Gebruik van vooraf geassembleerde kunststof Microfluidic Chips voor primaire lymfkliertest neuronen compartimentering

Microfluidic apparaten die worden gebruikt om neuronen te compartimenteren zijn uitgegroeid tot een standaard instrument in de neurowetenschappen, waardoor onderzoekers fysiek en chemisch te manipuleren subcellulaire regio's van neuronen, waaronder somata, axonen, dendrieten en synapsen. Deze gecompartimenteerde cultuurapparaten kunnen helpen bij het beantwoorden van tal van vragen op het gebied van neurowetenschappen, zoals hoe axonen zich tijdens de ontwikkeling uitbreiden tot synapsen vormen, hoe synapsen verbouwen en hervormen na axonschade en hoe pathologische aandoeningen zich trans-synaptisch kunnen voortplanten bij ziekten zoals alzheimer. Dit protocol beschrijft het gebruik van voorgemonteerde plastic multicompartment chip voor het compartimenteren van cultuur primaire rat neuronen.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze chips is dat ze een gebruiksvriendelijke en zeer reproduceerbare methode bieden om neuronen te compartimenteren. Een ander voordeel is dat deze chips gezondere, langdurige groei van neuronen en geïsoleerde axonen opleveren dan eerdere op silicium gebaseerde gecompartimenteerde apparaten en even compatibel zijn met microscopie met hoge resolutie. Andere modelsystemen, waaronder menselijke stamcellen, kunnen ook worden gekweekt binnen de voorgemonteerde compartimenteringschip.

Om te beginnen, plaats een steriele, multicompartment chip in een petrischaaltje. Voeg 100 microliters van een voorcoderingsoplossing toe aan de linkerbovenbacht van de chip en laat het door het hoofdkanaal in de aangrenzende put stromen. Vul vervolgens de linkerbenedenput van de chip met 100 microliter van de voorcoderingsoplossing.

Wacht deze keer vijf minuten om de oplossing door de microgroeven te laten stromen. Voeg nu 100 microliters van de voorcoderingsoplossing toe aan de rechterbovenhoek en laat het door het hoofdkanaal in de aangrenzende put stromen. Vul na 90 seconden de rechterbeneden goed met 100 microliter van de voorcoderingsoplossing en broed de chip gedurende 10 minuten uit.

Voorzichtig hoek van de pipet tip, uit de buurt van het hoofdkanaal en aspirate de oplossing van elke put. Voeg vervolgens onmiddellijk 150 microliter PBS toe aan de linkerbovenhoek en wacht anderhalve minuut. Voeg vervolgens 150 microliter PBS toe aan de linkerbenedenzijde en wacht vijf minuten om de vloeistof door de microgroeven te laten stromen.

Voeg vervolgens 150 microliter PBS toe aan de putten rechtsboven en rechtsonder, in die volgorde. Na 10 minuten, opnieuw aanzuigen van de PBS en herhaal de wasstappen een tweede keer. Na de tweede wasbeurt, aspirate de PBS uit de putten als voorheen door het vissen van de pipette tip, uit de buurt van het kanaal opening.

Voeg vervolgens 100 microliter van 0,5 mix per mil Poly-D-Lysine-oplossing toe aan de linkerbovenbende van de chip. Wacht anderhalve minuut en vul de linkerbeneden goed met 100 microliter van de Poly-D-Lysine oplossing. Herhaal dit proces op de rechterhelft van de chip.

Sluit de petrischaal. Plaats de chip vervolgens een uur lang in een couveuse op 37 graden Celsius. Na incubatie spoel je de chip twee keer af met PBS zoals eerder beschreven.

Vervolgens u de PBS van het apparaat aanzuigen. Voeg onmiddellijk 100 microliters van celkweekmedia toe aan de linkerbovenhoek van de chip. Na anderhalve minuut, voeg media aan de linkerbenedenzijde goed.

Wacht vijf minuten om media door de microgroeven te laten stromen en herhaal vervolgens het vulproces aan de rechterkant van de chip. Bereid een cel suspensie van gescheiden rat hippocampal neuronen volgens de vastgestelde protocollen. Verwijder de meerderheid van de media in elke put van de chip, maar laat de kanalen gevuld.

Laad vervolgens onmiddellijk vijf microliter van de celsuspensie in de rechterbovenhoek en nog eens vijf microliter celsuspensie in de rechterbenedenonderzijde. Bij het laden van de cellen richt u de punt van de pipet naar het hoofdkanaal. Na het laden van de cellen, breng de chip naar een microscoop stadium en om ervoor te zorgen dat de neuronen zijn in het hoofdkanaal.

Na vijf minuten wachten op de cellen te hechten, voeg ongeveer, 150 microliter van neuronale cultuur media aan elk van de bovenste en rechtsboven putten. Voeg vervolgens 150 microliter media toe aan elk van de boven- en linkerdiepten. Bedek de petrischaal en plaats de chip in een bevochtigde lade in een 5%koolstofdioxide, 37 graden Celsius incubator.

Verwijder eerst 20 microliter uit de linkerbenedenhoek van het axonale compartiment en plaats deze in de rechterbovenhoek van het somatische compartiment. Wacht twee minuten tot de stroom binnen elk kanaal in evenwicht is. Verwijder vervolgens 50 microliter media uit het axonale compartiment en voeg 0,3 microliter van één millimolar Alexa Fluor 488 hydrazide toe aan deze media.

Pipette op en neer om de oplossing te mengen en vervolgens de media met de fluorescerende kleurstof terug te brengen in het axonale compartiment. Plaats op dit punt de chip op de microscoop en het beeld naar wens. Om axotomie in de chip uit te voeren, moet u eerst de media uit het axonale compartiment verwijderen, waarbij de pipettepunt uit de buurt van de ingang van het hoofdkanaal blijft.

Bewaar de verwijderde media in een centrifuge buis voor nu. Plaats vervolgens de aspiratiepipet in de buurt, beide ingang van het hoofdkanaal van het axonale compartiment en aspirate de axonale compartiment volledig. Blijf het gebied gedurende één tot twee minuten aanzuigen.

Vervang het axonale compartiment door de opgeslagen media. Zorg ervoor dat de oplossing volledig uit het compartiment wordt verwijderd en dat de axonen worden doorgesneden door het monster onder een microscoop te bekijken. Bedek vervolgens de chip en breng deze terug naar de couveuse.

Om te beginnen fluorescentie immunostaining, verwijder de meeste van de media uit de chip, het houden van het interieur compartimenten gehydrateerd. Voeg onmiddellijk 100 microliter fixatieoplossing toe aan de bovenste putten van de axonale en somatische compartimenten. Voeg na een minuut 100 microliter fixatieoplossing toe aan de onderste putten en bevestig de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder het grootste deel van de oplossing uit de putten en voeg onmiddellijk 150 microliter PBS toe aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische compartimenten. Wacht twee minuten tot de PBS te stromen in de onderste putten, dan, verwijder de PBS en spoel de putten twee keer meer met behulp van dit zelfde proces. Na de laatste spoeling, verwijder het grootste deel van de PBS uit de putten van de chip en onmiddellijk, voeg 150 microliter pbs met 0,25% triton x-100 aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische compartimenten.

Wacht 15 minuten en verwijder vervolgens de meeste vloeistof uit de putten. Voeg onmiddellijk 150 microliter blokkeeroplossing toe aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische compartimenten. Verwijder na 15 minuten de meeste vloeistof uit de putten en voeg onmiddellijk 100 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische compartimenten.

Bedek de chip om verdamping te minimaliseren en de cellen in het primaire antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur te ontcunken. Spoel vervolgens de chip door het grootste deel van de oplossing te verwijderen en voeg onmiddellijk 150 microliter PBS toe aan elk van de bovenste putten van de axonale en sematische compartimenten. Na vijf minuten, verwijder de PBS uit beide putten en herhaal de spoeling nog twee keer.

Verwijder nu het grootste deel van de vloeistof uit de putten en voeg onmiddellijk 100 microliter secundaire antilichamen in PBS toe aan elk van de bovenste putten van de axonale en somatische compartimenten. Bedek de chip om verdamping te minimaliseren en de chip een uur lang te incueren bij kamertemperatuur. Zoals eerder getoond, spoel de chip drie keer met PBS dan, monteren en beeld van de chips zoals beschreven in de begeleidende tekst protocol.

Hier getoond, is een side-by-side vergelijking van neuronen geteeld op plastic chips en PDMS apparaten. Neuronale groei is vergelijkbaar binnen de twee platforms tot 15 dagen in de cultuur, maar op langere cultuur leeftijden, geïsoleerde axonen binnen de plastic chip, lijken gezonder met minder kloppen. Om axonen in de axoncompartimenten verder te visualiseren, werden deze monsters ook immunostained voor bèta-tubuline III, die een gezonde axonale groei binnen de plastic chips laat zien op 22 dagen in de cultuur.

Verdere kleuring met 24-daagse monsters toont neuronen geteeld in de plastic chips om zowel de excitatory en remmende synaptische markers, vGlut1 en vGat uit te drukken. Hier zijn de twee synaptische markers gecombineerd met retrograde gelabeld mCherry neuronen. Om de geschiktheid van deze chip voor axon letsel en regeneratie studies aan te tonen, retrograde gelabelde neuronen werden afgebeeld voor en 24 uur na axotomie.

Een intreklamp en regenererende axon zijn beide duidelijk na axotomie. Deze resultaten zijn gelijk aan gepubliceerde gegevens met behulp van PDMS-gebaseerde apparaten. Klassieke multicompartimentchips bieden een gebruiksvriendelijke optie voor het compartimenteren van neuronen die lange termijn neuronculturen bieden, die langer dan drie weken levensvatbaar blijven.

Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om het juiste aantal neuronen zaad en zorg ervoor dat uw incubator is goed bevochtigd tijdens de cultuur.