Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Hallo, ik ben Bin Ren, ik ben universitair hoofddocent chirurgie en biomedische techniek aan de Universiteit van Alabama de Birmingham School of Medicine. Ons laboratorium is geïnteresseerd in endotheelcelbiologie functie angiogenese acuogenese in de context van deze veel voorkomende hart-en vaatziekten en kankers. Een van onze onderzoeken richt zich op epigenetische en transcriptieregulatie van endotheelceltransdifferentiatie en angiogenese.

Om de transcriptiemechanismen van angiogenese te begrijpen, hebben we transgene gemanipuleerde muislijnen vastgesteld, waarin we niet alleen een specifieke genen hebben verwijderd die geassocieerd zijn met angiogenese in de endotheelcellen, maar een verbeterde GFP-sonde zal genetisch worden getagd op een ribosoom van inheemse endotheelcellen. Op deze manier kunnen we lussen van geassocieerd boodschapperRNA isoleren en zuiveren uit endotheelcellen in verschillende weefselorganen direct bij transgene dieren. We kunnen dan gebruik maken van de gezuiverde messenger RNA voor downstream-analyse van transcripties en de transcriptome.

Door RNA sequencing en de real-time chill PCR. In deze video, mijn studenten Patrick Moran en Jordan Palmer en de onderzoekers Nicholas Barnekow en Rong Yuan zal u een aanpak genotyping transgene muizen en de aspirating messenger RNA rechtstreeks van de endotheel in de transgene dieren. Genotypering is een belangrijke voorlopige in dit protocol om ervoor te zorgen dat het ijs de GFP-tag op de ribosomen van endotheelcellen heeft.

Aangezien alle downstream RNAi isolatiestappen afhankelijk zijn van de aanwezigheid van GFP-gelabelde ribosomen, is het essentieel om het genotype te bepalen voordat het experiment begint. Voordat met de RNA-isolatie wordt begonnen, moeten verschillende voorbereidende stappen worden voltooid. Deze omvatten bufferpreparaatatie en het binden van het anti-GFP-antilichaam aan het eiwit G dina kralen.

De buffers kunnen duren tot een maand bij vier graden Celsius en de antilichaam-gebonden kralen kunnen duren tot een week op vier graden Celsius. Houd dus rekening met deze beperkingen bij het schaven van uw experiment. Het gebruik van een molaire gedreven homogenisator is een uitstekende manier om de RNA-opbrengst te verhogen.

Zorg ervoor dat u lagere frequentie-instellingen en -duur gebruikt om de afbraak van RNA te verminderen. Zoals eerder vermeld, is genotyping een belangrijke eerste stap in het proefprotocol. Ervoor te zorgen dat muizen waarvan het RNA moet worden geïsoleerd met behulp van de TRAP-techniek positief zijn voor het TRAP-gen, althans heterozygooten, maar idealiter homozygoot voor het TRAP-gen is een belangrijke stap, omdat ervoor te zorgen dat de GFP-tag op het ribosoom is, essentieel is om naar beneden te trekken met behulp van de antigeenantilichaamreactie en de anti-GFP-kralen die u vóór het begin van het experiment hebt voorbereid.

Isoleer de gewenste weefsels van de muis en plaats deze onmiddellijk in een ijskoude PBS met 100 microgram per milliliter cyclohexamideoplossing. Dit zorgt ervoor dat de vertaling wordt gestopt en dat het transcriptoom een nauwkeurige weergave van de muis zal zijn voorafgaand aan de euthanasie. Gebruik een motoraangedreven homogenisator om het weefsel te homogeniseren in een celsuspensie.

Ideale timing en frequentie-instellingen zullen moeten worden bepaald door het individuele lab op basis van de specifieke motor aangedreven homogenizer die u zult gebruiken. Het gebruik van een te hoge frequentie-instelling kan leiden tot RNA-afbraak en de rest van het protocol verstoren. Hang de celpellet op in de lysebuffer die u voor het begin van het experiment had moeten voorbereiden.

Zorg ervoor dat u dit mengsel verder homogeniseert om een adequate homogenisatie te garanderen voordat u verder gaat met de rest van het protocol. Centrifugeer het homogenaat gedurende 10 minuten bij 2.000 keer G in een centrifuge van vier graden Celsius. Dit zal pellet de kernen en grote cellulaire puin die kunnen interfereren met de downstream immunoprecipitatie reactie.

Voeg DHPC en CA-630 lipiden toe aan de supernatant van de voorafgaande centrifugalisatiestap. Deze lipiden zullen helpen scheiden van de eiwitfasen uit de andere intracellulaire componenten. Plaats de suspensie vijf minuten op ijs en laat hem zitten.

Centrifugeer het lysaat gedurende 10 minuten bij 13.000 keer G om oplosbaar materiaal te pelleteren. Houd 15% van de duidelijke lysate voor toekomstige stappen. Voeg de anti-GFP-antilichaamgebonden kralen toe aan het cellysaat supernatant en broed het mengsel op vier graden Celsius met end over end rotatie gedurende 30 minuten.

Dit is waar de anti-GFP antilichamen de GFP gelabelde ribosomen zullen binden, waardoor we het RNA verder kunnen isoleren van deze ribosomen. Verzamel de kralen op je magnetische rek en was de kralen vijf keer met behulp van uw hoge zout polysome wassen buffer die u zal hebben voorbereid voorafgaand aan het begin van de isolatie. Ga onmiddellijk naar de volgende stap waarin u de kralen in de RLT-buffer plaatst.

Centrifugeer het lysaat gedurende drie minuten op volle snelheid en verwijder voorzichtig de supernatant en breng het naar een nieuwe microfugebuis. Voeg een volume van 70% ethanol toe aan het gerooide lysaat en meng onmiddellijk door pipetting. Ga onmiddellijk naar de volgende stap waarin u tot 700 microliter van het monster, inclusief eventuele neerslag die zich heeft gevormd, overzet naar een spinkolom die in een twee milliliter opvangbuis is geplaatst.

Centrifugeer het lysaat gedurende 15 seconden bij meer dan 8.000 keer G om het spinkolommembraan te wassen. Gooi de stroom door en ga naar de volgende stap. Voeg 350 microliters buffer RW1 toe aan de draaikolom.

Centrifuge gedurende 15 seconden bij meer dan 8.000 keer G om het spinkolommembraan te wassen en de stroom erdoor weg te gooien. Herhaal deze stap met behulp van nog eens 350 microliters van buffer RW1 voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 500 microliters buffer RPE toe aan de spinkolom.

Centrifuge gedurende 15 seconden bij meer dan 8.000 keer G om het spinkolommembraan te wassen. Gooi de stroom door en ga verder om deze stap te herhalen door nog eens 500 microliters buffer RPE toe te voegen aan de spinkolom. Deze keer, centrifuge gedurende twee minuten op meer dan 8.000 keer G om de spin kolom membraan te wassen.

Gooi de stroom door en plaats de spin kolom in een nieuwe twee milliliter collectie buis en ga naar centrifuge op volle snelheid voor een minuut om eventuele resterende buffer die aanwezig kan zijn op de spin kolom te verwijderen. Gooi de stroom door en plaats de spinkolom in een nieuwe 1,5 milliliter opvangbuis. Ga verder met het toevoegen van 30 tot 50 microliter RNase vrij water rechtstreeks aan de spin kolom membraan.

Centrifugeren gedurende een minuut op meer dan 8.000 keer G om het RNA uit het spinkolommembraan te halen. Op dit punt wordt uw RNA opgelost in RNase vrij water en kan worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius voor maximaal een jaar. Ga verder met het kwantificeren en controleren van de zuiverheid van het RNA dat u hebt geïsoleerd met behulp van een spectrofotometer.

U bent op zoek naar een piek op 260 nanometer, dat is nucleïnezuur, inclusief RNA, absorbeert maximaal. De hoeveelheid wordt in het rechterondergedeelte van het beeld weergegeven in nanogrammen per microliter. Kwaliteit kan worden afgeleid door de 260 230 verhouding die wordt weergegeven een item boven de hoeveelheid in de rechterbenedenpost gedeelte van het scherm.

Onze aanpak toonde lage RNA-opbrengsten, vooral wanneer we mRNA gezuiverd uit de hartweefsels of uit eerder bevroren weefsels. We moeten dus de voorwaarden om de opbrengsten te verhogen, aanstoomen. We hebben echter in EG-specifieke CD-36-tekorten muizen waargenomen, het niveau van ephrin B2 en DLL4 werden aanzienlijk verhoogd in zowel long- als hart-endothelia, in vergelijking met de controle.

Deze resultaten kwamen overeen met onze vorige in vitro studies, wat suggereert dat de RNA-kwaliteit voldoende is voor downstream-analyse. De opbrengst was laag door de strenge voorwaarden in onze werkruimte. Om deze beperking te overwinnen, is het van cruciaal belang om een RNase-vrije werkzone op te zetten en werkoppervlakken en apparatuur te ontsmetten die besmet kunnen raken met RNase en regelmatig van handschoen kunnen wisselen om RNA van hoge kwaliteit te extraheren en de opbrengsten te verhogen.

Het is ook van cruciaal belang om geschikte concentraties GFP-antilichamen in de affiniteitsmatrix te vinden en geschikte concentraties RNase-remmer in de weefsellysebuffer te gebruiken en RNase-vrije plastic waren en reagentia te gebruiken voor RNA-extractie uit endotheelribbelosomen van de beoogde weefsels.