Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Om de efficiëntie en veiligheid van veelbelovende en nieuwe gentherapiebenaderingen te evalueren, is het is van cruciaal belang dat gengemodificeerde cellen worden getest in gevalideerde preklinische in vivo-modellen. Het behoud van de kruisreactiviteit van reagentia van het gebied van het celoppervlak van reagentia en het vermogen om dezelfde ondersteunende behandelingen toe te passen die aan patiënten worden toegediend langs niet-menselijke primatenmodellen om klinische parameters nauw na te bootsen. Het aantonen van de procedure met mij zal Anai Perez, een onderzoekstechnicus van dr. Hans-Peter Kiem's laboratorium.

Begin met het toevoegen van 10 tot 12 milliliter aliquots van beenmerg geïsoleerd van een gezonde niet-menselijke primatendonor in 50 milliliter conische buizen. Breng het volume van de buis tot 50 milliliter met hemolytische buffer, en incubeer de cellen gedurende maximaal zeven minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de cel puin door centrifugatie, en aanzuigen alle, maar de laatste twee tot vijf milliliter van de supernatant.

Resuspend de pellet in de resterende supernatant volume door flicking de buis, en breng de beenmerg suspensaties in een nieuwe 50 milliliter buis met behulp van een 70 micrometer porie cel zeef om eventuele bloedstolsels te verwijderen. Voeg verse hemolytische buffer toe om het volume tot 50 milliliter te brengen en de cellen nog eens vijf minuten bij kamertemperatuur uit te broeden vóór hun verzameling door middel van centrifugatie. Aspirate alle supernatant en resuspend de cellen in 10 milliliter van max buffer.

Voor het filteren van de cel suspensie door nog eens 70 micrometer porie zeef, spoel de buis met 40 milliliter verse buffer, en vul de was met de cel suspensie. Na het verrijken van cd34 positieve cellen volgens standaard magnetische ondersteunde celsordende protocollen, was de geïsoleerde cellen van de kraal in maximaal 50 milliliter verse maximumbuffer en resuspend de pellet in HSPC-medium. Dan plaat 10 tot 20 milliliter van de cellen in geventileerde weefsel gekweekte behandelde T75 flessen voor hun nachtelijke cultuur in een 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide incubator.

Om de pre- en postverrijkingszuiverheid van de celmonsters van het beenmerg te beoordelen, wordt een stroomcytometrieprotocol gemaakt met de juiste plots en populatiehiërarchie met alle poorten voor alle gebeurtenissen verspreid, CD34 positieve, hematopoietische stamcellen, multipotente an-erythro myeloïde voorlopers en lymfoele myeloïde voorlopers. Voer vervolgens een onvervangd, voorverrijkingsmonster uit om de spanningen voor de voorwaartse en zijverstrooiingsparameters aan te passen, en alle fluorescentiekanalen, gevolgd door enkele gekleurde compensatiekralen om de compensatie tussen aangrenzende kanalen aan te passen. Voer vervolgens alle resterende niet-gekleurde en gekleurde monsters uit met het aangepaste en gecompenseerde protocol om de CD34-verrijkingsefficiëntie te documenteren.

Wanneer alle compensaties zijn ingesteld configureren van de celsorteerder voor het soort zuivering van de CD34 subsets in kolonie vormen celtesten, en laad de gekleurde CD34 verrijkte monster buis op de cytometer. Dan record 2000 tot 3000 gebeurtenissen, en prima aanpassen van de soort poorten aan de signaalsterkte en doelgroep te passen. Wanneer de setup is voltooid verwerven van de cellen aanpassing van de stroomsnelheid tot 500 tot 1000 cellen per seconde, en het sorteren van 800 tot 1200 cellen uit de scatter, CD34 positieve, hematopoietische stamcel, multipotente an-erythro myeloïde voorloper en lymfe myeloïde voorloper poorten in afzonderlijke buizen met 3,6 milliliter kolonie vormen cel per medium buis.

Aan het einde van het soort vortex de collectie buizen, en voeg een milliliter van cel suspensie tot drie steriele 3,5 centimeter, niet-weefsel cultuur behandeld petrischaaltjes ingesteld binnen individuele 15 centimeter petrischaaltjes per cel populatie voor hun 10-14 dagen incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend gebruik maken van een 10 milliliter pipet om voorzichtig spoelen van de aanhangende cellen uit de bodem van elke fles met steriele HBSS, en het verzamelen van de geoogste cellen door middel van centrifugatie. Resuspend de cellen in transductiemedium bij een 1 x 10 tot de 6e cellen per milliliterconcentratie.

En voeg een milliliter cellen voor de mock controle in een put van een recombinant fibronectine fragment gecoate 12 put plaat voor een nachtelijke incubatie in de cel cultuur incubator. Voeg vervolgens 10 milliliter aliquots van de resterende cellen toe in recombinant fibronectine fragment gecoate T75-kolven voor een 30 minuten durende incubatie in de celkweek incubator met de doppen geventileerd. Tijdens de incubatie dooi virus geconditioneerd medium monsters en berekenen van de hoeveelheid virus toe te voegen op basis van de titer en het aantal infectieuze eenheden van cellen per milliliter.

Neem de kolf uit de couveuse en voeg het juiste volume van het virus geconditioneerd medium aan elke kolf toe voordat u de cellen terugk. De volgende ochtend breng de cellen uit de kolf in individuele 50 milliliter conische buizen. Was de cellen in maximaal 50 milliliter HBSS per wasbeurt en herhaal deze stap tot drie keer om het restvirus te verwijderen.

Incubeer de cellen gedurende twee uur in HSPC media aangevuld met prostaglandine E2. Was vervolgens de cellen en resuspend de cellen in 10 milliliter HBSS aangevuld met 2%autoloog serum per buis. Dan aspirate de cel suspensies met behulp van een 20 milliliter spuit uitgerust met een 16,5 meter naald. Was de binnenkant van de buis met verse HBSS plus 2%autoloog serum en zuig in de spuit.

Dop de spuit voorzichtig met de naalddop voordat u de celoplossing op ijs plaatst totdat de infusie in een autologe gastheer wordt geplaatst. Om de genmodificatie-efficiëntie van de getransduceerde cellen te bepalen, plaat 1 x 10 tot de 6e gereserveerde nep- of getransduceerde cellen per milliliter van HSPC-medium op niet-weefselkweek behandelde platen. Op dag twee, vijf en twaalf na de transductie, oogst en tel de cellen.

Op dag twee en vijf, replate 33% van de cellen in verse HSPC medium op een 1 x 10 tot de 6e per milliliter concentratie. Op dag twee, vijf en twaalf bevriezen 33% van de cellen in DNA-extractiebuffer voor kwantitatieve real-time PCR en analyseer de laatste 33% van de cellen door stroomcytometrie volgens standaardprotocollen om de fenotypische samenstelling van het hematopoietische nageslacht te beoordelen. Als u de transgene expressie wilt kwantificeren door cytometrie van de stroom, voegt u drie extra zijverstring vs.

transgene percelen;en poort de eerste plot op de aamvaders stamcellen, de tweede plot op de multipotente an-erythro myeloïde voorlopers, en de derde plot op de lymfe myeloïde voorlopers, alle vs. de transgene. Dan record 2000 tot 3000 gebeurtenissen en prima aanpassen van de soort poorten aan de signaalsterkte en doelgroep te passen.

Met behulp van dit protocol is het aantal niet-menselijke primaten CD34 positieve HSPC's die zijn verrijkt meestal evenredig aan het totale aantal witte bloedcellen. Zoals eerdere bevindingen hebben aangetoond dat het totale CD34 positieve HSPC-product cellen omvat die niet waar zijn op lange termijn en hematopoietische stamcellen enten, kunnen deze flow cytometrie gebaseerde en kolonievormende celtechnieken worden gebruikt om op betrouwbare wijze subsets te identificeren en te differentiëren die zijn verrijkt voor lange termijn hematopoietische stamcellen van geëngageerde voorlopers. CD34 positieve menselijke stamcel verrijkte cellen kunnen efficiënt worden gegenereerde met behulp van lentivirale vectoren.

Cellen met een niet-geïntegreerde kopie van de vector verdunnen gedurende de 12 dagen vloeibare kweektestperiode, terwijl stabiel geïntegreerde vectoren in het genoom worden doorgegeven aan alle nakomelingen. Zoals bevestigd door de expressie van de vector in kolonie vormen celtesten. Deze preklinische methode kan worden gebruikt om genetisch gemodificeerde in kwaliteit gecontroleerde niet-menselijke primaten hematopoietische stam en voorloper cellen te isoleren voor gentherapie.

Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor andere soorten, bronnen van hematopoietische stam- en voorlopercellen, gentherapietools en ziekten. Dit grondig doorgelicht protocol toont grote belofte voor het modelleren van effectieve therapieën voor tal van menselijke ziekten. Houd er rekening mee dat het werken met niet-menselijke primatenweefsels verbeterde beveiligingsmaatregelen vereist, waaronder persoonlijke beschermingsmiddelen.