Driedimensionale patroon van gemanipuleerde biofilmen met een doe-het-zelf bioprinter

3D bioprinting met bacteriën is een nieuw ontwikkelde techniek. Dit protocol biedt een eenvoudige manier om gemanipuleerde biofilms 3D geprint met bacteriën te bouwen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om 3D-geprinte biofilms te produceren met behulp van een goedkope zelfgebouwde 3D-printer.

Een mogelijke toepassing van onze 3D-printer is het creëren van reproduceerbare model biofilms die kunnen worden gebruikt om nieuwe antibacteriële therapieën te ontwikkelen. Onze 3D-printbenadering kan worden toegepast op elk type bacterie dat compatibel is met onze op alginaat gebaseerde bioink. De bereiding van het bioink en van de printsubstraten zijn vrij standaardprocedures, terwijl het 3D-printproces, met name de kalibratie van de Z-as, een cruciale stap is die enige oefening vereist.

Kalibratie van de ingestelde toegangshoogte zal de resolutie van onze 3D-printer beïnvloeden en is sterk afhankelijk van persoonlijke ervaring. Deze procedure vereist handmatige aanpassingen, en het is moeilijk om te worden beschreven in een schriftelijke vorm. Sluit een 200 microliter pipetpunt aan op een lengte van siliconen buizen en monteer de pipetpunt op de extruderkop van de 3D-printer als vervanging voor de originele extruder.

Voeg vervolgens vier milliliter van een vijf molaire calciumchlorideoplossing toe aan 400 milliliter van 1%agar opgelost in Luria-Bertani bouillon en vul deze aan met de juiste antibiotica en aansporingsmiddelen. Dan, afzien van 20 milliliter van de LB agar oplossing in elke 150 millimeter bij 15 millimeter petrischaal. Droog de schotel 30 minuten op kamertemperatuur, met het deksel half open.

Bereid een natriumalginaatoplossing van 3% en verwarm deze drie keer tot het kookpunt om de oplossing te steriliseren. Bewaar vervolgens de steriele oplossing op vier graden Celsius totdat deze wordt gebruikt. Om de bacteriële component van het bioink voor te bereiden, groeien E.coli bacteriën die plasmiden voor constitutieve GFP expressie in 50 milliliter LB medium bevattende antibiotica.

Schud de cultuur op 250 RPM en 37 graden Celsius 's nachts. Na de nachtelijke groei van de cultuur, pellet de bacteriën gedurende vijf minuten op 3, 220 keer de zwaartekracht en verwijder vervolgens de supernatant. Resuspend de bacteriën pellet in 10 milliliter van LB medium, en voeg 10 milliliter van 3% natriumalginaat.

Sluit de 3D-printer aan op een computer en open de 3D-afdruksoftware. Klik op de startknop voor de X-, Y- en Z-assen om de afdrukkop naar de thuispositie te verplaatsen. Plaats voor elke afdruk een voorbereid druksubstraat op een bepaalde locatie op het drukbed.

Til de printkop onder handmatige bediening naar een hoogte van meer dan 22 millimeter, zodat deze tijdens het bewegen niet met de rand van de petrischaal botst. Plaats de printkop over de bovenkant van de plaat en beweeg deze naar beneden totdat de pipettepunt contact maakt met het drukoppervlak. Wijs deze Z-aspositie toe als Z1, de hoogte van het afdrukoppervlak.

Til vervolgens de printkop op en verplaats deze handmatig buiten het plaatgebied. Als de werkafstand tussen de printkop en het plaatoppervlak wordt gedefinieerd als Z2, voert u de hoogte van het afdrukoppervlak plus de werkafstand in het afdrukprogramma in als de Z-waarde tijdens het afdrukken. Laad een voorgeprogrammeerd G-codebestand met opdrachten voor het afdrukken van de gewenste vorm.

Bij elke opdrachtregel kan de positie van de printkop worden gewijzigd in de assen X, Y en of Z. Zorg ervoor dat u de Z-waarde invoert tijdens alle afdrukstappen als de hoogte van het afdrukoppervlak plus de werkafstand. Laad de vloeibare bioink in spuiten en monteer ze in de spuitpomp van de 3D bioprinter.

Stel vervolgens de extrusiesnelheid in op 0,3 milliliter per uur. Druk het bioink af op het druksubstraat door op de knop Afdrukken te klikken. Wacht met het starten van de spuitpomp tot nadat het afdrukken is gestart en voordat de printkop in contact komt met het drukoppervlak.

Tijdens het printen u de beweging van de printkop volledig door de software bedienen. Stop de spuitpomp zodra de printkop op het laatste drukpunt aankomt, anders valt overtollig bioink op het druksubstraat en vermindert de afdrukresolutie. Voor de bouw van 3D-structuren worden alle bewegingen van de printkop aangestuurd in de G-code editor.

Als u de afdrukhoogte voor de tweede laag wilt verhogen, typt u de afdrukhoogte van de eerste laag en verhoogt u de Z-waarde in de code met 0,2 millimeter. Verhoog daarna de Z-waarde met 0,1 millimeter bij het verplaatsen naar een hogere laag. Incubeer de gedrukte monsters drie tot zes dagen bij kamertemperatuur om de productie van de biofilmcomponenten zoals Curli-vezels mogelijk te maken.

Plaats vervolgens de plaat op een tl-scanner en beeld de platen. Om de alginaatmatrix op te lossen, voegt u 20 milliliter van een natriumcitraatoplossing van 0,5 molar bij pH 7 toe aan het bedrukte substraat. Broed de plaat twee uur lang op kamertemperatuur terwijl u schudt bij 30 tpm.

Gooi vervolgens de vloeistof weg en beeld de platen opnieuw, om te vergelijken met de afbeeldingen van de platen voor en na de citraatbehandeling. De 3D bioprinter kan bacteriën creëren die hydrogels in een verscheidenheid van tweedimensionale en driedimensionale vormen inkapselen. Deze geprinte vormen kunnen vervolgens worden gebruikt om te beoordelen of de vorming van biofilm succesvol was of dat de alginaatmatrix volledig is opgelost met behulp van een natriumcitraatoplossing.

In het geval van bioink zonder het inducible Curli productieplasmi, werd het gedrukte patroon volledig opgelost na de natriumcitraatbehandeling, wat betekent dat er geen biofilm Curli-netwerk was gevormd. De bacteriën die de inducible Curli productie plasmi werd niet opgelost na natrium citraat behandeling, wat aangeeft dat de gedrukte bacteriën in staat waren om een Curli netwerk uitgebreid genoeg om het gedrukte patroon van bacteriën te stabiliseren vormen. Als u structuren met meerdere lagen wilt construeren, kunnen extra lagen worden afgedrukt door de G-code-editor te bedienen.

Het verhogen van het aantal afgedrukte lagen in een monster zorgde ervoor dat de breedte en de hoogte van de afgedrukte structuren stapsgewijs toeneemt. Toen E.coli, ontworpen om Curli-eiwitten te inducibly te produceren, in meerlaagse structuren werd gedrukt, loste de natriumcitraatbehandeling de monsters niet op, terwijl meerlaagse structuren die niet Curli-producerende E.coli bevatten, werden opgelost. De meest kritieke onderdelen van de 3D-printprocedure zijn de kalibratie van de Z-as en de coördinatie van het starten van de afdruk en het starten van de spuitpomp.

De bioink ontwikkeld voor dit proces is vrij zacht, met een lage taaiheid. Verdere wijziging zou kunnen worden aangebracht aan de bioink, om te zorgen voor en verbetering van de mechanische stabiliteit. Deze 3D-printtechniek maakt de productie van biofilms met uitstekende mechanische eigenschappen mogelijk, waardoor biomimettische materialen kunnen worden vervaardigd.

Draag bij het omgaan met deze bacteriën de juiste bescherming, zoals handschoenen.