Name: Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer hoe je beeldvormende massaspectrometrie gebruikt om kleine moleculen in cel- en weefselcocultuur te detecteren. Deze methode onderzoekt communicatie bij eierstokkankermetastase zonder labels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering werd verstrekt door het Consortium Chicago biomedische met steun van de fondsen van de Searle op The Chicago Gemeenschap Trust (C-076) (L.M.S.); Universiteit van Illinois te Chicago opstarten middelen (L.M.S.); Subsidie 543296 van de ovariële kanker onderzoek Fonds Alliantie (M.D.); en UG3 ES029073 (J.E.B.) en door het National Center for Advancing translationeel Sciences, National Institute of Health, door middel van subsidie UL1TR002003 (JEB & LMS).

Alle dierlijke procedures werden overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het Comité van het institutionele dier gebruik en zorg (IACUC) aan de Universiteit van Illinois te Chicago.
1. bereiding van reagentia
<ol><li>Handhaven lymfkliertest oviductal epitheel (MOE) cellen bij 37° C met 5% CO2 in een bevochtigde incubator in alpha Minimum essentiële Medium (αMEM) media aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 10 mg/mL insuline, transferrine, selenium (ITS) , 1.8 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 100 U/mL penicilline-streptomycine, 1 mg/mL gentamycine en estradiol-17β 18.2 ng/mL. Passeren van de cellen om 3-4 dagen, ervoor te zorgen zijn er genoeg cellen op dezelfde dag de muizen zullen worden opgeofferd.</li>
	<li>Bereid 2% agarose door het mengen van 1 g van lage-smelten agarose met 50 mL gedestilleerd water. Autoclaaf de agarose, laat afkoelen en vervolgens aliquot (1 mL) in 2 mL tubes (Zie Tabel van materialen) voordat agarose stolt. Agarose kan voor onbepaalde tijd bij-20 ° C worden bewaard.</li>
	<li>Bereiden van ten minste 2 mL 1 x Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) media.</li>
	<li>Voor de matrix voor MALDI-TOF MS, bereiden 5 mg/mL 10 mL 1:1 alpha-cyano-4-hyroxycinnamic zuur (CHCA): dihydroxybenzoic zuur (DHB) (Zie Tabel van materialen) in 90:10 ACN:H2O + 0,1% trifluorazijnzuur (TFA). Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing tot matrix is opgelost.</li>
</ol>2. muis kolonie en eierstok verwijdering
<ol><li>Fok paren van CD-1 muizen met behulp van standaard behuizing procedures te handhaven. In de buurt van de dag van de bevalling, check de muizen elke dag zodat de ouderdom van de pups is bekend.</li>
	<li>Euthanaseren pups op de leeftijd van 16 tot 18 dagen na inademing CO2 per NIH richtsnoeren. Leveren van CO2 (100%) in een flow tarief van 10%-20% volume per minuut kamer en blijven gedurende twee minuten na ademhaling was gestopt. Bevestig euthanasie door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Desinfecteer alle chirurgische apparatuur door dompelen in 70% ethanol. Warm Leibovitz van L-15 media met 1 x penicilline-streptomycine tot 37 ° C.</li>
	<li>De abdominale oppervlak met 70% ethanol te desinfecteren van het gebied en Minimaliseer verontreiniging met haar natte. Greep de huid die betrekking hebben op de buikwand met behulp van botte chirurgische schaar Tang en gebruik te maken een grote V-vorm gesneden door de huid en de buikwand, bloot de interne organen.</li>
	<li>De inwendige organen verplaatsen naar de kant met behulp van de verlostang. Individueel grijpen elke baarmoeder hoorn met een fijne Tang en een lift iets.</li>
	<li>Zoek de eierstok, die aan het einde van de baarmoeder-hoorn, direct onder de nier zullen. Heelkundige schaar te ontleden de eierstok gratis bindweefsel gebruiken Snij vervolgens de ovariële hoorn doormidden.</li>
	<li>Verplaatsen van het ovarium oviduct en ongeveer één helft van elke baarmoeder claxon voorverwarmde Leibovitz van L-15 media.</li>
	<li>Verplaats onder een ontleden Microscoop zorgvuldig elke eierstok uit de omliggende bursa, het bevrijden van het oviduct, bursa en eventuele adipeus weefsel. Elke eierstok verplaatsen naar een nieuwe schotel van Leibovitz van L-15 media.</li>
	<li>Elke eierstok axiaal in tweeën gesneden. Houd de ovariële stukken (nu genoemd explantaten) bewaard bij 37 ° C tot beplating van agarose.</li>
</ol>3. het opzetten van en het broeden van de ITO-behandelde dia voor Cocultures
<ol><li>
Onverdeelde cocultures
	<ol>
<li>Uitvloeien, de agarose bij 70 ° C op een hete plaat.</li>
		<li>Plaats de scheidingslijn van de 8-well bovenop de indium tinoxide (ITO)-behandelde dia (figuur 1A). De rubberen onderkant op de scheidingslijn helpt bij hechting op de dia, maar zorg ervoor dat continu zachte neerwaartse druk uitoefenen tijdens agarose beplating om ervoor te zorgen geen lekken of mengen tussen putten.</li>
		<li>Verzamelen van cellen in een conische tube van 15 mL, centrifuge (5 min op 800 rpm) en resuspendeer tot 50k cellen per 150 µL in 1 x DMEM media. Als de dichtheid van een andere cel optimaal is, zorg ervoor dat bij deze stap de celsuspensie 2 x de laatste dichtheid gewenst is (bijvoorbeeld voor een eindconcentratie van 50.000 cellen in 300 µL, celdichtheid bij deze stap is 50.000 cellen in 150 µL).</li>
		<li>Voeg voordat plating celcultuur, ovariële explant te midden van goed (figuur 1B).</li>
		<li>Agarose toevoegen aan elke celcultuur in individuele 2 mL buizen net voordat plating. Voor elk putje, combineren 200 µL celsuspensie en 200 µL van vloeibaar agarose in een tube van 2 mL. Bijvoorbeeld, voor vier putten, combineren 800 µL celsuspensie en 800 µL van 2% agarose. Sommige mengsel blijft, maar iets meer dan noodzakelijk maken voorkomt luchtbellen tijdens pipetteren.<ol>
<li>Voeg agarose aan individuele celculturen onmiddellijk voordat plating dat cultuur van de cel. De agarose zal afkoelen in minder dan een minuut, dus wees bereid te snel plaat.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voeg onmiddellijk 300 µL van het mengsel van cel/agarose toe aan elk putje (Figuur 1 c). Figuur 1 c toont drie cel voorwaarden en een media voorwaarde, dat elk verguld met en zonder een eierstok.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator dia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verdeelde Cocultures.
	<ol>
<li>Verlagen dividers van dunne, soepele plastic (figuur 2A). Opmerking: Dit experiment wordt gebruikgemaakt van de zijden van een steriele wegwerp media bekken omdat ze plat en dun zijn. Snij ze net breed genoeg om te passen zonder speling in de schuine zijde van de put (~ 13 mm).</li>
		<li>Uitvloeien, de agarose bij 70 ° C op een hete plaat.</li>
		<li>Plaats de scheidingslijn van de 8-well op de top van de ITO-behandelde dia (figuur 2B). De rubberen onderkant op de scheidingslijn helpt bij hechting op de dia, maar zorg ervoor dat continu zachte neerwaartse druk uitoefenen tijdens agarose beplating om ervoor te zorgen geen lekken of mengen tussen putten.</li>
		<li>Verzamelen van cellen in een conische tube van 15 mL, centrifuge (5 min op 800 rpm) en resuspendeer tot 50k cellen per 150 µL in 1 x DMEM media. Als de dichtheid van een andere cel optimaal is, ervoor te zorgen dat bij deze stap de celsuspensie 2 x de laatste dichtheid gewenst is (bijvoorbeeld voor een eindconcentratie van 50.000 cellen in 300 µL, celdichtheid bij deze stap is 50.000 cellen in 150 µL).</li>
		<li>Kunststof verdelers diagonaal in putten (figuur 2C) invoegen.</li>
		<li>Agarose aan elke celsuspensie één op een moment net voordat plating toevoegen. Voor elk putje, combineren 100 µL celsuspensie en 100 µL van vloeibaar agarose in een tube van 2 mL. Bijvoorbeeld, voor vier putten, combineren 400 µL van celkweek en 400 µL van 2% agarose. Enkele cel/agarose mengsel overblijft zal worden maar dat iets meer dan noodzakelijk voorkomt luchtbellen tijdens pipetteren.<ol>
<li>Voeg agarose aan individuele celculturen onmiddellijk voordat plating dat cultuur van de cel. De agarose zal afkoelen in minder dan een minuut, dus wees bereid te snel plaat.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aan de ene kant van de scheidingslijn, plaat 150 µL van cel/agarose mengsel. Toestaan agarose afkoelen en stollen (ongeveer één min) en verwijder de scheidingslijn (figuur 2D).</li>
		<li>Eierstok explant plaatsen in het midden van de lege helft van de put. Plaats 150 µL media/agarose mengsel over de bovenkant van de eierstok, en alleen met de juiste kant van de put (figuur 2E).</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator dia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. het drogen van dia en voorbereiding van de MALDI-TOF MS
<ol><li>Na vier dagen (of een voorkeurstijd punt), de kamer scheidingslijn verwijderen uit de agarose stekkers en de dia (Figuur 1 d). Voorzichtig losmaken van de zijkanten van het agarose de zaal uit met een platte spatel en trek voorzichtig de kamer naar boven, dat evenwel niet tot het verplaatsen van een agarose stekkers. Als ze bewegen zich, verplaatsen ze zachtjes zodat ze elkaar niet raken.</li>
	<li>Plaats de dia in een oven van 37 ° C gedurende ongeveer 4 uur, roteren 90° elke h. Opmerking: De rotatie van de dia is belangrijk om ervoor te zorgen zelfs warmteverdeling in het monster.</li>
	<li>Eenmaal droog, verwijder de dia uit de oven (figuur 1E).</li>
	<li>Toepassing van matrix oplossing met behulp van de spuitmachine (figuur 1F), met de volgende parameters: temperatuur = 30 ° C, debiet = 0,2 mL/min, aantal stadia = 8, richting = CC en mondstuk afstand = 40 mm. Opmerking: In plaats van een sproeier van matrix, een artistieke airbrush kan worden gebruikt om toe te passen van vloeibare matrix. Dezelfde matrix oplossing kan worden gebruikt om te spuiten, maar ongeveer tweemaal zoveel oplossing is vereist. Spuiten met de dia geklemd zodat deze verticaal hangt, de dia van een 90° hoek van ongeveer één voet weg (aangepast van Hoffmann15) tot de matrix laag is zichtbaar.</li>
	<li>Voeg 1 µL van kalibrant (fosfor rood voor doelen < 500 Da, een peptide-mengsel (Zie Tabel of Materials) voor doelstellingen < 5.000 Da) aan heldere vlek op dia. Fosfor Red vereist geen mengen met matrix, maar het mengsel peptide vereist 1:1-mengsel met matrix op de steun van ionisatie. Wachten op kalibrant om te drogen.</li>
	<li>Tekenen van een X in elke hoek van de dia met behulp van een permanent marker en een optische beeld met behulp van een camera of een scanner op 1.200 dpi nemen.</li>
</ol>5. beeldvorming massaspectrometrie Data-acquisitie
<ol><li>Openen van een nieuwe reeks op de analysesoftware van de IMS-gegevens (Zie Tabel van materialen). Stel de breedte van het raster op gewenste ruimtelijke resolutie, ten minste 50 µm.</li>
	<li>Upload het optische beeld van de dia naar de analysesoftware en set drie leren punten met behulp van de snijpunten in de X'en getekend in elke hoek.</li>
	<li>Aanwijzen van de regio's van belang voor beeldvorming in de acquisitie software en dienovereenkomstig een naam geven.</li>
	<li>Kalibreren van het instrument met behulp van de data-acquisitie software (Zie Tabel van materialen) binnen 5 ppm fout.</li>
	<li>Sla de geoptimaliseerde methode en run beginnen. Dit experiment geoptimaliseerd de volgende parameters: polariteit = positief, Detector = Reflectron, Laser grootte = 2, Laser macht = 50%, Reflector modus detector winst = 3 x.</li>
</ol>6. verwerking van de IMS-gegevens
<ol><li>Import .mis bestand in statistische software (Zie Tabel of Materials) voor analyse van betekenis.</li>
</ol>

<ol><li>Paine, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Reproductive+System+Non-Negative+Matrix+Factorization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+an+Early-Stage+Ovarian+Cancer+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model.</a> PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).</li>
<li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Metabolic+Exchange+with+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li>
<li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+of+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+on+Agar-Based+Microbial+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomic+Profiling+of+Ovarian+Cancer+Cell+Lines+Reveals+Precursor+Cell+Associated+Proteins+and+Functional+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status.</a> Nature Communications. 7, 12645(2016).</li>
<li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Grade+Serous+Ovarian+Carcinomas+Originate+in+the+Fallopian+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube.</a> Nature Communications. 8 (1), (2018).</li>
<li>Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylome+Analyses+Implicate+Fallopian+Tube+Epithelia+as+the+Origin+for+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer.</a> Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).</li>
<li>Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Risk+After+Salpingectomy%3A+A+Nationwide+Population-Based+Study%5BTitle%5D)+AND+%22JNCI+Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study.</a> JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410(2015).</li>
<li>Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+A+Stimulates+Migration+of+the+Fallopian+Tube+Epithelium%2C+an+Origin+of+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer%2C+through+Non-Canonical+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling.</a> Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).</li>
<li>King, S. M., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Progenitor+Cells+of+Ovarian+Cancer%3A+Analysis+of+Current+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models.</a> BMB Reports. 44 (7), 435(2011).</li>
<li>Reznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+Metabolic+Variation+across+Tumor+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types.</a> Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).</li>
<li>Watkins, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Impact+of+Selective+and+Nonselective+Beta-Blockers+on+Survival+in+Patients+with+Ovarian+Cancer%3A+Beta-Blockers+and+Ovarian+Cancer+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival.</a> Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).</li>
<li>Lutgendorf, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-Related+Mediators+Stimulate+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion+by+Two+Ovarian+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines.</a> Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).</li>
<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Hormone-Mediated+Invasion+of+Ovarian+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells.</a> Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).</li>
<li>Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Matrix+Deposition+on+Dried+Agar+for+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+of+Microbial+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).</li>
<li>Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Crosstalk+between+the+Fallopian+Tube+and+the+Ovary+That+Drives+Primary+Metastasis+of+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).</li>
<li>Armaiz-Pena, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Activation+by+%CE%B2-Adrenoreceptors+Is+a+Key+Switch+for+Tumour+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis.</a> Nature Communications. 4, 1403(2013).</li>
<li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTERT+Mediates+Norepinephrine-Induced+Slug+Expression+and+Ovarian+Cancer+Aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness.</a> Oncogene. 34 (26), 3402(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Er is een groeiend lichaam van bewijsmateriaal dat noradrenaline de rol in HGSOC12,17,18 impliceert, en deze techniek meer mechanistische informatie heeft bijgedragen. Met ten minste acht biologische omstandigheden aanwezig op dezelfde dia, kan de methode goed zijn voor biologische besturingselementen zoals gen, evenals cel specificiteit en controles van de media in een enkele IMS uitvoeren. Terwijl de methode is geoptimaliseerd...

Imaging massaspectrometrie (IMS) is geoptimaliseerd voor het karakteriseren van de ruimtelijke spreiding van moleculaire kenmerken in drie veelgebruikte toepassingen: weefsel segmenten, spheroïden en microbiële kolonies1,2,3. Weefsel segmenten kunnen worden gebruikt om te evalueren van de lokalisatie van metabolieten in de context van biologische omstandigheden in een host, ofwel gerichte of een ongerichte binnen een specifieke waaier van de massa. Verschillen tussen moleculaire functies zijn echter de meest belangrijke en duidelijk wanneer een gezond weefsel wordt vergeleken met een zieke aandoening, bijvoorbeeld een tumor. Deze IMS-benadering is vooral aangepast aan opsporing van ziekte biomarkers, echter het verwerven van weefselmonsters in discrete stadia in de progressie van de ziekte (zoals tumor rangen) zich verzet tegen de identificatie van signalen die belangrijk voor de inleiding van zijn kunnen de ziekte. De uitwisseling van informatie door de ruimte is een alomtegenwoordige functie van veel biologische systemen, en weefsel segmenten kunnen niet vangen dit dynamische chemische estafette. Een techniek die kan visualiseren van chemische uitwisseling en verspreiding is IMS van microbiële kolonies geteeld op agar platen; kleine moleculen kunnen te verspreiden door en over de agar en via laser matrix-bijgewoonde (MALDI-TOF) desorptie/ionisatie massaspectrometrie4kunnen worden vastgelegd. Deze groei setup kan worden gebruikt voor het identificeren van moleculen uitgewisseld tussen discrete biologische entiteiten (kolonies) en gerichtheid van de metaboliet productie ook kunt bepalen. Het platform oorspronkelijk ontworpen voor microbiële kolonie groei werd aangepast aan het verkennen van het primaire metabolisme van weefsel explantaten gegroeid met zoogdiercellen en IMS werd gebruikt voor het evalueren van de dynamische chemische uitwisseling in een in vitro zoogdieren systeem.
In de afgelopen jaren, duidelijk geworden dat hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC) vaak in de eileider epitheel (VTE ontspringt) en klik vervolgens metastasizes naar het vruchtbeginsel tijdens de vroege ziekte ontwikkeling5,6, 7 , 8. de reden dat tumorigene FTE verspreiding naar de eierstok cellen, waar grote tumoren uiteindelijk vormen en verder metastaseren, is nog onduidelijk. Eerder onderzoek heeft zich gericht op de rol van ovariële eiwitten in primaire metastase aan de eierstokken; echter, onlangs is gebleken dat de overgang van een gezonde naar een tumorigene weefsel in massale verstoring van cellulaire metabolisme resulteert en verandert van de productie van kleine molecules9,10,11. Dus veronderstelde we dat kleine moleculen die worden uitgewisseld tussen de FTE en de eierstok medeverantwoordelijk voor primaire metastase van HGSOC kunnen worden.
Met onze nieuw ontwikkelde IMS-procedure, hebben wij vastgesteld dat coculture van tumorigene FTE en gezonde eierstokweefsel de productie van noradrenaline uit de eierstok induceert. Andere celtypes of normale FTE cellen deed dit effect echter niet uitlokken. Een buitengewone voordeel van deze methode is dat de moleculaire productie en een uitwisseling van signalen waarmee echte moleculen kunnen worden gevisualiseerd, dus zelfs in een coculture is het mogelijk om de bron van een signaal te bepalen. Dit is een voordeel ten opzichte van de analyse van monsters van gehomogeniseerde, waar alle ruimtelijke informatie verloren gaat. In ons modelsysteem konden we duidelijk de productie van noradrenaline toewijzen in de eierstok. Noradrenaline is gekoppeld aan de metastase en chemoresistance van ovariële kanker, en onze opsporing van dit molecuul heeft gevalideerd, dat de nieuwe IMS-methode biologisch relevante moleculen12,13, ontdekken kan 14. deze validatie laat ons voorstellen dat deze nieuwe toepassing van IMS bijzonder nuttig zijn kan om onderzoeksgroepen die probeert om te identificeren van kleine molecules in coculture omgevingen en om te begrijpen van de vroege gebeurtenissen die van invloed zijn Celtransformatie en metastase. Het algemene doel van deze methode is het ophelderen van de identiteit en de ruimtelijke spreiding van de kleine moleculen tijdens uitwisseling tussen weefsels en organen, vertegenwoordigd door in vitro 3D celculturen of ex vivo weefsel.

<table><tbody><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Denville</td><td>C1017-O</td><td>Om cellen te verzamelen</td></tr><tr><td>8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber)</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0816</td><td>Hergebruikt vanuit Millipore Millicell EZ-slide kamerslide</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998-4L</td><td>Solvent voor gespoten matrix</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha;MEM)</td><td>Fisher</td><td>10-022-CV</td><td>Celcultuur media</td></tr><tr><td>Autoflex speed MALDI-TOF LRF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Voor IMS data-analyse</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Om cellen te verzamelen en supernatant te verwijderen</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201344</td><td>Matrix gespoten op droge slide</td></tr><tr><td>DHB Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201346</td><td>Matrix gespoten op droge slide</td></tr><tr><td>Disposable Scalpels</td><td>Fisher</td><td>22-079-707</td><td>Voor het verwijderen van de eierstokken</td></tr><tr><td>Dissecting Scissors</td><td>Fisher</td><td>13-804-6</td><td>Voor het verwijderen van de eierstokken</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Media gemengd met agarose</td></tr><tr><td>epidermal growth factor</td><td>Peprotech Inc.</td><td>100-15</td><td>Celcultuur media supplement</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-282</td><td>Voor agarose aliquots</td></tr><tr><td>Estradiol-17&beta;</td><td>Simga-Aldrich</td><td>E2758</td><td>Celcultuur media supplement</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Denville</td><td>fb5001</td><td>Celcultuur media supplement</td></tr><tr><td>FlexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS dataverzameling software</td></tr><tr><td>FlexImaging 4.1</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS data-analyse software</td></tr><tr><td>Forceps (fine)</td><td>Fsiher</td><td>22-327379</td><td>Voor het verwijderen van de eierstokken</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Cellgro</td><td>30-005-CR</td><td>Celcultuur media supplement</td></tr><tr><td>Insulin, Transferrin, Selenium (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>Celcultuur media supplement</td></tr><tr><td>ITO-coated slide</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Platform voor co-cultuur incubatie</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td>Media gebruikt tijdens weefseldissectie</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Celcultuur media supplement</td></tr><tr><td>Low-melting agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Gemengd met media voor plateren</td></tr><tr><td>Media basin</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Gebruikt om plastic verdelers voor verdeelde kamers te snijden</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Celcultuur media supplement</td></tr><tr><td>Peptide Calibration Standard</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8206195</td><td>Calibrant voor medium massabereik</td></tr><tr><td>Phophorus red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343-242-5G</td><td>Calibrant voor laag massabereik</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 2015</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS data statistische analyse</td></tr><tr><td>Surgical Forceps (blunt)</td><td>Fisher</td><td>08-875-8B</td><td>Voor het verwijderen van de eierstokken</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Technologies</td><td>A116-50</td><td>Toegevoegd aan matrixoplossing</td></tr><tr><td>TM Sprayer</td><td>HTX Technologies</td><td></td><td>Voor het aanbrengen van matrix</td></tr></tbody></table>

vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van imaging massaspectrometrie

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Imaging massaspectrometrie (IMS) is routinematig toegepast op drie soorten monsters: weefselsecties, spheroïden en microbiële kolonies. Deze types van monster hebben zijn geanalyseerd met behulp van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) te visualiseren van de verdeling van eiwitten, lipiden en metabolieten in de biologische steekproef van belang. We hebben een nieuwe steekproef voorbereiding methode die de sterke punten van de drie vorige toepassingen aan te pakken een underexplored benadering combineert voor de identificatie van chemische communicatie bij kanker, door het zaaien van zoogdiercellen culturen in agarose in ontwikkeld coculture met gezonde weefsels gevolgd door uitdroging van het monster. Zoogdieren weefsels en cellen zijn cocultured in de nabijheid waardoor chemische communicatie via verspreiding tussen de weefsels en cellen. Op specifieke tijdstippen, wordt het monster agarose gebaseerde gedroogd op dezelfde wijze als microbiële kolonies IMS analyse voorbereid. Onze methode is ontwikkeld om de communicatie tussen hoogwaardige sereuze eierstokkanker afgeleid van de eileider, zoals deze met het ovarium tijdens metastase samenwerkt model. Optimalisatie van de bereiding van de monsters resulteerde in de identificatie van noradrenaline als een belangrijke chemische component in de eierstokken communicatie. Deze nieuw ontwikkelde methode kan worden toegepast op andere biologische systemen die een goed begrip van chemische communicatie tussen aangrenzende cellen of weefsels vereisen.

Een optimaal gedroogde ITO dia zal resulteren in een platte gedroogde monster met minimale tot geen rimpels over het oppervlak van het agarose en agarose stukken die handhaven van ruimtelijke scheiding op de dia (Figuur 3). Figuur 3A geeft optimale drogen, terwijl figuur 3B toont de rimpels die moeten worden vermeden. Deze optimalisatie vereist zorgvuldige controle van de dia in de oven, aangezien de...

Een nieuwe methode voor de bereiding van de monsters werd ontwikkeld zodat de cel- en weefseltransplantaties coculture op te sporen klein molecuul uitwisseling met behulp van spectrometrie van de massa van de beeldvorming.

Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Ons protocol kan de chemische communicatie van kleine moleculen tussen cellen en weefsels in kaart brengen, en we hebben dit specifiek toegepast om kleine moleculen in eierstokkankermetathese te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is het vermogen om kleine moleculen op een labelvrije manier te meten met behoud van de ruimtelijke integriteit van cellen en weefsels in 2D. Deze techniek heeft ons in staat gesteld om de bijdrage van kleine moleculen in eierstokkanker uitzaaiingen te ondervragen op een ongerichte manier.Dit zou kunnen onthullen nieuwe therapeutische doelen en trajecten die eerder over het hoofd zijn gezien. Deze methodologie kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere vormen van kanker die kunnen worden geteeld in agarose en elke andere ziekte waarbij een ruimtelijke component belangrijk kan zijn voor het resulterende cellulaire fenotype. Ervoor zorgen dat alle cellen en componenten in de hand zijn en geduld met het droogproces is essentieel voor dit protocol.Een overhaaste uitdroging stap kan vaak leiden tot slechte kwaliteit massaspectrometrie gegevens. Visuele demonstratie van deze methode is nuttig bij het begrijpen van onze monstervoorbereiding en uitdrogingsstappen, omdat deze sterk afwijken van typische imaging massaspectrometrie-experimenten die weefsels of microben op agar gebruiken. Om te beginnen, vloeibaar de agarose op 70 graden Celsius op een hete plaat.Plaats de acht-goed scheidingswand op de top van de ITO-behandelde dia. Via standaard trypsine behandeling, verzamelen MOE cellen in een 15-milliliter conische buis, centrifuge, en voeg een keer DMEM media te resuspend om een concentratie van 50,000 cellen per 150 microliter te verkrijgen, dat is twee keer de uiteindelijke dichtheid gewenst. Voor onverdeelde coculturen, gebruik tangen om eierstokken explant toe te voegen aan het centrum van de vier putten.Net voor het plating, combineren 200 microliter van cel suspensie en 200 microliter van vloeibaar agarose in individuele twee-milliliter buizen. Vermijd luchtbellen tijdens het pipetten. Voeg onmiddellijk 300 microliter van het cel-agarosemengsel toe aan elke put en breng continue zachte neerwaartse druk op de scheidingslijn aan om ervoor te zorgen dat er geen lekken of mengen tussen putten.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen en de eierstok blijft in het midden van de put. Als de gepipeteerde agarose de eierstok verstoorde, gebruik dan voorzichtig de pipetpunt om deze te centreren voordat de agarose afkoelt. Vervolgens, incubeer de dia op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide in een bevochtigde incubator.Voor verdeelde coculturen, snijd verdelers van dun, glad plastic. De zijkanten van een steriel, wegwerp media bekken worden gebruikt. Snijd ze net breed genoeg om goed te passen in de hypotenuse van de put.Plaats de acht-well verdeler op de top van de ITO-behandelde dia, en steek kunststof verdelers diagonaal in putten. Bereid celculturen zoals eerder gedaan, en combineer 100 microliter van celsuspensie en 100 microliter van vloeibaar gemaakte agarose in een twee-milliliter buis. Onmiddellijk, plaat 150 microliter van cel-agarose mengsel aan de ene kant van de scheidingswand, terwijl de neerwaartse druk op de scheidingslijn.Laat agarose afkoelen en stollen voor ongeveer een minuut, en verwijder vervolgens de scheidingswand. Gebruik tangen om eierstokken in het midden van de lege helft van de put te plaatsen. Voeg 150 microliter van cel-agarose mengsel over de bovenkant van de eierstok.Broed de glijbaan uit op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide in een bevochtigde couveuse. Verwijder na vier dagen de scheidingswand van de agarose van de agarose-stekkers. Los met een platte spatel de zijkanten van de agarose uit de kamer en trek de kamer voorzichtig naar boven.Als er agarose pluggen worden verplaatst, voorzichtig verplaatsen zodat ze elkaar niet aanraken. Plaats de glijbaan ongeveer vier uur in een oven van 37 graden Celsius en draai elk uur 90 graden om een gelijkmatige warmteverdeling in het monster te garanderen. De glijbaan moet volledig worden gedroogd.Anders kan het leiden tot een explosie van het monster in de hoge vacuümomgeving van de MALDI-TOF massaspectrometer. Het drogen van de dia en het monitoren van de voortgang is de meest kritieke stap om een hoge ruimtelijke resolutie en hoogwaardige massaspectra te bereiken. Als er sprake is van schilfering of overmatig rimpeling, raden we af om de massaspectrometriegegevens te verzamelen.Breng met de parameters die op de matrixspuit zijn ingesteld matrixoplossing aan op de dia. Om fosforrood als calibrant te gebruiken, voegt u één microliter fosforrood toe aan een duidelijke plek op de dia. Om het peptidemengsel als calibrant te gebruiken, meng het met matrix op Parafilm in een één-op-één verhouding om ionisatie te helpen, en spot 0.5 aan één microliter op de dia.Wacht tot calibrant droog is voordat de beeldvorming massaspectrometrie gegevens verwerving. Teken een X met een permanente markering in elke hoek van de dia en maak een optisch beeld met een camera of een scanner op 1200 dpi. In dit experiment is zorgvuldige controle van de dia in de oven essentieel om een optimale gedroogde ITO-dia te garanderen, wat resulteert in een plat uitgedroogd monster met minimale tot geen rimpels over het oppervlak van de agarose.Deze figuur toont de rimpels die moeten worden vermeden. Rimpels kunnen de hoogte en dus de massanauwkeurigheid van de beeldvormingsmassaspectrometriesignalen enigszins beïnvloeden. Lichte rimpels hebben geen invloed op de kwaliteit van de gegevens.Een optimaal gelegen weefsel moet zo dicht mogelijk bij het centrum mogelijk zijn. Het gebruikte weefsel moet in het midden van de put zijn als het onverdeeld is of in het midden van de halve driehoek als het is verdeeld, zodat de verwerving van IMS-gegevens niet verontreinigd is met randeffecten. Slecht gepositioneerd weefsel, wanneer afgebeeld, kan resulteren in valse massa signalen van de rand effecten.De gedroogde dia beeld wordt gebruikt om de MALDI-TOF massaspectrometer die regio's te leren om beeld. Kleine gebieden rond het eierstokweefsel werden geselecteerd voor IMS op 50 micrometer. Een representatief beeld van een m-over-z signaal wordt getoond voor onverdeelde coculturen, evenals voor verdeelde kameropstelling.Het belangrijkste om te onthouden is dat de resulterende gegevens zijn slechts zo goed als de monster voorbereiding. Besteed speciale aandacht aan het droogproces. Het meest opwindende aspect is het valideren van de kleine moleculen ontdekt op deze manier met behulp van andere experimenten, zoals invasie testen of kolonisatie testen, om te informeren over de effectieve concentratie en vertalen naar de menselijke biologie.We verwachten dat dit de deur zal openen om nieuwe trajecten van potentiële therapeutische doelen voor eierstokkanker te ontdekken door de processen in de primaire metathese van eierstokkanker beter te begrijpen.

capturing-small-molecule-communication-between-tissues-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie (DESI-MS) is een ambient methode waarbij monsters, met inbegrip van biologische weefsels, kunnen worden afgebeeld met een minimale monstervoorbereiding. Door rastering het monster onder de ionisatie-elektrode, deze spray-gebaseerde techniek voldoende ruimtelijke resolutie om moleculaire kenmerken van belang te onderscheiden binnen coupes.

Beeldvorming van biologische weefsels door desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie

Hier presenteren we protocollen om zowel ambient massaspectrometrie beeldvorming (MSI) van weefsels en in-situ live enkele cel MS (SCMS) analyse uit te voeren met behulp van de enkele sonde, een geminiaturiseerd multifunctioneel apparaat voor MS analyse.

Toepassingen van de single-probe: massaspectrometrie Imaging en Single Cell Analysis onder omgevingsomstandigheden

Een geïntegreerde cel manipulatie platform is ontwikkeld voor gebruik in combinatie met een single-probe massaspectrometrie Setup voor de on-line analyse van individuele schorsing cellen onder omgevingsomstandigheden.

Geïntegreerde cel manipulatie platform in combinatie met de single-probe voor massaspectrometrie analyse van drugs en metabolieten in enkele schorsing cellen

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

In het tijdperk van kankerimmunotherapie is de interesse in het ophelderen van de micro-omgevingsdynamiek van tumoren opvallend toegenomen. Dit protocol beschrijft een massaspectrometrie beeldvormingstechniek met betrekking tot de kleurings- en beeldvormingsstappen, die een zeer gemultiplexte ruimtelijke analyse mogelijk maken.

Uitbreiding van het begrip van de tumormicro-omgeving met behulp van massaspectrometrie Beeldvorming van formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefselmonsters

Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.

Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie

Er is een geavanceerde methode ontwikkeld voor massaspectrometriebeeldvorming (MSI) van hersenorganoïden die het mogelijk maakt om metabolietverdelingen binnen deze modellen in kaart te brengen. Deze technologie biedt inzicht in metabole routes van de hersenen en metabolietsignaturen tijdens de vroege ontwikkeling en bij ziekte, en belooft een beter begrip van de menselijke hersenfunctie.

Moleculaire beeldvorming van organoïden van het menselijk brein met behulp van massaspectrometrie 

Dit protocol schetst het gebruik van microMS voor fluorescentiegeleide, eencellige MALDI-2-massaspectrometrie, waardoor verbeterde moleculaire profilering van primaire neuronale cellen van ratten mogelijk is.

Fluorescentiegeleide matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie met lasergeïnduceerde postionisatiemassaspectrometrie van individuele neurale cellen van ratten

Dit protocol heeft tot doel celmetabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometrie (SCMS) door het wassen van vluchtige zoutoplossingen, het snel afschrikken van vloeibare stikstof, vriesdrogen en opslag van -8 °C te combineren. Het toont aan dat het afschrikken van vloeibare stikstof essentieel is voor het behoud van metabolietprofielen, terwijl langdurige koude opslag tot een minimum moet worden beperkt om metabole veranderingen te voorkomen.

Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

Dit protocol beschrijft enkelcel massaspectrometrie beeldvorming van OVCAR-8-cellen met behulp van desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan Orbitrap-massaspectrometers voor metabolomische analyse met hoge ruimtelijke resolutie.

Single-cell massaspectrometriebeeldvorming met desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan orbitrap-massaspectrometers

Leer hoe je beeldvormende massaspectrometrie gebruikt om kleine moleculen in cel- en weefselcocultuur te detecteren. Deze methode onderzoekt communicatie bij eierstokkankermetastase zonder labels.

Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie

Meer video's verkennen