriale parameters op enkelcelniveau.
- De methodologie streeft ernaar inzichten te verschaffen in ziektemechanismen.
- Evaluatie van mitochondriale gezondheid kan helpen bij therapeutisch screening.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het meten van mitochondriale parameters in enkele cellen.
- Om mitochondriale rollen in neurodegeneratie en mogelijke therapieën te begrijpen.
- Om de detectie van mitochondriale disfunctie in verschillende celtypen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het gebruikte platform is flowcytometrie.
- Menselijke iPS-cellen en hun neuronale derivaten werden geanalyseerd.
- Belangrijke procedures omvatten celcultuur, dubbele kleuring met specifieke fluorescente reportermoleculen en antilichaamlabeling voor mitochondriale analyse.
- Celbehandelingen omvatten dissociatie, fixatie en permeabilisatie, gevolgd door fluorescentiemeting.
- Celtypespecifieke aanpassingen van het protocol werden vermeld.
Belangrijkste resultaten
- Er werden significante verschillen in mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) en niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) waargenomen in POLG-neuronen en astrocyten.
- Verhoogde mitochondriale complexen en TFAM-niveaus werden opgemerkt in DA-neuronen, wat unieke mitochondriale aanpassingen benadrukt.
- Resultaten geven aan dat specifieke celkenmerken invloed hebben op metingen van mitochondriale functie.
- Mogelijkheid voor bredere toepassingen op verschillende celtypen bij het onderzoeken van mitochondriale functies en gerelateerde ziekten.
Conclusies
- Deze studie toont een robuuste aanpak voor het beoordelen van mitochondriale functie in modellen voor neurodegeneratieve ziekten.
- De bevindingen maken verdere exploratie van mitochondriale rollen in cellulaire gezondheid en ziekte mogelijk.
- Deze methodologie kan leiden tot een beter begrip en therapeutische strategieën voor pathologieën gerelateerd aan mitochondriale disfunctie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This flow cytometry method enables multiparametric mitochondrial profiling in human iPSC-derived neural and glial cells, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By quantifying mitochondrial volume, membrane potential, ROS, and respiratory chain components at single-cell resolution, it provides mechanistic de-risking for therapeutic screening. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking mitochondrial phenotypes to disease-relevant cellular states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial dysfunction in iPSC-derived neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric readouts of mitochondrial health.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize mitochondrial parameters in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated iPSC-derived neural and glial systems for compound screening with mitochondrial endpoints.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for mitochondrial volume, MMP, and ROS.
- Scalability: Supports high-content flow cytometry screening across multiple cell lines and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial defects in POLG-associated neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables translational biomarker assessment via TFAM/TOMM20 ratios reflecting mtDNA copy number per mitochondrial volume.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by detecting mitochondrial complex subunit alterations linked to pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neurodegenerative indications involving mitochondrial dysfunction.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking mitochondrial volume, MMP, and ROS to specific cellular phenotypes in iPSC derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining protocols and flow cytometric readouts of mitochondrial function.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mitochondrial respiratory chain subunits and TFAM for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via disease-relevant iPSC models and mitochondrial biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable multiparametric mitochondrial profiling platform applicable across neurodegenerative disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining panels and flow cytometric gating strategies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mitochondrial liabilities in compound libraries.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue mitochondrial complex deficits or ROS elevation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, mitochondrial biology, and iPSC differentiation protocols.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and compensation controls.
- Necessitates standardization of staining concentrations, incubation times, and gating strategies across laboratories.
- Requires optimization when adapting to non-neural cell types or different mitochondrial disease models.
- Limited by the need for live-cell handling for MMP/ROS measurements and fixed-cell protocols for protein detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Flow Cytometry Measurement of Mitochondrial Volume, MMP, and Mitochondrial ROS in Live Cells
2:26
Flow Cytometry Measurement of MRC Complex Subunits and TFAM in Fixed Cells
3:49
Flow Cytometry Analysis
4:14
Results: Flow Cytometry Investigation of iPSC-Derived Neural Cells
5:07
Conclusion
