Name: Generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer hoe je iPSCs genereert en onderhoudt uit urine-afgeleide cellen van primaten met behulp van Sendai-virussen. Deze niet-invasieve methode ondersteunt ethisch verantwoord stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door DFG EN 1093/5-1 (projectnummer 458247426). M.O. werd ondersteund door JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. Flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van de Core Facility Flow Cytometry in het Biomedical Center München. We willen Makoto Shida en Tomoyo Muto van ASHBi, Kyoto University, bedanken voor hun steun aan videografie.

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

iPSC's zijn waardevolle celtypen omdat ze het mogelijk maken om anders ontoegankelijke celtypen in vitro te genereren. Omdat de uitgangsmaterialen voor herprogrammering, bijvoorbeeld fibroblasten, niet gemakkelijk beschikbaar zijn van alle primatensoorten, presenteert dit artikel een protocol voor het genereren van iPSC's uit van urine afgeleide cellen. Deze cellen kunnen op een niet-invasieve manier worden verkregen, zelfs uit niet-steriele urinemonsters van primaten, door het kweekmedium aan te vullen met bree...

Genomische vergelijkingen van menselijke en niet-menselijke primaten (NHP's) zijn cruciaal om onze evolutionaire geschiedenis en de evolutie van mensspecifieke eigenschappente begrijpen 1. Bovendien maken deze vergelijkingen de gevolgtrekking van functie mogelijk door geconserveerde DNA-sequenties2 te identificeren, bijvoorbeeld om prioriteit te geven aan ziektegerelateerde varianten3. Vergelijkingen van moleculaire fenotypes zoals genexpressieniveaus zijn cruciaal om genomische vergelijkingen beter te interpreteren en om bijvoorbeeld cellulaire fenotypische verschillen te ontdekken. Bovendien hebben ze - vergelijkbaar met vergelijkingen op DNA-niveau - het potentieel om functionele relevantie af te leiden, en dus om medisch relevante variatie binnen mensen beter te interpreteren4. De opname van uitgebreide moleculaire fenotypische gegevens in deze vergelijkende studies vereist geschikte biologische middelen (d.w.z. orthologe cellen tussen soorten). Ethische en praktische redenen maken het echter moeilijk of onmogelijk om toegang te krijgen tot dergelijke vergelijkbare cellen, vooral tijdens de ontwikkeling. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) maken het mogelijk om dergelijke ontoegankelijke celtypen in vitro5,6 te genereren, zijn experimenteel toegankelijk en zijn gebruikt voor primatenvergelijkingen 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Om iPSC's te genereren, moet men de primaire cellen verwerven die opnieuw moeten worden geprogrammeerd. Cellen geïsoleerd uit urine hebben het voordeel dat ze niet-invasief kunnen worden bemonsterd van primaten en dat ze gemakkelijk kunnen worden geherprogrammeerd, waarschijnlijk vanwege hun stamcelachtige moleculaire profielen15. De kweekomstandigheden om iPSC's van primaten in stand te houden zijn net zo belangrijk als herprogrammering; klassiek vereiste de kweek van menselijke pluripotente stamcellen een niet-gedefinieerd, op serum gebaseerd medium en co-cultuur van embryonale fibroblasten van muizen - zogenaamde feedercellen - die essentiële voedingsstoffen en een steiger voor embryonale stamcellen (SER's) leveren16. Sinds de ontwikkeling van chemisch gedefinieerde en feedervrije kweeksystemen17,18, zijn er nu verschillende opties van commercieel verkrijgbare iPSC-kweekmedia en -matrices. De meeste van deze kweekomstandigheden zijn echter geoptimaliseerd voor menselijke SER's en iPSC's en werken daarom mogelijk minder goed in de NHP iPSC-cultuur. In dit videoprotocol geven we instructies voor het genereren en onderhouden van menselijke en NHP iPSC's afgeleid van urinecelkweek.
Sinds het eerste rapport van iPSC-generatie door de geforceerde expressie van gedefinieerde factoren in fibroblasten in 2006, is deze methode toegepast op veel verschillende celtypen van verschillende oorsprong 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Onder hen kunnen alleen van urine afgeleide cellen op een volledig niet-invasieve manier worden verkregen. Op basis van het eerder beschreven protocol van Zhou et al.33 kan men cellen isoleren en uitbreiden uit de urine van primaten, zelfs uit niet-steriele monsters, door breedspectrumantibiotica aan te vullen15. Met name urine-afgeleide cellen bemonsterd door dit protocol vertonen een hoog potentieel om iPSC's te produceren, binnen een kortere periode (kolonies worden zichtbaar in 5-15 dagen) dan de conventionele herprogrammering van fibroblasten (20-30 dagen, in onze ervaring), en met een voldoende hoog slagingspercentage. Deze van urine afgeleide cellen werden geclassificeerd als de gemengde populatie van mesenchymale stamcelachtige cellen en blaasepitheelcellen, waardoor de hoge herprogrammeringsefficiëntie werd veroorzaakt15.
Naast de variatie in primaire cellen, variëren de herprogrammeringsmethoden om iPSC's te genereren ook afhankelijk van het doel van het gebruik. Conventionele herprogrammeringsprocedures voor menselijke somatische cellen werden uitgevoerd door de overexpressie van herprogrammeringsfactoren met retrovirus- of lentivirusvectoren, waardoor de integratie van exogene DNA in het genoom 5,34,35 mogelijk werd. Om de gegenereerde iPSC's genomisch intact te houden, hebben onderzoekers een breed scala aan niet-integratiesystemen ontwikkeld - excisable PiggyBac-vector36,37, episomale vector38,39, niet-integrerende virusvectoren zoals Sendai-virus40 en adenovirus 41, mRNA-transfectie 42, eiwittransfectie 43,44 en behandeling met chemische verbindingen 45. Vanwege de efficiëntie en het gemak in de hantering, worden de Sendai-virusgebaseerde herprogrammeringsvectoren gebruikt in dit protocol. Infectie van primaire cellen wordt uitgevoerd in een 1 h suspensiecultuur van cellen en virussen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 5 voorafgaand aan plating. Deze aangepaste stap zou de kans op contact tussen celoppervlakken en virussen kunnen vergroten, vergeleken met de conventionele methode waarbij de virussen rechtstreeks aan de aanhangende celcultuur worden toegevoegd en dus meer iPSC-kolonies opleveren15.
Passaging van menselijke en NHP pluripotente stamcellen kan worden gedaan door klonterpassing en eencellige passaging. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) is een kostenefficiënte chelaatvormer die calcium- en magnesiumionen bindt en zo de hechtende activiteit van cadherine en integrine voorkomt. EDTA wordt ook gebruikt als een mild, selectief dissociatiereagens, omdat ongedifferentieerde cellen zich losmaken voor gedifferentieerde cellen vanwege hun verschillende adhesiemoleculen. Volledige dissociatie induceert massale celdood van iPSC's van primaten via de Rho / Rho-geassocieerde coiled coil met eiwitkinase (Rho / Rock) -gemedieerde myosinehyperactivatie. Daarom is het aanvullen van het kweekmedium met een Rho/Rock-remmer essentieel voor experimenten waarbij enkele cellen in suspensie nodig zijn46,47. In dit protocol raden we clump passaging aan als de routinematige passaging-methode en bevelen we single-cell passaging alleen aan wanneer dit nodig is, bijvoorbeeld wanneer seeding van gedefinieerde celnummers vereist is, of tijdens sub-cloning.

<table><tbody><tr><td>Accumax&trade; cel loslating oplossing (Detachment solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B-Oplossing</td><td>Merck</td><td>A2941-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human TRA-1-60 Muis Antilichaam&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60064</td><td>Dilution: 1/200</td></tr><tr><td>Anti-Human TRA-1-60 PE-geconjugeerd Antilichaam&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-122-965</td><td>Dilution: 1/50</td></tr><tr><td>Bambanker&trade; (Celvriesmedium)</td><td>Nippon Genetics</td><td>BB01</td><td></td></tr><tr><td>Rundserum Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur multiwell plaat, 12-well CELLSTAR</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Countess&trade; II geautomatiseerde celteller</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>CryoKing&reg; 1.5 mL Tubes met 2D Barcode (Cryotubes)</td><td>Sued-Laborbedarf</td><td>52 95-0213</td><td>Er kunnen verschillende soorten Cryotubes worden gebruikt om te bevriezen. De 2D barcode buizen hebben het voordeel dat de monsterinformatie kan worden opgeslagen in een database met unieke buisinformatie.</td></tr><tr><td>CytoTune&trade; EmGFP Sendai Fluorencie Reporter (GFP Sendai virus)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16519</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune&trade;-iPS 2.0 Sendai Reprogrammeringskit (Sendai virus reprogrammeringskit)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 4',6-Diamidine-2'-fenylindole dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Hoge Glucose</td><td>TH.Geyer</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 met L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15373541</td><td></td></tr><tr><td>Ezel anti-Muis IgG (H+L) Sterk Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor&trade; 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>Dilution: 1/500</td></tr><tr><td>Ezel anti-Konijn IgG (H+L) Sterk Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor&trade; 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21207</td><td>Dilution: 1/500</td></tr><tr><td>DPBS zonder Calcium zonder Magnesium</td><td>TH.Geyer</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM Recombinant Polyklonaal Konijn Antilichaam (22 HCLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>710524</td><td>Dilution: 1/500</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL kegelbodem</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 mL kegelbodem</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Rundserum, gekwalificeerd, hitte geïnactiveerd, Brazilië (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10.8.2</td><td>FlowJo&nbsp;</td><td>663441</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine uit varkenshuid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&trade; LDEV-Free, hESC-Gekwalificeerd, Gereduceerd Groeifactor Basement Membraan Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade; Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 240i CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>16416639</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus HeraSafe veiligheidskabinet</td><td>Kendro</td><td>51017905</td><td></td></tr><tr><td>Menselijk EGF, premiumkwaliteit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-749</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>Fiji</td><td>Versie 2.9.0</td><td></td></tr><tr><td>MEM Niet-Essentiële Aminozuren Oplossing (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeerbuis PP, 1,5 mL</td><td>Nerbe Plus</td><td>04-212-1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop Nikon eclipse TE2000-S</td><td>Nikon</td><td>TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-alpha-Fetoproteïne antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>Dilution: 1/100</td></tr><tr><td>Muis anti-alpha-Gladde Spier Actine antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1420</td><td>Dilution: 1/100</td></tr><tr><td>Muis anti-beta-III Tubuline antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1195</td><td>Dilution: 1/100</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; 1</td><td>STEMCELL Technolgies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog (D73G4) XP Konijn mAb&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4903S</td><td>Dilution: 1/400</td></tr><tr><td>Normocure&trade; (Antimicrobieel Reagens)</td><td>Invivogen</td><td>ant-noc</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Konijn Antilichaam&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2750S</td><td>Dilution: 1/400</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml) (PS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Penicilline-Streptomycine mix bevat 100 U/mL Penicilline en 100 &micro;g/mL Streptomycine.</td></tr><tr><td>Recombinant Menselijke FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Menselijke PDGF-AB</td><td>PeproTech</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde tafelcentrifuge</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>4-16KS</td><td></td></tr><tr><td>Nierapicale Cel Basal Medium</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-030</td><td></td></tr><tr><td>Nierapicale Cel Groei Kit</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-040</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 (L1D6A2) Muis mAb #4900</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4900S</td><td>Dilution: 1/400</td></tr><tr><td>SSEA4 (MC813) Muis mAb</td><td>NEB</td><td>4755S</td><td>Dilution: 1/500</td></tr><tr><td>StemFit&reg; Basic02</td><td>Nippon

generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species benaderingen die primaat pluripotente stamcellen en hun derivaten bestuderen, zijn cruciaal om de moleculaire en cellulaire mechanismen van ziekte, ontwikkeling en evolutie beter te begrijpen. Om primaat geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) toegankelijker te maken, presenteert dit artikel een niet-invasieve methode om menselijke en niet-menselijke primaat iPSC's te genereren uit urine-afgeleide cellen, en hun onderhoud met behulp van een feeder-vrije kweekmethode.
De urine kan worden bemonsterd vanuit een niet-steriele omgeving (bijvoorbeeld de kooi van het dier) en worden behandeld met een breedspectrum antibioticacocktail tijdens de primaire celkweek om besmetting efficiënt te verminderen. Na voortplanting van de van urine afgeleide cellen worden iPSC's gegenereerd door een aangepaste transductiemethode van een in de handel verkrijgbaar Sendai-virusvectorsysteem. Eerste iPSC-kolonies kunnen al na 5 dagen zichtbaar zijn en kunnen op zijn vroegst na 10 dagen worden geplukt. Routinematige klomppassage met enzymvrije dissociatiebuffer ondersteunt de pluripotentie van de gegenereerde iPSC's gedurende meer dan 50 passages.

Bij het isoleren van cellen uit menselijke en NHP-urine kunnen verschillende soorten cellen direct na isolatie worden geïdentificeerd. Plaveiselcellen, evenals verschillende kleinere ronde cellen, worden uitgescheiden met de urine; vrouwelijke urine bevat veel meer plaveiselcellen dan mannelijke urine (figuur 1B - dag 0; Aanvullende figuur S1). Na 5 dagen kweek in primair urinemedium zijn de eerste aanhangende prolifererende cellen te zien (figuur 1A,B</...

Het huidige protocol beschrijft een methode om menselijke en niet-menselijke van primaten urine-afgeleide cellen te isoleren, uit te breiden en te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), evenals instructies voor feedervrij onderhoud van de nieuw gegenereerde iPSC's.

Generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

IPSC's van primaten zijn nuttig, maar vaak moeilijk te verkrijgen vanwege ethische en technische kwesties. Dit protocol biedt een zo toegankelijk mogelijk pad voor het genereren en onderhouden van IPSC's van primaten. Het gebruik van urinecellen als primaire bron van IPSC's heeft een groot voordeel omdat ze op een volledig niet-invasieve manier kunnen worden verkregen zonder speciale technieken.De procedure wordt gedemonstreerd door Jessica Radmer, een promovendus van Wolfgang M.S.Laboratory. Om te beginnen, centrifugeer de urine bevattende buis op 400G gedurende 10 minuten. Zuig vervolgens voorzichtig het supernatant op, laat ongeveer één milliliter in de buis achter en resuspensie de pellet erin.Was de cellen door 10 milliliter urinewasbuffer met amfotericine toe te voegen en meng de suspensie voorzichtig met behulp van een serologische pipet. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op, waardoor er ongeveer minder dan 0,2 milliliter in de buis achterblijft. Resuspendie van de celkorrel in één milliliter primair urinemedium met amfotericine per 50 milliliter initieel verwerkte urine.Verwijder gelatine en voeg een milliliter van de suspensie toe aan een put met gelatine gecoate 12-putplaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Om een keldermembraanmatrix gecoat 12 putplaat te bereiden, voegt u 500 microliter keldermembraanmatrix per put toe.Verplaats de plaat om de vloeistof te verdelen en incuber deze gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Vervang na incubatie de keldermembraanmatrix door 900 microliter REMC-medium en bewaar deze bij 37 graden Celsius tot gebruik. Bereken het volume van Sendai-virussen dat nodig is voor een veelvoud aan infecties van vijf met behulp van de vergelijking.Ontdooi snel de componenten van de Sendai-herprogrammeringskit in het waterbad getemperd op 37 graden Celsius. Voeg REMC-medium voor een totaal van 100 microliter toe aan een buis voordat u het berekende volume van Sendai-virussen toevoegt en mengt. Na dissociatie van de urinecellen zoals beschreven in het manuscript, telt u de cellen met behulp van de celteller en brengt u het gewenste aantal cellen over naar een buis van 1,5 milliliter.Verkrijg de pellet door centrifugeren en resuspensie in 100 microliter van het bereide Sendai-virusmengsel. Incubeer de buis gedurende een uur bij 37 graden Celsius voor suspensie-infectie. Voeg na incubatie REMC toe aan een totaal van één milliliter voordat u de celsuspensie zaait in de keldermembraanmatrix gecoate 12-putplaat.Verander na transductie het medium om de dag tot de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen, of IPSC, kolonies met overschakeling naar PSC-generatiemedium op dag vijf. Wanneer de IPSC-kolonies groot genoeg worden voor klonterpassage, zuigt u het medium uit de gekweekte cellen en wast u de cellen zorgvuldig met 500 microliter DPBS. Voeg na het verwijderen van de DPBS 500 microliter 0,5 millimolar EDTA toe aan de put en incubeer gedurende twee tot vijf minuten.Observeer de cellen zorgvuldig onder de microscoop totdat de kolonies beginnen los te komen. Wanneer de randen van de kolonies beginnen af te pellen en openingen tussen de cellen zichtbaar worden, verwijdert u de EDTA en voegt u voorzichtig 500 microliter DPBS toe. Zuig de DPBS aan en spoel de put met 500 microliter PSC-kweekmedium met behulp van een P-1000-pipet.Pipetteer op en neer om de kolonies te verspreiden in klonten van de juiste grootte. Afhankelijk van de samenvloeiing, de gewenste dichtheid van de gezaaide cellen en IPSC-klonale voorkeur, wordt 1/10 tot 1/50 van de celklompsuspensie overgebracht naar de nieuwe putten. Beweeg de plaat voorzichtig een paar keer heen en weer om de klonten gelijkmatig in de put te verdelen.Incubeer de plaat minstens 30 minuten bij 37 graden Celsius om de klonten te laten hechten. Verander het medium om de twee tot drie dagen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren. Na isolatie zijn plaveiselcellen en verschillende kleinere ronde cellen te zien die met de urine zijn uitgescheiden.De eerste aanhangende prolifererende cellen zijn te zien en deze cellen groeien uit tot grote kolonies die kunnen worden doorgelaten. Er zijn twee verschillende celtypen te zien, één met een epitheliaalachtig fenotype en de andere met een meer mesenchymaal fenotype met langwerpige vorm. Na de eerste passage groeien urinecellen als een monolaag.Tijdens de generatie van IPSC zijn enkele aanhangende cellen te zien en deze cellen beginnen morfologische veranderingen te vertonen, wat wijst op herprogrammering van de cellen. Verder vertonen de cellen die kolonies vormen de typische embryonale stamcelmorfologie. Alle gegenereerde IPSC's delen de typische embryonale stamcelachtige koloniemorfologie, gekenmerkt door dicht opeengepakte cellen met duidelijk gedefinieerde randen.Immunocytochemie werd gebruikt om de expressie van pluripotentie geassocieerde markers in gorilla IPSC's te testen. Bovendien toonde flowcytometrie-analyse aan dat de geanalyseerde orang-oetan IPSC's positief zijn voor TRA-1-60. Bovendien zijn de gorilla IPSC's in staat om te differentiëren in endoderm, mesoderm en ectoderm afstamming.Een verhoogd aantal gedifferentieerde cellen en een verlies van grensintegriteit en uniformiteit wijzen op een slechte IPSC-kwaliteit. Gedefinieerde randen, strakke cellulaire verpakkingen en prominente nucleoli betekenen daarentegen IPSC's van hoge kwaliteit. Vanwege de coronale variabiliteit moet men de kloonspecifieke omstandigheden optimaliseren, zoals de splitsingsverhouding, passagetiming en klompgrootte om ipsc's van primaten gezond te houden.Als kwaliteitscontroles van gevestigde IPSC's kan men de pre-potentie verifiëren door directe of indirecte differentiatie-inductie zoals in vitro EV-differentiatie, naast het controleren van markergenexpressie.

generation-maintenance-primate-induced-pluripotent-stem-cells-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Te ontrafelen de vroegste moleculaire mechanismen prostaatkanker initiatie, nieuw en innovatief model van de mens systemen en benaderingen zijn hard nodig. Het potentieel van de pre-prostaat urogenitale sinus mesenchym (UGSM) naar pluripotente stamcel populatie bewegen om menselijke prostaat epitheel vormen is een krachtig experimenteel hulpmiddel in prostate onderzoek.

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Dit protocol omvat gedetailleerde procedures voor de isolatie van urine-afgeleide cellen van patiënten met spierdystrofie; hun efficiënte en snelle herprogrammering door Sendai-virus transductie.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen

In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Dit manuscript beschrijft een tweestapsprotocol om patiëntspecifieke podocyten te genereren uit dermale fibroblasten via episomale herprogrammering in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en daaropvolgende differentiatie in podocyten.

Generatie van patiënt-afgeleide podocyten uit huidbiopten

Leer hoe je iPSCs genereert en onderhoudt uit urine-afgeleide cellen van primaten met behulp van Sendai-virussen. Deze niet-invasieve methode ondersteunt ethisch verantwoord stamcelonderzoek.

Generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine

Meer video's verkennen