Compartimenlise ring van menselijke stamcel-afgeleide neuronen in voorgemonteerde kunststof Microfluïdische chips

Gecompartimenteerde microfluïde apparaten kunnen neuronen worden bestudeerd in hun sterk gepolariseerde vorm. Deze apparaten zijn instrumenteel voor zowel fundamenteel als translationeel neurowetenschappelijk onderzoek. Dit protocol beschrijft hoe cyclische olefin copolymeer chips te gebruiken om neuronen onderscheiden van menselijke stamcellen compartimenteren.

Deze COC-chips produceren gezondere culturen van gedifferentieerde neuronen via PDMS multi-compartiment apparaten. In dit protocol tonen we de cultuur van neuronen onderscheiden van de NIH-goedgekeurde H9 stamcellijn. Soortgelijke procedures kunnen worden gebruikt om neuronen te onderscheiden van mIPSCs.

De multi-compartiment spanten moeten worden geplaatst in secundaire insluiting met extra bevochtiging. De kanalen van de multi-compartiment chips moeten worden gevuld met een precoat oplossing, en vervolgens gespoeld met PBS. Los om te beginnen poly-L-ornithine op in gedestilleerd water van celkweek om 600 microliter oplossing per chip te maken.

Aspirate de resterende PBS uit de putten, ervoor te zorgen dat de pipette tip is weg van het kanaal opening. Laad 150 microliter van poly-L-ornithine werkoplossing in de rechterbovenhoek goed. Wacht 90 seconden en voeg 150 microliter van de oplossing aan de rechterbenedenonder.

Wacht vijf minuten en herhaal het laadproces met de oplossing voor de linkerputten. Plaats vervolgens de bevochtiger lade met chip op vier graden Celsius 's nachts. Als u een petrischaaltje gebruikt, wikkel het dan met Parafilm en plaats deze 's nachts op vier graden Celsius.

Vervolgens, aspirate de oplossing uit de putten, ervoor te zorgen dat de pipette tip wordt geplaatst uit de buurt van het kanaal opening. En herhaal het laden van de rechter en linker putten met 150 microliters elk van steriel water twee keer. Bereid de laminine werkoplossing voor.

Laad de rechter- en linkerputten met 150 microliters elk van de laminine werkoplossing. Broed de chip twee uur in de lade bij 37 graden Celsius. Spoel de chip af met PBS zonder calcium en magnesium.

Laad de rechter- en linkerputten met 150 microliters elk van PBS. Wacht vijf minuten. Spoel de PBS uit de putten en spoel de chip met NSC media.

Laad de rechter- en linkerputten met 150 microliters elk van de NSC-media. Incubeer de chip 's nachts in de lade in de 37 graden Celsius incubator met 5% CO2 om de chip pre-conditioneren. Om menselijke neurale stamcellen in de multi-compartiment chip te zaaien, eerst de celconcentratie tellen met behulp van een hemocytometer.

Dan, aspirate de media uit de putten. Pipette vijf microliter van de cel oplossing aan de rechterbovenhoek goed, gevolgd door vijf microliters naar rechtsonder goed. Gebruik een microscoop om te controleren of cellen het kanaal zijn binnengekomen.

Wacht vijf minuten tot de cellen zich aan de onderkant van de chip hechten. Pipette ongeveer 150 microliters van NSC media naar rechts en links putten. Incubeer bij 5%CO2, 37 graden Celsius in een geschikte bevochtigde container.

Na 48 uur, aspirate NSC media uit de putten en vervang het door neurale differentiatie media door het toevoegen van 150 microliters aan elke top goed en elke bodem goed. Kweekneuronen binnen een 5%CO2, 37 graden Celsius incubator in een bevochtiger lade. Verwijder de resterende neurale differentiatiemedia uit het axonale compartiment en plaats deze in een centrifugebuis.

Bewaar op 37 graden Celsius. Meng 50 microliter van de virusoplossing met 150 microliter van de opgewarmde media. Pipette 100 microliter van het mengsel aan beide putten van het axoncompartiment.

Incubeer gedurende twee uur binnen een 37 graden Celsius incubator. Terugtrekken en verwijderen van virushoudende media. Voorzichtig pipette 75 microliters van de verse media naar een axon compartiment goed en laat de media stromen door het kanaal in andere axon goed.

Herhaal dit proces één keer. Vul ten slotte het axoncompartiment met de opgeslagen media en breng de chip over naar de couveuse. Na één week in de spaander met de differentiatiemedia, onderscheidden de menselijke neurale stamcellen in neuronen, die gelijk binnen het somatische compartiment worden vastgedeeld en verdeeld.

In vergelijking, neuronen in PDMS-apparaten geaggregeerd al vijf dagen na toevoeging van differentiatie media, wat leidt tot gecompromitteerde cel gezondheid. Visualisatie van gelabelde neuronen en dendritische stekels met mCherry fluorescerend eiwit toonde aan dat NSC-afgeleide neuronen gedifferentieerd binnen de chips vormen volwassen synapsen. Neuronen werden gelabeld voor de excitatory synaptische marker, vGlut1.

Immunostaining resultaten tonen aan dat viraal gelabelde neuronen kunnen co-lokaliseren met vGlut1, en neuron-specifieke marker, Beta-tubuline drie. Viraal getransduceerde mCherry neuronen uit te breiden projecties in een axon-gelokaliseerde micro-omgeving vastgesteld in de voorgemonteerde chip. Een vergelijking tussen de beelden van mCherry gelabeld neuronen voor en onmiddellijk na axotomie toonde volledig afgesneden axoons.

Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de kanalen gevuld blijven met vloeistof, behalve bij het uitvoeren van de axotomieprocedure. COC-gecompartimenteerde chips zijn gemakkelijk te gebruiken en kunnen de deur openen voor tal van onderzoeken met betrekking tot neuronale schade, synaptogenese, synaptische plasticiteit en pathofysiologie van de ziekte.