Generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine

IPSC's van primaten zijn nuttig, maar vaak moeilijk te verkrijgen vanwege ethische en technische kwesties. Dit protocol biedt een zo toegankelijk mogelijk pad voor het genereren en onderhouden van IPSC's van primaten. Het gebruik van urinecellen als primaire bron van IPSC's heeft een groot voordeel omdat ze op een volledig niet-invasieve manier kunnen worden verkregen zonder speciale technieken.

De procedure wordt gedemonstreerd door Jessica Radmer, een promovendus van Wolfgang M.S.Laboratory. Om te beginnen, centrifugeer de urine bevattende buis op 400G gedurende 10 minuten. Zuig vervolgens voorzichtig het supernatant op, laat ongeveer één milliliter in de buis achter en resuspensie de pellet erin.

Was de cellen door 10 milliliter urinewasbuffer met amfotericine toe te voegen en meng de suspensie voorzichtig met behulp van een serologische pipet. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op, waardoor er ongeveer minder dan 0,2 milliliter in de buis achterblijft. Resuspendie van de celkorrel in één milliliter primair urinemedium met amfotericine per 50 milliliter initieel verwerkte urine.

Verwijder gelatine en voeg een milliliter van de suspensie toe aan een put met gelatine gecoate 12-putplaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Om een keldermembraanmatrix gecoat 12 putplaat te bereiden, voegt u 500 microliter keldermembraanmatrix per put toe.

Verplaats de plaat om de vloeistof te verdelen en incuber deze gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Vervang na incubatie de keldermembraanmatrix door 900 microliter REMC-medium en bewaar deze bij 37 graden Celsius tot gebruik. Bereken het volume van Sendai-virussen dat nodig is voor een veelvoud aan infecties van vijf met behulp van de vergelijking.

Ontdooi snel de componenten van de Sendai-herprogrammeringskit in het waterbad getemperd op 37 graden Celsius. Voeg REMC-medium voor een totaal van 100 microliter toe aan een buis voordat u het berekende volume van Sendai-virussen toevoegt en mengt. Na dissociatie van de urinecellen zoals beschreven in het manuscript, telt u de cellen met behulp van de celteller en brengt u het gewenste aantal cellen over naar een buis van 1,5 milliliter.

Verkrijg de pellet door centrifugeren en resuspensie in 100 microliter van het bereide Sendai-virusmengsel. Incubeer de buis gedurende een uur bij 37 graden Celsius voor suspensie-infectie. Voeg na incubatie REMC toe aan een totaal van één milliliter voordat u de celsuspensie zaait in de keldermembraanmatrix gecoate 12-putplaat.

Verander na transductie het medium om de dag tot de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen, of IPSC, kolonies met overschakeling naar PSC-generatiemedium op dag vijf. Wanneer de IPSC-kolonies groot genoeg worden voor klonterpassage, zuigt u het medium uit de gekweekte cellen en wast u de cellen zorgvuldig met 500 microliter DPBS. Voeg na het verwijderen van de DPBS 500 microliter 0,5 millimolar EDTA toe aan de put en incubeer gedurende twee tot vijf minuten.

Observeer de cellen zorgvuldig onder de microscoop totdat de kolonies beginnen los te komen. Wanneer de randen van de kolonies beginnen af te pellen en openingen tussen de cellen zichtbaar worden, verwijdert u de EDTA en voegt u voorzichtig 500 microliter DPBS toe. Zuig de DPBS aan en spoel de put met 500 microliter PSC-kweekmedium met behulp van een P-1000-pipet.

Pipetteer op en neer om de kolonies te verspreiden in klonten van de juiste grootte. Afhankelijk van de samenvloeiing, de gewenste dichtheid van de gezaaide cellen en IPSC-klonale voorkeur, wordt 1/10 tot 1/50 van de celklompsuspensie overgebracht naar de nieuwe putten. Beweeg de plaat voorzichtig een paar keer heen en weer om de klonten gelijkmatig in de put te verdelen.

Incubeer de plaat minstens 30 minuten bij 37 graden Celsius om de klonten te laten hechten. Verander het medium om de twee tot drie dagen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren. Na isolatie zijn plaveiselcellen en verschillende kleinere ronde cellen te zien die met de urine zijn uitgescheiden.

De eerste aanhangende prolifererende cellen zijn te zien en deze cellen groeien uit tot grote kolonies die kunnen worden doorgelaten. Er zijn twee verschillende celtypen te zien, één met een epitheliaalachtig fenotype en de andere met een meer mesenchymaal fenotype met langwerpige vorm. Na de eerste passage groeien urinecellen als een monolaag.

Tijdens de generatie van IPSC zijn enkele aanhangende cellen te zien en deze cellen beginnen morfologische veranderingen te vertonen, wat wijst op herprogrammering van de cellen. Verder vertonen de cellen die kolonies vormen de typische embryonale stamcelmorfologie. Alle gegenereerde IPSC's delen de typische embryonale stamcelachtige koloniemorfologie, gekenmerkt door dicht opeengepakte cellen met duidelijk gedefinieerde randen.

Immunocytochemie werd gebruikt om de expressie van pluripotentie geassocieerde markers in gorilla IPSC's te testen. Bovendien toonde flowcytometrie-analyse aan dat de geanalyseerde orang-oetan IPSC's positief zijn voor TRA-1-60. Bovendien zijn de gorilla IPSC's in staat om te differentiëren in endoderm, mesoderm en ectoderm afstamming.

Een verhoogd aantal gedifferentieerde cellen en een verlies van grensintegriteit en uniformiteit wijzen op een slechte IPSC-kwaliteit. Gedefinieerde randen, strakke cellulaire verpakkingen en prominente nucleoli betekenen daarentegen IPSC's van hoge kwaliteit. Vanwege de coronale variabiliteit moet men de kloonspecifieke omstandigheden optimaliseren, zoals de splitsingsverhouding, passagetiming en klompgrootte om ipsc's van primaten gezond te houden.

Als kwaliteitscontroles van gevestigde IPSC's kan men de pre-potentie verifiëren door directe of indirecte differentiatie-inductie zoals in vitro EV-differentiatie, naast het controleren van markergenexpressie.