Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie

Ons protocol kan de chemische communicatie van kleine moleculen tussen cellen en weefsels in kaart brengen, en we hebben dit specifiek toegepast om kleine moleculen in eierstokkankermetathese te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is het vermogen om kleine moleculen op een labelvrije manier te meten met behoud van de ruimtelijke integriteit van cellen en weefsels in 2D. Deze techniek heeft ons in staat gesteld om de bijdrage van kleine moleculen in eierstokkanker uitzaaiingen te ondervragen op een ongerichte manier.

Dit zou kunnen onthullen nieuwe therapeutische doelen en trajecten die eerder over het hoofd zijn gezien. Deze methodologie kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere vormen van kanker die kunnen worden geteeld in agarose en elke andere ziekte waarbij een ruimtelijke component belangrijk kan zijn voor het resulterende cellulaire fenotype. Ervoor zorgen dat alle cellen en componenten in de hand zijn en geduld met het droogproces is essentieel voor dit protocol.

Een overhaaste uitdroging stap kan vaak leiden tot slechte kwaliteit massaspectrometrie gegevens. Visuele demonstratie van deze methode is nuttig bij het begrijpen van onze monstervoorbereiding en uitdrogingsstappen, omdat deze sterk afwijken van typische imaging massaspectrometrie-experimenten die weefsels of microben op agar gebruiken. Om te beginnen, vloeibaar de agarose op 70 graden Celsius op een hete plaat.

Plaats de acht-goed scheidingswand op de top van de ITO-behandelde dia. Via standaard trypsine behandeling, verzamelen MOE cellen in een 15-milliliter conische buis, centrifuge, en voeg een keer DMEM media te resuspend om een concentratie van 50,000 cellen per 150 microliter te verkrijgen, dat is twee keer de uiteindelijke dichtheid gewenst. Voor onverdeelde coculturen, gebruik tangen om eierstokken explant toe te voegen aan het centrum van de vier putten.

Net voor het plating, combineren 200 microliter van cel suspensie en 200 microliter van vloeibaar agarose in individuele twee-milliliter buizen. Vermijd luchtbellen tijdens het pipetten. Voeg onmiddellijk 300 microliter van het cel-agarosemengsel toe aan elke put en breng continue zachte neerwaartse druk op de scheidingslijn aan om ervoor te zorgen dat er geen lekken of mengen tussen putten.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen en de eierstok blijft in het midden van de put. Als de gepipeteerde agarose de eierstok verstoorde, gebruik dan voorzichtig de pipetpunt om deze te centreren voordat de agarose afkoelt. Vervolgens, incubeer de dia op 37 graden Celsius en 5%kooldioxide in een bevochtigde incubator.

Voor verdeelde coculturen, snijd verdelers van dun, glad plastic. De zijkanten van een steriel, wegwerp media bekken worden gebruikt. Snijd ze net breed genoeg om goed te passen in de hypotenuse van de put.

Plaats de acht-well verdeler op de top van de ITO-behandelde dia, en steek kunststof verdelers diagonaal in putten. Bereid celculturen zoals eerder gedaan, en combineer 100 microliter van celsuspensie en 100 microliter van vloeibaar gemaakte agarose in een twee-milliliter buis. Onmiddellijk, plaat 150 microliter van cel-agarose mengsel aan de ene kant van de scheidingswand, terwijl de neerwaartse druk op de scheidingslijn.

Laat agarose afkoelen en stollen voor ongeveer een minuut, en verwijder vervolgens de scheidingswand. Gebruik tangen om eierstokken in het midden van de lege helft van de put te plaatsen. Voeg 150 microliter van cel-agarose mengsel over de bovenkant van de eierstok.

Broed de glijbaan uit op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide in een bevochtigde couveuse. Verwijder na vier dagen de scheidingswand van de agarose van de agarose-stekkers. Los met een platte spatel de zijkanten van de agarose uit de kamer en trek de kamer voorzichtig naar boven.

Als er agarose pluggen worden verplaatst, voorzichtig verplaatsen zodat ze elkaar niet aanraken. Plaats de glijbaan ongeveer vier uur in een oven van 37 graden Celsius en draai elk uur 90 graden om een gelijkmatige warmteverdeling in het monster te garanderen. De glijbaan moet volledig worden gedroogd.

Anders kan het leiden tot een explosie van het monster in de hoge vacuümomgeving van de MALDI-TOF massaspectrometer. Het drogen van de dia en het monitoren van de voortgang is de meest kritieke stap om een hoge ruimtelijke resolutie en hoogwaardige massaspectra te bereiken. Als er sprake is van schilfering of overmatig rimpeling, raden we af om de massaspectrometriegegevens te verzamelen.

Breng met de parameters die op de matrixspuit zijn ingesteld matrixoplossing aan op de dia. Om fosforrood als calibrant te gebruiken, voegt u één microliter fosforrood toe aan een duidelijke plek op de dia. Om het peptidemengsel als calibrant te gebruiken, meng het met matrix op Parafilm in een één-op-één verhouding om ionisatie te helpen, en spot 0.5 aan één microliter op de dia.

Wacht tot calibrant droog is voordat de beeldvorming massaspectrometrie gegevens verwerving. Teken een X met een permanente markering in elke hoek van de dia en maak een optisch beeld met een camera of een scanner op 1200 dpi. In dit experiment is zorgvuldige controle van de dia in de oven essentieel om een optimale gedroogde ITO-dia te garanderen, wat resulteert in een plat uitgedroogd monster met minimale tot geen rimpels over het oppervlak van de agarose.

Deze figuur toont de rimpels die moeten worden vermeden. Rimpels kunnen de hoogte en dus de massanauwkeurigheid van de beeldvormingsmassaspectrometriesignalen enigszins beïnvloeden. Lichte rimpels hebben geen invloed op de kwaliteit van de gegevens.

Een optimaal gelegen weefsel moet zo dicht mogelijk bij het centrum mogelijk zijn. Het gebruikte weefsel moet in het midden van de put zijn als het onverdeeld is of in het midden van de halve driehoek als het is verdeeld, zodat de verwerving van IMS-gegevens niet verontreinigd is met randeffecten. Slecht gepositioneerd weefsel, wanneer afgebeeld, kan resulteren in valse massa signalen van de rand effecten.

De gedroogde dia beeld wordt gebruikt om de MALDI-TOF massaspectrometer die regio's te leren om beeld. Kleine gebieden rond het eierstokweefsel werden geselecteerd voor IMS op 50 micrometer. Een representatief beeld van een m-over-z signaal wordt getoond voor onverdeelde coculturen, evenals voor verdeelde kameropstelling.

Het belangrijkste om te onthouden is dat de resulterende gegevens zijn slechts zo goed als de monster voorbereiding. Besteed speciale aandacht aan het droogproces. Het meest opwindende aspect is het valideren van de kleine moleculen ontdekt op deze manier met behulp van andere experimenten, zoals invasie testen of kolonisatie testen, om te informeren over de effectieve concentratie en vertalen naar de menselijke biologie.

We verwachten dat dit de deur zal openen om nieuwe trajecten van potentiële therapeutische doelen voor eierstokkanker te ontdekken door de processen in de primaire metathese van eierstokkanker beter te begrijpen.